借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物及其应用等。此外，本发明涉及肠功能改善方法以及肠的不适感的减轻方法。


背景技术：

2.水通道蛋白(aquaporin，aqp)在人类的体内对水的运输发挥重要作用。水通道蛋白可使水选择性地通过，借由水通道蛋白的水的移动，受水通道蛋白的表达量控制。水通道蛋白在多个脏器内均有表达，迄今为止，已知aqp存在有aqp0至aqp12的13种(非专利文献1)。
3.尤其在肠道中主要是aqp3进行表达。aqp3除了水之外，还与甘油或尿素等低分子化合物的运输有关，负责水分量的控制。从使用了多种药剂的实验中，可明确得知肠道中的aqp3的表达量降低会引起腹泻，以及aqp3的表达量提高会引起严重的便秘(非专利文献2)。综上所述，肠道中的aqp3，是在肠道的水运输方面发挥重要作用的分子。
4.进一步，已知aqp3的表达对于肠道屏障的维持也必不可少(非专利文献3)，肠道中的aqp3是对肠道屏障的维持发挥重要作用的分子。
5.另一方面，二高-γ-亚麻酸(dgla)是n-6类多元不饱和脂肪酸(pufa)的1种，含有于肉、蛋、海鲜类等各种食品中。其具有经年累月的摄取的实际成果，可以说是安全性极高的原料。但是，其含量总体而言与同为n-6类pufa的花生四烯酸或n-3类pufa的epa或dha相比极为稀少。
6.已知dgla能有效抑制肥大细胞数量的亢进，而且dgla对皮肤疾病、哮喘、鼻炎等与肥大细胞数量的亢进息息相关的各种疾病的有用性较高(专利文献1)。
7.此外，已知dgla对抑制嗜酸性粒细胞的浸润极为有用，对与嗜酸性粒细胞的浸润或细胞数量的增加息息相关的各种疾病(特应性皮炎、湿疹、牛皮癣等皮肤疾病、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(copd)、过敏性肺炎、嗜酸性粒细胞性肺炎等呼吸系统类疾病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、溃疡性大肠炎等消化系统类疾病等)，具有预防或治疗效果(专利文献2)。
8.但是，尚不知晓dgla可亢进水通道蛋白的功能，而且也不知晓借由水通道蛋白3的表达调节可改善肠功能。
9.专利文献
10.专利文献1：日本特开2006-306813号公报
11.专利文献2：日本特开2006-306812号公报
12.非专利文献
13.非专利文献1：松崎利行.日本医科大学医学会杂志.5.118-124.2009.
14.非专利文献2：ikarashi n.int.j.mol.sci.17.e1172.2016.
15.非专利文献3：zhang w.febs lett.585.3113-3119.2011.


技术实现要素：

16.本发明的目的在于提供一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物及其应用。此外，本发明的目的在于提供一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善方法，以及一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠的不适感的减轻方法。
17.本发明者为解决上述课题进行了深入研究，结果初次发现，二高-γ-亚麻酸(dgla)对借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善极为有用，从而完成了本发明。
18.如上所述，dgla含有于肉、蛋、海鲜类等各种食品中，具有经年累月的摄取的实际成果，是安全性极高的原料。但是，已明确其含量总体而言与同为n-6类pufa的花生四烯酸或n-3类pufa的epa或dha相比极为稀少，而本案申请人迄今为止，如日本专利第3354581号所示，通过发明出利用菌株的dgla油脂的发酵生产方法，从而可大量地制备构成脂肪酸的约40％是由dgla所构成的甘油三酯。
19.本发明提供一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物及其应用，并涉及以下组合物等。
20.[1]一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物，其特征在于，含有二高-γ-亚麻酸作为有效成分。
[0021]
[2]根据上述[1]所述的肠功能改善用组合物，其特征在于，水通道蛋白3的表达调节，是抑制水通道蛋白3的表达降低。
[0022]
[3]根据上述[2]所述的肠功能改善用组合物，其特征在于，抑制水通道蛋白3的表达降低，是抑制因年龄增长而导致的水通道蛋白3的表达降低。
[0023]
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的肠功能改善用组合物，其特征在于，所述肠功能改善用组合物为饮食品、医药品或医药部外品。
[0024]
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的肠功能改善用组合物，其特征在于，用于选自减轻肠的不适感、调整肠的状况、清肠、改善便的状态、改善排便、改善大便习惯、改善肠的状态、提高肠的屏障功能、维持肠的功能以及改善降低的肠功能中的1种或2种以上的用途。
[0025]
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的肠功能改善用组合物，其特征在于，附加有具有减轻肠的不适感作用的内容的标示。
[0026]
[7]一种应用，其特征在于，将二高-γ-亚麻酸用于借由水通道蛋白3表达调节的肠功能改善。
[0027]
[8]一种应用，其特征在于，将二高-γ-亚麻酸用于借由水通道蛋白3的表达调节来减轻肠的不适感。
[0028]
[9]一种借由水通道蛋白3表达调节的肠功能改善方法，其特征在于，投用二高-γ-亚麻酸。
[0029]
[10]一种借由水通道蛋白3表达调节的肠的不适感的减轻方法，其特征在于，投用二高-γ-亚麻酸。
[0030]
根据本发明，可提供一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物及其应用。此外，根据本发明，可提供一种借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善方法以及肠的不适感的减轻方法。
附图说明
[0031]
图1是表示大肠的磷脂质中所含的脂肪酸中的dgla的组成比(％)的图表。
[0032]
图2是表示水通道蛋白3基因的表达解析结果的图表。
[0033]
图3是表示水通道蛋白4基因的表达解析结果的图表。
具体实施方式
[0034]
＜借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物＞
[0035]
dgla可源自于任意合适的来源。然而，几乎不存在已知dgla含量较高的天然油脂源，极微量的情况下，可从牛的肝脏、猪的肾脏、蛋黄等中进行提取。近年来，随着微生物发酵技术的进步，也可源自于微生物，例如真菌类、细菌类或酵母中。
[0036]
作为合适的真菌类，为属于毛霉目(mucorales)，例如被孢霉属(mortierella)、腐霉属(pythium)或虫霉属(entomophyhora)的真菌。dgla的优选起源是来自于被孢霉属(mortierella)。若为来自高山被孢霉(mortierella alpina)则更优选。含有dgla的油脂，可如日本专利第3354581号所示，通过使用被孢霉属(mortierella)的微生物发酵法来制备构成脂肪酸的约40％为由dgla构成的甘油三酯。
[0037]
dgla，例如可以甘油酯、磷脂质、糖脂质、烷基酯或游离脂肪酸的形态存在。本发明中使用的dgla为这些中任一种形态均可。前述甘油酯是含有dgla作为构成脂肪酸的甘油酯。前述甘油酯例如为甘油三酯、甘油二酯或甘油单酯。优选前述甘油酯为甘油三酯及/或甘油二酯。含有dgla作为构成脂肪酸的甘油酯的一例，可列举优选将构成脂肪酸的30％以上，更优选35％以上设为dgla的甘油三酯。
[0038]
此外，本发明的肠功能改善用组合物，除了dgla以外，还可供给1种或1种以上的附加性pufa。其除了dgla以外，可为其他的n-6类pufa(例如亚油酸(la)、γ-亚麻酸(gla)等)，也可为n-3类pufa(例如epa、dha)。
[0039]
作为可转换为用于本发明的dgla的该酸的生理学可接受的官能性衍生物，可为含有dgla的甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯，或磷脂质、糖脂质，甚至是游离的脂肪酸、脂肪酸酯(例如，甲基或乙基酯)、固醇酯的形态。
[0040]
优选pufa存在于油中。其可为纯油、加工油(例如，经化学性及/或酶性处理的油)或浓缩油。这些油可含有10～100％的pufa，但所期望的pufa，例如dgla的含量，只要油是来自于微生物，则为油中的5％以上，优选10％以上，更优选25％以上即可。这种油可在这些百分率的浓度范围内含有1种或1种以上的pufa。这种油可以是来自于单独的细胞或微生物的纯油，或是来自于其他来源的2种或2种以上的油的调和油或混合油。这种油还可以含有例如1种或1种以上的添加物，例如抗氧化剂(例如，生育酚、维生素e、生育三烯酚、抗坏血酸衍生物、棕榈酸盐或酯、虾青素)或芝麻素、coq10等。
[0041]
另外，本发明的肠功能改善用组合物中的“肠功能改善”，优选不同于因溃疡性大肠炎而导致的肠功能降低的改善。
[0042]
如上所述，明确得知如果大肠中的水通道蛋白3的表达量降低，则水分吸收会被抑制从而引起腹泻。dgla通过抑制大肠中的水通道蛋白3的表达降低，由此促进水分吸收，从而具有防止腹泻的作用。此外，也明确得知如果大肠中的水通道蛋白3的表达量降低，则肠道屏障功能也会降低。dgla通过抑制水通道蛋白3的表达降低，来抑制肠道屏障功能的降
低，从而可维持肠道屏障功能。因此，dgla通过调节水通道蛋白3的表达来改善肠功能。在本发明中，肠功能改善可以是促进大肠的水分吸收或是抑制水分吸收的降低。本发明的借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善用组合物，优选为借由水通道蛋白3的表达降低抑制的肠功能改善用组合物，更优选为借由肠(优选为大肠)中的水通道蛋白3的表达降低抑制的肠功能改善用组合物。另外，肠中的水通道蛋白3的表达降低，优选不包含因溃疡性大肠炎所导致的水通道蛋白3的表达降低的情况。
[0043]
上述借由水通道蛋白3的表达降低抑制的肠功能改善用组合物，优选水通道蛋白3的表达降低是因年龄增长所导致。
[0044]
本发明优选用于肠功能降低的人类，尤其是因年龄增长所导致的肠功能降低的人类。本发明的肠功能改善用组合物，可用于预防或改善，伴随大肠中的水通道蛋白3的表达降低所导致的肠功能的降低而生的状态或疾病。作为伴随肠功能的降低而生的状态或疾病，例如可列举便秘、腹泻以及随之而生的肠的不适感等。
[0045]
本发明的肠功能改善用组合物适用于治疗用途(医疗用途)或非治疗用途(非医疗用途)的任一种均可。
[0046]
本发明的肠功能改善用组合物可制成饮食品、医药品、医药部外品、饲料等形态。本发明的肠功能改善用组合物，其自身可以是用于肠内功能改善的饮食品、医药品、医药部外品、饲料等，也可以是调配至这些中而使用的原料或制剂等。
[0047]
就本发明的肠功能改善用组合物而言，作为一例，可以制剂的形态进行提供，但不仅限于本形态。可以将该制剂直接作为组合物提供，或以含有该制剂的组合物形式提供。本发明的肠功能改善用组合物也可以称为肠功能改善剂。
[0048]
从充分获得本发明的效果的角度出发，本发明的肠功能改善用组合物优选为口服用组合物。作为口服用组合物，可列举饮食品、口服用的医药品、医药部外品，优选为饮食品或口服用医药品，更优选为饮食品。
[0049]
本发明的肠功能改善用组合物只要不损害本发明的效果，除了二高-γ-亚麻酸(dgla)以外，可以含有任意的添加剂、任意的成分。这些添加剂及成分，可对应组合物的形态等进行选择，一般可使用能用于饮食品、医药品、医药部外品、饲料等中的物质。
[0050]
将本发明的肠功能改善用组合物制成饮食品、医药品、医药部外品、饲料等时，其制造方法无特别限定，可通过一般的方法来制造。
[0051]
例如，将本发明的肠功能改善用组合物制成饮食品时，可向二高-γ-亚麻酸(dgla)中调配可用于饮食品的成分(例如，食品原料，根据需要所使用的食品添加物等)，而制成各种饮食品。饮食品无特别限定，例如可列举：一般的饮食品、健康食品、健康辅助食品、健康饮料、功能性标示食品、特定保健用食品、患者用饮食品等。上述健康食品、健康辅助食品、功能性标示食品、特定保健用食品等，例如可制成细粒剂、片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、咀嚼剂、糖浆剂、液剂、流食等的各种制剂形态。
[0052]
此外，本发明的肠功能改善用组合物，可制成标示有具有肠功能改善效果的内容的饮食品的形态，其中肠功能改善效果基于水通道蛋白3的表达调节。
[0053]
本发明的肠功能改善用组合物可以附加具有减轻肠的不适感作用的内容的标示。此外，本发明的肠功能改善用组合物也可附加具有肠功能改善效果的内容的标示。这种标示，例如优选选自“减轻肠的不适感”、“调整肠的状况”、“清肠”、“改善便秘或腹泻等的便的
状态”、“改善排便”、“改善大便习惯”、“改善肠的状态”、“提高肠的屏障功能”、“维持肠的功能”以及“改善降低的肠功能”中的1种或2种以上。
[0054]
此外，本发明的肠功能改善用组合物优选用于选自减轻肠的不适感、调整肠的状况、清肠、改善便秘或腹泻等的便的状态、改善排便、改善大便习惯、改善肠的状态、提高肠的屏障功能、维持肠的功能以及改善降低的肠功能中1种或2种以上的用途，其中，更优选用于减轻肠的不适感的用途。
[0055]
本发明的肠功能改善用组合物中的二高-γ-亚麻酸(dgla)的含量无特别限定，可对应其形态等进行设定。肠功能改善用组合物中的二高-γ-亚麻酸(dgla)的含量，例如优选为，供成人每人每日摄取5mg～600mg的二高-γ-亚麻酸(dgla)(以游离dgla换算)所需的合适的量。例如，dgla的摄取量(以游离dgla换算)可以为成人每人每日5mg～200mg或5mg～150mg。在一种方式中，将本发明的肠功能改善用组合物制成饮食品、医药品、医药部外品、饲料等时，优选将饮食品、医药品、医药部外品、饲料等中的dgla的含量设为上述范围。
[0056]
本发明的肠功能改善用组合物可通过对应其形态的适当方法使对象摄取或对其投用。如上所述，从充分获得本发明的效果的角度出发，本发明的肠功能改善用组合物优选口服摄取(口服投用)。
[0057]
本发明的肠功能改善用组合物的摄取量(也称为投用量)无特别限定，只要是可获得肠功能改善效果的量(有效量)即可，可根据投用形态、投用方法、对象的体重等进行适当设定。在一种方式中，以人类(成人)为对象通过口服使其摄取或对其投用的情况下，肠功能改善用组合物的摄取量，以二高-γ-亚麻酸(dgla)的摄取量(以游离dgla换算)计，体重60kg每日的量优选为5～600mg，更优选为5～200mg。优选将上述量分为1日1次以上，例如，1日1次～数次(例如2～3次)来使其摄取。在一种方式中，本发明的肠功能改善用组合物可以为，用于使成人每体重60kg，每日摄取或投用上述量的二高-γ-亚麻酸(dgla)的口服用组合物。
[0058]
通过持续摄取(投用)二高-γ-亚麻酸(dgla)，可提高肠功能改善效果。因此在优选方式中，应持续摄取本发明的肠功能改善用组合物。在本发明的一种实施方式中，优选持续摄取肠功能改善用组合物2周以上，更优选持续摄取12周以上。
[0059]
摄取或投用本发明的肠功能改善用组合物的对象(也可称为投用对象)，无特别限定。优选为人类或非人类哺乳动物，更优选为人类。
[0060]
作为摄取本发明的肠功能改善用组合物的对象，可以是需要或期望改善肠功能的对象，优选需要或期望改善肠功能的对象。作为这类对象，例如可列举有便秘、腹泻或是因此而带来的肠的不适感的人类等。本发明的肠功能改善用组合物，例如，以通过肠功能改善从而可期待预防或改善的状态或是疾病的预防等为目的，也可以对健康者使用。
[0061]
本发明的肠功能改善用组合物，含有天然物质或饮食品中所含的安全性较高的成分(dgla)作为有效成分，通过持续摄取而发挥较高的肠功能改善效果。因此，本发明的肠功能改善用组合物，例如，通过使有上述便秘、腹泻、因此而带来的肠的不适感的人类、健康者等日常口服摄取，来调节肠的水通道蛋白3的表达(例如，抑制表达降低)，其作为用于肠功能改善的健康食品、功能性标示食品等较为有用。
[0062]
本发明优选用于下述目的：针对肠功能降低的对象，通过使其摄取二高-γ-亚麻酸(dgla)，借由大肠中的水通道蛋白3的表达调节，可使肠功能得到改善，从而预防或改善
由肠功能降低引起的或伴随肠功能降低而生的状态或疾病，或者保护或维持健康。
[0063]
本发明的肠功能改善用组合物及其应用，借由水通道蛋白3的表达调节，从而作为改善小肠或大肠中的水分吸收调节功能的物质而有用，进一步作为促进小肠或大肠中的水分吸收的物质而有用，尤其作为促进大肠中的水分吸收的物质而有用。
[0064]
本发明也包含一种肠功能改善方法，其特征在于，投用二高-γ-亚麻酸(dgla)。本发明的肠功能改善方法，优选通过口服投用含有dgla的肠功能改善用组合物来实施。
[0065]
此外本发明也为一种应用，其特征在于，将二高-γ-亚麻酸用于借由水通道蛋白3表达调节的肠功能改善。本应用优选为基于二高-γ-亚麻酸的口服摄取的应用。
[0066]
此外本发明也为一种应用，其特征在于，将二高-γ-亚麻酸用于借由水通道蛋白3的表达调节来减轻肠的不适感。本应用优选为基于口服摄取二高-γ-亚麻酸的应用。
[0067]
此外本发明也为一种借由水通道蛋白3表达调节的肠功能改善方法，其特征在于，投用二高-γ-亚麻酸。本方法优选口服投用二高-γ-亚麻酸。
[0068]
此外本发明也为一种借由水通道蛋白3表达调节的肠的不适感的减轻方法，其特征在于，投用二高-γ-亚麻酸。本方法优选口服投用二高-γ-亚麻酸。
[0069]
本发明的肠功能改善用组合物及其应用，可以是小肠或大肠的功能改善用组合物及其应用，优选为大肠的功能改善用组合物及其应用。此外，本发明的肠功能改善方法及肠的不适感的减轻方法，可以是投用小肠或大肠的功能改善用组合物的方法，优选为投用大肠的功能改善用组合物的方法。
[0070]
实施例
[0071]
以下通过实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不因此而受到限定。另外，在本发明中，“％”如无特殊声明则意味着“重量％”。
[0072]
＜实施例1＞
[0073]
为了研究dgla的摄取是否对伴随年龄增长而降低的肠道功能有某些作用，使用dgla油脂即通过日本专利第3354581号所示的方法所制备的构成脂肪酸的约40％为dgla的甘油三酯，研究其在实验动物中的有用性。本动物实验，遵守动物爱护管理法及其他相关法令，经由公司内动物实验委员会的审查后，基于机构负责人批准的计划而实施。
[0074]
在实验中，使用幼龄(3个月大)、及老龄(17～26个月大)的小鼠(雄性c57bl/6j)。组的构成设定为幼龄对照食物组(10只)、老龄对照食物组(14只)、老龄dgla食物组(12只)。制备如表1所示的以下的2种饲料，使幼龄对照食物组及老龄对照食物组自由摄食对照食物12周，使老龄dgla食物组自由摄食dgla食物12周。关于dgla食物，将其设定为向饲料中添加0.5％的上述甘油三酯，以使含有于饲料中的dgla(以游离脂肪酸量计算)约为0.2％。关于对照食物和dgla食物，以dgla之外的其他脂肪酸的组成比为几乎相同的方式进行制备。此外，幼龄对照食物组、老龄对照食物组、老龄dgla食物组的任一组的平均每日的摄食量均约为3g。另外，由于小鼠的体重平均约为30g，故可推测计算该实验中的dgla摄取量每日约为200mg/kg。
[0075]
此外，动物在摄食12周的实验结束后，于麻醉状态下使其安乐死后，采集大肠。大肠组织随后用于脂肪酸的分析以及基因表达的评价。
[0076]
通过folch法，从采集的大肠中提取组织中的全部脂质并进行精制。接着，使用薄层色谱法(己烷：二乙醚＝7：3)对磷脂质组分进行分离，针对该组分，使用盐酸甲醇进行甲
基酯化，提供给基于气相色谱(agilent 7890b)的分析。基于所得的峰面积，计算大肠中的磷脂质所含的脂肪酸中的dgla的组成比(％)。所得的结果如图1所示。
[0077]
此外，对大肠进行水通道蛋白基因的表达量的测定。使用isogen(nippon gene)，从冷冻的大肠中提取total rna。对所得的total rna使用high capacity cdna reverse transcription kit(thermo fisher scientific)进行反转录。使用基因特异性引物及taqman(注册商标)fast universal pcr master mix(thermofisher scientific)，通过steponeplus(注册商标)实时pcr系统(thermo fisherscientific)进行定量性pcr。所得的结果如图2及图3所示。另外，结果使用18s的表达水平进行校正，并通过任意单位来表示。用于检测的基因特异性引物如表3所示。
[0078]
表1：各饲料的成分表(单位：g)
[0079]
[表1]
[0080]
原料名称(每1000g)对照食物dgla食物酪蛋白140.00140.00l-胱氨酸1.801.80玉米淀粉465.69465.69α-玉米淀粉155.00155.00蔗糖100.00100.00纤维素粉末50.0050.00ain-93m矿物质混合35.0035.00ain-93维生素混合10.0010.00重酒石酸胆碱2.502.50叔丁基对苯二酚0.010.01棕榈油21.1421.00大豆油11.436.00亚麻籽油7.438.00dgla-tg(*1)0.005.00(*2)合计1000.001000.00
[0081]
*1：构成脂肪酸的约40％为dgla的甘油三酯
[0082]
*2：游离dgla量相当于饲料的约0.2％
[0083]
表2：体重变化(单位：g，平均值
±
标准误差)
[0084]
[表2]
[0085] 摄取开始时摄取第4周摄取第8周摄取第12周幼龄对照食物组(n＝10)24.8
±
0.326.4
±
0.328.7
±
0.731.2
±
1.0老龄对照食物组(n＝14)34.3
±
0.833.2
±
1.032.4
±
1.131.5
±
0.9老龄dgla食物组(n＝12)36.1
±
0.835.7
±
1.234.6
±
0.832.6
±
0.5
[0086]
[表3]
[0087]
基因名称entrez gene id制造商引物aqp311828thermo fisher scientificmm01208559_ml
aqp411829thermo fisher scientificmm00802131_ml
[0088]
(结果)
[0089]
与老龄对照食物组相比，老龄dgla食物组并未观察到体重变化(表2)或一般状态的异常。
[0090]
大肠的磷脂质中所含的脂肪酸中的dgla的组成比(％)(平均值
±
标准误差)如图1所示。显著性检验通过dunnett’s test进行(相对于老龄对照食物组，*：p＜0.05)。通过dgla食物的摄取，大肠的磷脂质中所含的dgla的组成比增加(幼龄对照食物组：3.82
±
0.14％、老龄对照食物组：3.71
±
0.13％、老龄dgla食物组：4.30
±
0.11％)。由上述可知，dgla的摄取可使构成大肠中的磷脂质的脂肪酸中所含的dgla的组成比增加。
[0091]
此外，大肠中的水通道蛋白基因的表达解析结果如图2及图3所示。
[0092]
图2为水通道蛋白3基因(aqp3)的表达解析结果(平均
±
标准误差，*：p＜0.05(相对于老龄对照食物组))，由此确认到dgla可抑制伴随年龄增长而导致的水通道蛋白3的表达降低。另一方面，图3为水通道蛋白4基因(aqp4)的表达解析结果(平均
±
标准误差)，由此确认到dgla并未对水通道蛋白4的表达量造成影响。
[0093]
由上述确认到，dgla可在大肠中抑制水通道蛋白3随年龄增长而导致的表达降低。即，确认到dgla对于借由水通道蛋白3的表达调节的肠功能改善有效。