用于细胞培养孔板的方法和装置与流程

用于细胞培养孔板的方法和装置
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月30日提交的第62/928,121号美国临时专利申请的权益，所述申请的全部内容通过引用方式并入本文中。
技术领域
3.本发明总体涉及用于细胞体外培养的方法、装置和系统。更具体地，本发明涉及新颖的多孔板和集中器掩模。本发明还涉及使用所述多孔板和集中器掩模进行细胞接种和细胞测定。


背景技术：

4.多孔板广泛用于并行和/或同时对细胞进行测量，并且从供应商(例如agilent technologies、sigma-aldrich、thomas scientific等)处可以购得各种孔规格的多孔板。用于组织培养的多孔板有6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔和1536孔的规格，涂覆的和非涂覆的板分别可用于贴壁细胞培养和悬浮培养。
5.多孔板通常用于对细胞群进行测量。通常，当将细胞接种到细胞培养孔板的孔内时，将细胞水溶液移入孔内，并且细胞沉降而覆盖孔的底部。通常将接种的孔板放入孵育器中以促进细胞生长和扩增。这导致细胞覆盖孔的整个底面。然而，将细胞接种在孔的整个底面上会带来一些挑战，其中许多挑战是由于与许多体外细胞测定相关的空间敏感性。
6.因此，通常希望将培养的细胞集中到孔的中心以避免空间偏差，包括但不限于由于热不均匀性引起的细胞接种偏差，这与光学测定灵敏度和边缘引起的细胞生物学效应有关。
7.对于具有光学读数的测定，从孔外围区域进行光转导的效率通常比从孔中心进行光转导的效率低。这是由于孔侧壁附近的光接入减少。此外，在检测器的视场的边缘处，照明和/或数据收集效率受到阻碍。
8.在一些情况下，采用板读取器策略来产生均匀的照明，并便于从整个孔中均匀地捕获数据。然而，这种策略既耗时又低效。其他板读取器策略仅从孔的中心进行测量，以避免光学转导不良的区域，但是这种方法可能会忽略在孔中心之外生长的细胞的相关数据。
9.另外，当将细胞接种到孔板中时，孔板的外周边上的孔中的细胞的生长和表现与不在板周边上的孔中的细胞可能不同。这种现象通常被称为“边缘效应”。这种边缘效应很显著，因此，通常的做法是不将细胞接种到多孔板上的周边孔中。不受理论的束缚，边缘效应被认为是由于将板放置在孵育器中时，板的周边的孔中培养基的加热差异所致。例如，响应于热梯度，细胞倾向于聚集在孔侧壁处。对于孔板周边的孔，热梯度更为严重，导致向孔侧壁不成比例的细胞增殖。当使用光学测定技术分析表现出边缘效应的细胞时，可能会导致孔和孔间的变异性增加。一些孔板包含类似护城河的沟槽，用户用培养基填充沟槽，以减轻边缘效应。培养基被认为是可作为周边孔的热和湿度缓冲区。
10.在本领域中仍然强烈需要用于在多孔板中培养细胞的装置、方法和系统，所述装
置、方法和系统解决与细胞生长在孔的侧壁附近以及与这种细胞的光学检测相关的物理和生物学挑战。


技术实现要素：

11.结合所附权利要求，从下面的详细描述中，本发明的方法和装置的这些和其他特征和优点将是显而易见的。
12.在一个方面，本发明的技术涉及一种用于液体培养基中的细胞群的多孔板。所述多孔板包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；多个孔，每个孔具有开放端、与所述开放端相对的封闭端以及位于所述开放端和所述封闭端之间的至少一个壁；其中，每个所述孔的所述开放端被所述框架表面包围；其中，所述封闭端包括在所述至少一个壁之间并且接触所述至少一个壁的孔表面；以及在一个或多个所述孔的所述封闭端的所述孔表面上的至少一个连续环。可以设想，所述连续环可以是任何形状，只要所述形状包括在所述孔的封闭端上的连续边界即可。在一些实施方案中，连续环是圆形、椭圆形或包括圆形边界边缘的其他形状。在其他实施方案中，连续环可以是正方形、矩形、三角形或其他几何形状。在某些实施方案中，所述至少一个连续环被配置为在所述孔表面上限定至少一个细胞接种区域。细胞接种区域的形状由连续环的形状定义，并且可以设想为任何形状，只要它包括连续边界即可。在一些实施方案中，所述多孔板包括一个以上的连续环，所述一个以上的连续环被配置为限定一个以上的细胞接种区域。
13.在另一方面，本发明涉及一种用于将液体培养基中的细胞接种到多孔板中的集中器掩模。所述集中器掩模包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；从所述框架表面延伸出的多个漏斗，每个漏斗具有第一开放端和第二开放端；其中，所述第一开放端连接到所述框架表面并且具有比所述第二开放端更大的直径。
14.本发明技术的其他方面涉及在培养孔的中心部分接种细胞的方法。所述方法包括：将包含细胞的液体培养基移液到所述至少一个细胞接种区域中，所述至少一个细胞接种区域由每个孔的封闭端的表面上的至少一个连续环限定。
15.本发明技术的其他方面涉及一种细胞接种系统，其包括多孔板和集中器掩模。所述多孔板包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；多个孔，每个孔具有开放端、与所述开放端相对的封闭端以及位于所述开放端和所述封闭端之间的至少一个壁。每个所述孔的所述开放端被所述框架表面包围；其中，所述封闭端包括在所述壁之间并且接触所述壁的孔表面；以及在一个或多个所述孔的所述封闭端的所述孔表面上的至少一个连续环。所述集中器掩模包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；以及从所述框架表面延伸出的多个漏斗。每个漏斗具有第一开放端和第二开放端，并且所述第一开放端连接到所述框架表面并且具有比所述第二开放端更大的直径。当所述集中器掩模的所述漏斗被插入到所述多个孔中时，所述集中器掩模的所述多个漏斗和所述多孔板形成所述细胞接种系统，使得所述漏斗的所述第二开放端与每个孔的所述封闭端的所述孔表面上的所述连续环接触。
16.本发明技术的其他方面涉及通过将包含细胞的液体培养基移液到细胞接种系统的漏斗的第一开放端中以在多孔板上的孔的中心接种细胞的方法，并且所述细胞沉积到由所述至少一个连续环在所述孔表面上限定的区域中。
附图说明
17.图1a是示出了在孔的内底表面上具有包括连续环的孔的多孔板的横截面的剖视图。
18.图1b是图1a的放大视图，示出了具有孔的多孔板，所述孔包括在孔的内底表面上的连续环。
19.图2a是用于将细胞接种到多孔板中的集中器掩模的示意图。
20.图2b是图2a的剖视图，示出了用于将细胞接种到多孔板中的集中器掩模的横截面。
21.图3是细胞接种系统的剖视图，该系统包括插入到具有孔的多孔板中的集中器掩模，所述孔包括在孔的内底表面上的连续环。
22.图4是96孔板的示意图，所述孔板具有在孔的内底表面上包括连续环的孔。
23.当结合附图阅读时，从以下详细描述中可以最好地理解本教导。这些特征不一定是按比例绘制的。在实际的情况下，相同的附图标记指代相同的特征。
具体实施方式
24.应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在是限制性的。所限定的术语是在本教导的技术领域中通常理解和接受的所限定的术语的技术和科学意义之外。
25.定义
26.如本文所使用的，除了其普通含义之外，术语“基本”或“基本上”意味着在本领域普通技术人员可接受的极限或程度内。
27.如本文所使用的，术语“大致”和“约”意味着在本领域普通技术人员可接受的极限或量内。术语“约”通常是指所指数字的正负15％。例如，“约10”可以指示8.5到11.5的范围。例如，“大致相同”意味着本领域普通技术人员认为项目在比较后是相同的。在本公开文本中，数值范围包括限定范围的数字。
28.在描述各种实施方案之前，应当理解，本公开文本的教导不限于所描述的特定实施方案，并且因此当然可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本教导的范围将仅由所附权利要求限定。
29.除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可用于本教导的实践或测试中，但现在描述一些示例性方法和材料。本文提及的所有专利和公开通过引用明确地结合。
30.如说明书和所附权利要求中所使用的，术语“一”、“一个”和“所述”包括单数和复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“一个孔”包括一个孔和多个孔。
31.具有有连续环的孔的多孔板
32.在至少一个实施方案中，本发明技术涉及在细胞培养或测定孔板中模制到每个孔的底部的连续环。连续环在孔底形成中央细胞接种区域。当细胞被接种到环的中心时，环充当物理屏障，将细胞约束到孔的中心。这具有以下概述的几个优点。
33.此外，当与某些微孔测定仪器(例如agilent xf仪器)结合使用时，连续环用于限
定测定微室体积，从而能够提高测定灵敏度。例如，在一些实施方案中，孔的连续环与分析仪器对接以形成半密封的、瞬时的、体积减小的微室，在该微室中可以进行代谢测量。
34.在本发明技术的一些实施方案中，将细胞接种到孔的中心，位于由连续环形成的边界内。连续环提供了一个物理屏障，将接种的细胞约束到孔的中心。远离孔侧壁仅在孔的中心接种细胞可以减轻由于孔周边附近的温度差和/或流体差异而导致的光学转导和细胞接种密度梯度造成的影响。由于细胞远离孔侧壁，因此照明差异的影响也被最小化。
35.在其他实施方案中，本发明技术涉及用于在多孔板的孔底上的连续环内接种细胞的方法。在一些实施方案中，将液体培养基中的细胞添加(例如，移液)到由连续环限定的细胞接种区域中。在这些实施方案中，然后可以例如通过孵育来扩增细胞，但是细胞扩增受限于由连续环形成的细胞接种区域。目前描述的多孔板及其使用方法与粘附细胞和悬浮细胞均兼容。在一些其他实施方案中，细胞、组织或类器官可被添加(例如，接种)到由连续环形成的特定区域中。
36.在其他实施方案中，可以将细胞接种在连续环的内部和外部，例如产生不同细胞类型的非接触共培养。在一些实施方案中，所述细胞接种区域包括通过一个或多个连续环限制到细胞接种区域的细胞培养基。在其他实施方案中，所述细胞接种区包括与来自其他细胞接种区的细胞培养基流体连通的细胞培养基。
37.在一些实施方案中，本发明技术的多孔板的孔可以涂覆有促进细胞粘附的物质，以便改善悬浮细胞粘附或促进粘附细胞粘附到孔表面。例如，聚阳离子涂层，例如聚-l-赖氨酸，可用于促进任何细胞类型对孔表面的粘附。在其他实施方案中，可以使用未涂覆的多孔板。
38.在另外的实施方案中，本发明技术涉及制备和维持连续环内部或外部的不同细胞类型的非接触细胞共培养。还可以设想，用于提供非接触共培养的连续环可以是任何形状，只要该形状包括在孔的封闭端上的连续边界即可。在一些实施方案中，用于非接触共培养的连续环是圆形、椭圆形或包括圆形边界边缘的其他形状。在其他实施方案中，用于非接触共培养的连续环可以是正方形、矩形、三角形或其他几何形状。
39.在某些实施方案中，任何形状的至少一个连续环被配置为在所述孔表面上限定至少一个细胞接种区域。在其他实施方案中，多组连续环(例如但不限于同心环)被配置为在孔表面上限定一个以上的细胞接种区域。在其他实施方案中，孔表面上的模制物理屏障可以不是环，而是被配置为提供网格或细胞接种区域的其他构型。
40.当在所述孔表面上存在一个以上的细胞接种区域时，可以设想，每个细胞接种区域可以包含不同的细胞类型、相同的细胞类型、细胞类型的混合物或本领域技术人员所期望的上述的任何组合。在任何情况下，所述细胞接种区域的形状和数量由所述连续环的形状和数量限定，并且被设想为具有任何形状、尺寸和/或构型以向一个或多个细胞接种区域提供一个或多个连续边界。
41.本发明技术的另外的实施方案涉及将所述微孔板与光纤探针结合使用，所述光纤探针诸如在agilent xf仪器中使用的探针。在这些实施方案中，仅在孔的中心的接种细胞使由径向差分光信号转导引起的光信号差异最小化。这既使得测量灵敏度提高，也使得整个孔的信号转导更加均匀。
42.不受理论的束缚，可以预期，受限于孔中心的细胞较少受到在细胞培养工作流程
和测定过程中发生的孔内热梯度的影响。此外，由于细胞被限制在孔的中心，它们保持在光学转导最高的位置，从而允许增加的检测灵敏度和减少可能由接种在孔的周边的细胞引入的测定可变性。
43.在其他实施方案中，包括连续环的孔形成较小的测定微腔室，其使用微孔板读取器(例如，agilent xf仪器或具有对信号转导的径向依赖性或对测定细胞接种面积或测定体积的径向依赖性的其他基于孔的测量测定法)实现较大的测定灵敏度。不受理论的束缚，还可以想到，在由连续环形成的细胞接种区域中接种的细胞将表现出减少的边缘效应，从而允许孔板中的所有孔用于具有改进的孔到孔分析和均匀性的测定。
44.图1a是示出本发明的多孔板101的实施方案的横截面的剖视图，该多孔板具有在孔的内底表面上包括连续环的孔。在该实施方案中，多孔板101由具有框架表面102、框架侧面103和框架基部104的框架限定。该实施方案的框架还包括用于操纵多孔板的框架突片105。多孔板101还包括孔壁106、开放端107和封闭端108。孔的封闭端108还包括限定细胞接种区域110的连续环109。在该实施方案中，多孔板101还包括类似护城河的周边孔板沟槽111，然而在其他实施方案中，本发明技术的多孔板不包括类似护城河的周边孔板沟槽。图1b是图1a的放大图，示出了本发明的多孔板的一个实施方案，该多孔板具有在孔的内底表面上包括连续环的孔。
45.在一些实施方案中，由连续环环绕的细胞接种区域具有孔表面总面积的约10％至约80％的面积。在其他实施方案中，由连续环环绕的细胞接种区域具有孔表面总面积的约55％至约75％的面积。在一些实施方案中，由连续环环绕的细胞接种区域具有孔表面总面积的约60％至约70％的面积。在其他实施方案中，细胞接种区域为孔表面总面积的约65％。在其他实施方案中，细胞接种区域为孔表面总面积的约10％至约25％。
46.在一些实施方案中，连续环具有约0.01mm至约2mm的高度。在其他实施方案中，连续环具有约0.1mm至约0.5mm或约1mm的高度。在其他实施方案中，连续环具有约0.3mm至约0.8mm的高度。在一些实施方案中，连续环具有约0.2mm高的高度。
47.在一些实施方案中，连续环具有约0.5mm至约6.0mm的内径。在其他实施方案中，连续环具有约1.0mm至约5.0mm的内径。在一些实施方案中，连续环具有约3.0mm至约4.0mm的内径。在一些实施方案中，连续环具有约2.0mm的内径。
48.本发明技术的多孔板可以以任何方式或取向配置，包括被配置成具有与标准多孔板的孔数和间距一致的尺寸。例如，在一些实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少8个孔。在其他实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少24个孔。在一些实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少48个孔。在其他实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少96个孔。在其他实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少384个孔。在其他实施方案中，本发明技术的多孔板包括至少1536个孔。
49.用于细胞接种的集中器掩模
50.另一方面，本发明技术提供了一种包括多个漏斗的细胞接种集中器掩模。在一些实施方案中，所述多个漏斗被配置成使得所述漏斗形孔插入件可插入孔板中的孔的条带或网格中。在一些实施方案中，所述细胞接种集中器掩模用于将细胞接种约束到孔中小于所述孔底的区域中。在一些实施方案中，集中器掩模包括框架和从框架延伸的多个漏斗。在其他实施方案中，集中器掩模的漏斗包括第一开放端和第二开放端，其中第一开放端连接到
框架并且具有比漏斗的第二开放端更大的直径。
51.本发明技术的细胞接种集中器掩模使得细胞能够使用标准的移液管和技术被接种到较大孔内的选定区域中。在一些实施方案中，所述细胞接种集中器掩模在孵育期间将所接种的细胞限制到中央孔区域。本发明技术的集中器掩模可用于接种贴壁或悬浮细胞。
52.在一些实施方案中，多孔板的孔可以涂覆有促进细胞粘附的物质，以便改善悬浮细胞粘附或促进贴壁细胞粘附到孔表面。例如，聚阳离子涂层，例如聚-l-赖氨酸，可用于促进任何细胞类型对孔表面的粘附。在其他实施方案中，可以使用未涂覆的多孔板。
53.在一些实施方案中，所述多个漏斗的第二开放端被构造成小于漏斗插入其中的孔的底部。在这些实施方案中，集中器掩模可用于在孔的中心而不是在孔的靠近孔周边壁的边缘上接种细胞。
54.在某些实施方案中，本发明技术涉及这样的方法，其中液体溶液中的细胞被移液到集中器掩模漏斗的第一开放端中，所述集中器掩模漏斗被插入到多孔板的孔中，并且所述细胞被允许沉降。在其他实施方案中，所述多孔板在离心机中旋转，使得所述细胞被旋转到所述孔底部上的粘附涂层上。然后可以将多孔板移动到孵育器中以促进细胞生长和扩增。在一些实施方案中，所述集中器掩模在孵育期间保留在所述孔板中。在其他实施方案中，可以在孵育之前将集中器掩模从孔板上移除。在另外的实施方案中，所述集中器掩模在孵育期间保留在所述孔板中，并且在对所述接种的细胞进行分析之前被移除。
55.在本发明技术的另一个实施方案中，漏斗的第二开放端的远端与孔底形成界面。在一些实施方案中，界面是不透液体的密封，但在其他实施方案中，界面允许但减少液体通过或扩散，例如通过提供间隙。在该实施方案中，将细胞溶液吸到漏斗的第一开放端中，并且该溶液填充在漏斗的第二开放端的内部和外部的孔。不受理论的束缚，可以设想细胞通过重力沉降到孔底，因此，沉积在孔底区域上的细胞数量取决于悬浮在孔底上方的细胞数量。因此，本实施方案的细胞集中器掩模被设计成使得其物理上占据不需要细胞的孔底部区域上方的体积。因此，根据本发明技术的该实施方案的接种细胞的最终结果是在孔的中心以高浓度接种细胞，而在孔的靠近孔壁的外围区域不接种或接种低浓度的细胞。
56.在某些实施方案中，漏斗的第二开放端的外径构造成基本上匹配其插入的孔的内径，使得插入的漏斗通过压缩或干涉固定而保持在适当位置。在一些实施方案中，所述外径被构造成提供与所述孔的内径或其一部分的预定间隙。本发明技术的漏斗可以被配置为插入到任何尺寸的孔中。此外，对于该实施方案，通过漏斗的第二开放端的内径和漏斗如何被构造成插入到多孔板的孔中，确定了其中注入高浓度细胞的区域的大小。
57.在另外的实施方案中，本发明技术提供了一种细胞集中器掩模，其包括具有第二开放端的漏斗，其中所述第二开放端包括远侧弹性体部分。在一些实施方案中，第二开放端的远侧弹性体部分与孔底形成界面，该界面是防液密封。在该实施方案中，可以将细胞悬浮液移入漏斗的第一开放端并移入孔的底部，从而用液体细胞溶液置换漏斗底部的空气。在该实施方案中，细胞悬浮液将仅在漏斗的第二开放端的内径内的孔的底部接种细胞。在该实施方案中，接种的细胞在漏斗插入孔中的情况下沉降到孔底。然后可以将多孔板移动到孵育器中，以促进细胞生长和增殖。在一些实施方案中，所述集中器掩模在孵育期间保留在所述孔板中。在其他实施方案中，可以在孵育之前将集中器掩模从孔板上移除。在另外的实施方案中，所述集中器掩模在孵育期间保留在所述孔板中，并且在对所述接种的细胞进行
分析之前被移除。在本发明技术的具体实施方案中，在孔的中心接种一个区域的集中细胞，而在孔壁边缘附近的孔周边没有细胞。
58.在一些实施方案中，第二开放端的远侧弹性体部分包括柔性密封材料，例如呈o形环形式的弹性的、基本上流体不可渗透的材料。所述柔性密封材料可以是适合于所述第二开放端的端部的任何形状。例如，柔性密封材料可以是环状o形环、具有矩形截面的垫圈、金属垫圈或其他类型的柔性材料。在一个实施方案中，柔性密封材料可以是含氟弹性体材料或将与相对的孔表面形成流体密封的其他材料。在另一个实施方案中，柔性密封材料是硅橡胶。在一些实施方案中，所述柔性密封材料在所述第二开放端与所述孔表面之间形成径向密封。还可以设想，可以采用其他密封取向。柔顺密封材料可以是各种橡胶，这取决于所使用的温度和其他细胞培养基组分和条件，例如含氟聚合物、buna-n、epdm，或者在一些情况下，具有柔性外镀层的金属。如果o形环的材料允许的话，柔性密封材料也可以涂覆有化学惰性的、生物相容的涂层。
59.在一些实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为与平底细胞培养孔对接。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为与凹坑孔(诸如，例如，agilent xf孔)对接。
60.在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置成与本发明技术的孔接口，所述孔包括模制到所述孔的底部中的连续环。
61.因此，本发明技术的集中器掩模可用于在较大孔内的中央细胞接种区域中接种细胞的方法中。在一些实施方案中，集中器掩模漏斗用于在孔底的中心集中细胞接种的方法中。在一些实施方案中，所述集中器掩膜以期望的细胞浓度将大部分细胞接种在中心孔底部区域上方。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模可用于从不需要细胞的孔底区域排除细胞接种的方法中。
62.在一些实施方案中，本发明技术的细胞接种集中器掩模可与细胞悬浮液结合离心和表面涂层一起使用，使得悬浮液中的细胞粘附到孔表面。在某些实施方案中，可以在下游分析之前去除集中器掩模。
63.本发明的方法可以进一步包括细胞的分析，例如通过agilent xf测定进行分析。
64.在本发明技术的一些方法中，所述方法还包括例如通过移液动作去除在集中器掩模/孔底部界面处滞留的空气。
65.在一些实施方案中，约5.0μl至约20μl的培养基可被移液到集中器掩模中。在其他实施方案中，约10μl至约15μl的培养基可被移液到集中器掩模中。在一些实施方案中，约12.5μl的培养基可被移液到集中器掩模中。因此，当前技术的方法可以使用不会引入明显的移液误差的体积来执行。
66.在本发明技术的一些实施方案中，可以将接种的多孔板移动到孵育器中进行细胞扩增。在这些实施方案中的一些中，所述集中器掩模可以在细胞孵育期间保持在适当的位置。因此，本发明技术的某些实施方案适用于低粘附细胞。本发明技术的其他实施方案涉及高粘附细胞的培养。
67.在其他实施方案中，集中器掩模及其使用方法与市售的多孔板(例如agilent xf孔板)兼容。在另外的实施方案中，集中器掩模及其使用方法与当前技术的包括在内部底部孔表面上的连续环的多孔板兼容。
68.图2a是用于将细胞接种到多孔板中的集中器掩模的示意图。在该实施方案中，集中器掩模201由框架表面202和框架侧面203限定。在该实施方案中，框架还包括框架凸片204，用于将集中器掩模对准和堆叠到多孔板上。多个漏斗205从框架延伸出。漏斗包括第一开放端206和第二开放端207，其中第一开放端206具有比第二开放端207更大的直径。在一些实施方案中，漏斗的远端208包括弹性体部分。在一些实施方案中，漏斗205被插入到孔中，其中在孔的底部和漏斗的远端208之间形成防液界面。图2b是图2a的剖视图，示出了用于将细胞接种到多孔板中的集中器掩模的横截面。
69.本发明技术的集中器掩模可以以任何方式或取向配置，包括具有适当数量和间隔的漏斗以与标准化的多孔板兼容并配合到标准化的多孔板中。例如，在一些实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少8个漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少12个漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少24个漏斗。在一些实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少48个漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少96个漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少384个漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模包括至少1536个漏斗。
70.在一些实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为包括具有约0.5mm至约6.0mm的内径的漏斗。在一些其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为包括具有约1.0mm至约5.0mm的内径的漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为包括具有约3.0mm至约4.0mm的内径的漏斗。在其他实施方案中，本发明技术的集中器掩模被配置为包括具有约2.0mm的内径的漏斗。
71.包括多孔板和集中器掩模的细胞接种系统
72.本发明技术还涉及一种细胞接种系统，其包括如本文所述的集中器掩模，其与同样如本文所述的连续环形多孔板结合使用。在该实施方案中，集中器掩模的所述多个漏斗被配置成装配到多孔板的多个孔中。
73.本发明技术的细胞接种系统包括多孔板，该多孔板包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；多个孔，每个孔具有开放端、与所述开放端相对的封闭端以及位于所述开放端和所述封闭端之间的至少一个壁；其中，每个所述孔的所述开放端被所述框架表面包围；其中，所述封闭端包括在所述壁之间并且接触所述壁的孔表面；以及在每个孔的所述封闭端的所述孔表面上的至少一个连续环。
74.所述细胞接种系统还包括集中器掩模，所述集中器掩模包括框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；从所述框架表面延伸出的多个漏斗，每个漏斗具有第一开放端和第二开放端；并且其中，所述第一开放端连接到所述框架表面并且具有比所述第二开放端更大的直径。
75.在本发明技术的细胞接种系统中，所述集中器掩模的所述多个漏斗被配置成配合到所述多孔板的所述多个孔中，使得所述漏斗的所述第二开放端与每个孔的所述封闭端的所述孔表面上的所述连续环接触。在一些实施方案中，所述远端的底部接触所述连续环的顶部。在一些实施方案中，所述远端的侧向部分接触所述连续环的侧向部分。
76.图3是细胞接种系统的剖视图，其包括插入到具有孔的多孔板中的集中器掩模，所述孔包括在孔的封闭端的孔表面上的连续环。在该实施方案中，细胞接种系统301由集中器掩模201和多孔板101形成，所述集中器掩模201的漏斗被配置成装配在一起，使得集中器掩
模的漏斗被插入到多孔板101的孔中。细胞接种系统301包括多孔框架表面102、多孔框架侧面103和多孔框架基部104。在该实施方案中，多孔框架还包括用于操纵板的多孔框架突片105。多孔板包括限定孔的孔壁106(不可见)，以及在该实施方案中，类似护城河的周边孔板沟槽111。多孔板孔还包括开放端(不可见)和封闭端108，封闭端包括连续环109。连续环109形成在封闭孔端108的中心部分上的细胞接种区域110。
77.细胞接种系统301的集中器掩模201包括框架表面202和框架侧面203。集中器掩模还包括多个漏斗205。漏斗包括第一开放端206和第二开放端207。集中器掩模201被配置成使得漏斗的第二开放端207被插入到多孔板101的孔中。在该实施方案中，漏斗的第二开放端207被构造成接触在孔108的封闭端的孔表面上的连续环109。在一些实施方案中，第二开放端207包括远端部分208。在一些实施方案中，第二开放端207与连续环109之间的界面形成液密密封。在某些实施方案中，第二开放端207和连续环109之间的界面不形成液密密封。细胞接种系统还包括用于操纵板的多孔板框架凸片105。细胞接种系统还包括用于将集中器掩模201对准和插入到多孔板101中的集中器掩模框架突片204。
78.本发明技术还涉及使用细胞接种系统301将细胞接种到多孔板中的孔的中心的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含细胞的液体培养基添加到细胞接种系统的第一开放漏斗端206中，使得细胞沉积到细胞接种区域110中，所述细胞接种区域由在孔108的封闭端的孔表面上的至少一个连续环109限定。在一些实施方案中，可以将接种的细胞接种系统301移动到孵育器中进行细胞扩增。在某些实施方案中，可以从多孔板101移除集中器掩模201。在其他实施方案中，集中器掩模201可以保持插入细胞接种系统301的多孔板201中。在一些实施方案中，在孵育之前从多孔板101移除集中器掩模201。在其他实施方案中，当细胞被孵育以进行扩增时，集中器掩模201可以保持插入在多孔板101中。在一些实施方案中，可以在分析细胞之前从多孔板101移除集中器掩模201。在其他实施方案中，在细胞分析期间，集中器掩模201可保留在多孔板101中。在一些实施方案中，细胞的分析包括光学读出。
79.本发明的技术涉及并适用6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔和1536孔的规格。图4是本发明技术的96孔板的示意图，该孔板具有在孔的内底表面上包括连续环的孔。在该实施方案中，多孔板401由具有框架表面102、框架侧面103和框架基部104的框架限定。多孔板401还包括孔壁106、开放端107和封闭端108(不可见)。孔的封闭端108还包括限定细胞接种区域110的连续环109。在该实施方案中，多孔板401不包括类似护城河的周边孔板沟槽或用于操纵板的框架凸片，然而在其他实施方案中，本发明技术的多孔板包括类似护城河的周边孔板沟槽或用于操纵板的框架凸片。
80.代谢测量
81.在一些实施方案中，本发明的方法、装置和系统可用于测量细胞生物学，例如在微呼吸测定法的领域中，其包括定量测量少量细胞的生物能学或代谢状态，而不是对整个动物进行呼吸测定法。过去，微呼吸测定法是使用微观玻璃流动细胞进行的，该细胞利用数毫升的细胞培养物和clark电极来测量细胞代谢。这种技术不是微观的、容易的或高通量的。seahorse bioscience的通量分析仪和测定法通过引入可在8、24和96塑料细胞培养板中轻松进行的全面测定法，为微呼吸测定法提供了改进的技术。通过引入各种兴奋剂、抑制剂和定制药物并测量耗氧量和质子产生的变化，由此产生的可以对糖酵解和氧化磷酸化途径进
行复杂的表征。与微呼吸测定法有关的附加细节在美国专利申请第15/896,255号中提供，该申请通过引用整体并入本文。
82.作为本发明的另一方面，本发明的方法、装置和系统用于培养中的各个细胞类型的代谢测量。在一些实施方案中，本发明的方法、装置和系统可用于分析非接触共培养中的细胞。所述系统可以包括如本文所述的多孔板。例如，本文所述的多孔板可用于通过将第一细胞类型放置在由连续环限定的细胞接种区域内，并将第二细胞类型放置在连续环和孔壁之间，以保持非接触共培养。在一些实施方案中，所述非接触共培养中的不同细胞类型彼此流体连通。在其他实施方案中，所述非接触共培养的不同细胞类型彼此不流体连通。
83.本发明的其他方面包括一个以上的任何形状的连续环，其中所述连续环提供多个细胞接种区域或任何大小、形状或构型的区段，用于通过将不同细胞接种到不同的细胞接种区域/区段来制备和维持非接触共培养物。此外，本发明技术的某些方面包括在孔表面上的模制物理屏障，其不是环，而是被配置为提供细胞接种区域的网格或替代构型。当通过将不同的细胞类型接种到不同的细胞接种区域中产生本发明技术的非接触共培养时，本发明的方法、装置和系统可用于在给定时间从一个细胞接种区域/区段独立地获得代谢测量。可选地，本发明的方法装置和系统可用于在给定时间从两个或更多个或所有细胞接种区域/区段获得代谢测量。与非接触共培养相关的附加细节在美国专利申请第15/896,255号中提供，该申请通过引用整体并入本文。
84.在本发明的方法、装置和系统中，可以使用一个或多个传感器来测量细胞群的生理特性。传感器可以是荧光传感器、发光传感器、isfet传感器、表面等离子体共振传感器、基于光学衍射原理的传感器、基于木材异常原理的传感器、声学传感器或微波传感器。本发明技术不限于任何特定的细胞测定、测量或传感器，而是可以由本领域技术人员结合任何期望的细胞分析方法来使用。因此，本发明的系统、装置和方法可以包括一个或多个前述传感器，其被定位成测量本文所述的孔中样品的一个或多个特性。
85.本发明的方法、装置和系统可用于与细胞培养和分析相关的各种领域。这些领域包括但不限于生物学研究，药物发现和临床诊断。例如，作为药物发现工具，该设备可用于筛选各种分子，以对共培养，蛋白质分泌或细胞内/细胞外离子交换中的细胞代谢产生影响。本发明的方法、装置和系统也可用于在进行常规测定之前和之后确定体外培养(包括共培养)的细胞的健康状况，从而改善这种测定的性能。
86.细胞群
87.在本发明的方法和装置中使用的细胞群可以包括任何感兴趣的细胞。这些细胞包括但不限于细菌、真菌、酵母、原核细胞、真核细胞、动物细胞、人细胞和/或永生细胞。所述细胞的至少一部分可以附着到所述容器的表面。细胞的至少一部分可以悬浮在培养基中。细胞的至少一部分可以包括活组织、类器官、球体或工程化组织。在一些实施方案中，至少一部分细胞粘附到孔的封闭端或壁。
88.已知的细胞系可以用作本发明的方法、装置和系统中的细胞类型。例如，可以与本发明技术结合使用的已知细胞系包括但不限于c8161、ccrf-cem、molt、mimcd-3、nhdf、hela、hela-s3、huh1、huh4、huh7、huvec、hasmc、hekn、heka、miapacell、panc1、pc-3、tf1、ctll-2、cir、rat6、cv1、rpte、a10、t24、j82、a375、arh-77、calu1、sw480、sw620、skov3、sk-ut、caco2、p388d1、sem-k2、wehi-231、hb56、tib55、jurkat、j45.01、lrmb、bcl-1、bc-3、
ic21、dld2、raw264.7、nrk、nrk-52e、mrc5、mef、hep g2、hela b、hela t4、cos、cos-1、cos-6、cos-m6a、bs-c-1猴肾上皮细胞、balb/3t3小鼠胚胎成纤维细胞、3t3 swiss、3t3-l1、132-d5人胚胎成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-t、3t3、721、9l、a2780、a2780adr、a2780cis、a172、a20、a253、a431、a-549、alc、b16、b35、bcp-1细胞、beas-2b、bend.3、bhk-21、br 293、bxpc3、c3h-10t1/2、c6/36、cal-27、cho、cho-7、cho-ir、cho-k1、cho-k2、cho-t、cho dhfr-/-、cor-l23、cor-l23/cpr、cor-l23/5010、cor-l23/r23、cos-7、cov-434、cml t1、cmt、ct26、d17、dh82、du145、ducap、el4、em2、em3、emt6/ar1、emt6/ar10.0、fm3、h1299、h69、hb54、hb55、hca2、hek-293、hela、hepa1c1c7、hl-60、hmec、ht-29、jurkat、jy细胞、k562细胞、ku812、kcl22、kg1、kyo1、lncap、ma-mel 1-48、mc-38、mcf-7、mcf-10a、mda-mb-231、mda-mb-468、mda-mb-435、mdck ii、mdck ii、mor/0.2r、mono-mac 6、mtd-1a、myend、nci-h69/cpr、nci-h69/lx10、nci-h69/lx20、nci-h69/lx4、nih-3t3、nalm-1、nw-145、opcn/opct细胞系、peer、pnt-1a/pnt 2、renca、rin-5f、rma/rmas、saos-2细胞、sf-9、skbr3、t2、t-47d、t84、thp1细胞系、u373、u87、u937、vcap、vero细胞、wm39、wt-49、x63、yac-1、yar、及其转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的各种来源获得(参见，例如，美国类型培养物保藏中心(atcc)(马纳萨斯，弗吉尼亚州))。在本发明的方法和装置中，这些或其他细胞系可用作第一细胞类型或第二细胞类型。在一些实施方案中，第一细胞类型是取自受试者(例如人类患者)的细胞群，并且第二细胞类型是已知细胞系。
89.示例性实施方案
90.1.一种用于液体培养基中的细胞群的多孔板，所述多孔板包括：
91.框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；
92.多个孔，每个孔具有开放端、与所述开放端相对的封闭端以及位于所述开放端和所述封闭端之间的至少一个壁；其中，每个所述孔的所述开放端被所述框架表面包围；其中，所述封闭端包括在所述至少一个壁之间并且接触所述至少一个壁的孔表面；以及
93.在一个或多个所述孔的所述封闭端的所述孔表面上的至少一个连续环。
94.2.根据实施方案1所述的多孔板，其中所述至少一个连续环被配置为在所述孔表面上限定至少一个细胞接种区域，所述至少一个细胞接种区域可与盖、柱塞或另一元件协作形成测定微室。
95.3.根据实施方案1所述的多孔板，其中所述多孔板包括一个以上的连续环，所述一个以上的连续环被配置为限定一个以上的细胞接种区域。
96.4.根据前述实施方案中任一项所述的多孔板，其中所述至少一个连续环具有约0.01mm至约2mm的高度。
97.5.根据前述实施方案中任一项所述的多孔板，其中所述至少一个连续环具有约0.5mm至约6.0mm的内径，例如，约2.0mm的内径。
98.6.一种用于将液体培养基中的细胞接种到多孔板中的集中器掩模，所述集中器掩模包括：
99.框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；
100.从所述框架表面延伸出的多个漏斗，每个漏斗具有第一开放端和第二开放端；
101.其中，所述第一开放端连接到所述框架表面并且具有比所述第二开放端更大的直径。
102.7.根据实施方案6所述的集中器掩模，其中所述第二开放端包括远侧弹性体部分。
103.8.根据实施方案6或7所述的集中器掩模，其中，所述集中器掩模包括至少8个漏斗。
104.9.根据实施方案6至8所述的集中器掩模，其中，所述漏斗具有约0.5mm至约6.0mm的内径，例如，约2.0mm的内径。
105.10.一种在培养孔的中心部分接种细胞的方法，所述方法包括：
106.将包含细胞的液体培养基添加到根据实施方案1至5中任一项所述的孔表面上的至少一个细胞接种区域中。
107.11.根据实施方案10所述的方法，其中，在接种细胞后，将所述培养孔移入孵育器中并进行孵育。
108.12.根据实施方案11所述的方法，其中，所述孵育的细胞基本上没有或没有表现出任何孵育器引起的边缘效应。
109.13.一种细胞接种系统，包括多孔板和集中器掩模：
110.其中，所述多孔板包括：框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；多个孔，每个孔具有开放端、与所述开放端相对的封闭端以及位于所述开放端和所述封闭端之间的至少一个壁；其中，每个所述孔的所述开放端被所述框架表面包围；其中，所述封闭端包括在所述壁之间并且接触所述壁的孔表面；以及在每个孔的所述封闭端的所述孔表面上的至少一个连续环；
111.其中，所述集中器掩模包括框架，其具有框架表面和从所述框架表面延伸的框架侧面；从所述框架表面延伸出的多个漏斗，每个漏斗具有第一开放端和第二开放端；并且其中，所述第一开放端连接到所述框架表面并且具有比所述第二开放端更大的直径；并且
112.其中，所述多个漏斗被配置为装配到所述多个孔中，使得所述漏斗的所述第二开放端与一个或多个所述孔的封闭端的孔表面上的所述连续环形成界面。
113.14.根据实施方案13所述的系统，其中所述第二开放端与所述连续环之间的界面是足够小以减少液体扩散的间隙。
114.15.根据实施方案13所述的系统，其中所述第二开放端包括远侧弹性体部分。
115.16.根据实施方案15所述的系统，其中所述界面是所述第二开放端的远侧弹性体部分和所述连续环之间的物理接触，从而形成液密密封。
116.17.一种在多孔板中接种细胞的方法，所述方法包括：
117.将包含细胞的液体培养基添加到根据实施方案13所述的细胞接种系统的所述第一开放端中，其中所述细胞沉积到由所述至少一个连续环在所述孔表面上限定的区域中。
118.18.根据实施方案17所述的方法，其中，在接种细胞后，将所述多孔板移至孵育器。预期孵育的细胞不表现出任何或基本上没有孵育器引起的边缘效应。
119.19.根据实施方案18所述的方法，其中，在将所述多孔板放入所述孵育器之前，从所述多孔板上移除所述集中器掩模。
120.20.根据实施方案17所述的方法，进一步包括分析所述多孔板中的所述细胞以获得光学测量结果。
121.实施例1：
122.将细胞在包含连续环的本发明的技术的多孔板中接种、扩增并进行分析。将这些
细胞与在包括不具连续环的标准孔的多孔板中接种、扩增和分析的对照细胞进行比较。被测试的连续环具有0.2mm的壁高度和2.0mm的内径。针对两种孔类型分析相同数量的细胞(4,500)。
123.接种细胞并扩增后，使用agilent xfp仪器测量耗氧率(ocr)。通过获得光学测量结果来测量耗氧率。结果表明，当在具有连续环的孔中培养时，与在不具连续环的标准孔中培养的细胞相比，相同数量的细胞(4,500)产生的信号强度高出三倍。
124.鉴于本公开文本，应当注意，可以根据本教导来实现所述方法和装置。此外，各种部件、材料、结构和参数仅通过说明和示例的方式被包括在内，并且不具有任何限制意义。鉴于本公开文本，本教导可以在其他应用中实现，并且可以确定实现这些应用的组件、材料、结构和设备，同时保持在所附权利要求书的范围内。