用于治疗肝癌的口服药物组合物的制作方法

1.本发明涉及一种用于治疗肝癌的口服药物组合物，更详细而言，涉及含有苯并噻唑苯胺(benzothiazole aniline)衍生物的用于治疗肝癌的口服药物组合物。


背景技术：

2.肝癌是一种预后较差的恶性肿瘤，在全球癌症致死原因中排名第二，其中，以韩国为首的亚洲地区发病率尤其高。超过70％的肝癌患者无法进行根治性手术，即使进行了根治性切除，5年内其他部位复发的概率也超过50％，5年生存率低于12％。此外，晚期肝癌对全身化疗有反应的概率很低，在10％以内。因此，需要具有优异的肝癌治疗效果的肝癌治疗剂。特别是在韩国，平均每年有16,000名新发肝癌患者出现，相关治疗剂市场每年约1.2万亿韩元，2019年全球肝癌治疗剂市场规模达到1.57万亿韩元，可以说有效的肝癌治疗剂的市场价值非常高。
3.另一方面，据报告作为临床上用于治疗肝癌的抗癌药物，细胞毒性抗癌药物(通过攻击细胞自身来抑制细胞生长和分裂的治疗剂)的顺铂(cisplatin)，虽然具有缩小肝癌的肿瘤的效果、以及防止更恶化的效果，但是，会有各种副作用，如呕吐、肾功能下降、电解液改变、贫血、骨髓抑制等。尤其，据说一些癌症患者在服用一次顺铂后肾功能会迅速下降。因此，也需要开发与现有抗癌药物相比毒性缓解的抗癌药物，以预防或减轻这些副作用。


技术实现要素：

4.本发明的一目的在于，提供一种缓解毒性、抗癌效果优异的用于治疗肝癌的药物组合物。
5.本发明的所述目的，通过提供用于治疗肝癌的口服药物组合物来达成，所述用于治疗肝癌的口服药物组合物含有由以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐：
6.[化学式1]
[0007][0008]
在所述化学式1中，
[0009]
x1表示nh、o或s，
[0010]
l表示(n＝0至5)，
[0011]
a表示化学式a-1：
[0012]
[化学式a-1]
[0013][0014]
发明效果
[0015]
根据本发明的药物组合物，用于治疗肝癌，将该药物组合物口服给药时，肝癌治疗效果优异，具体地，肝癌肿瘤大小缩小效果优异，而且，显著缓解毒性。
附图说明
[0016]
图1为示出使用实施例2的人肝癌细胞系在肝癌动物模型中进行抗癌效果试验3周内的肿瘤大小和体重变化的图表。
[0017]
图2为拍摄使用实施例2的人肝癌细胞系在肝癌动物模型中进行抗癌效果试验21天后从动物模型中分离的肿瘤的相对大小的照片。
[0018]
图3为按照实施例3的毒性比较试验测量的血清中got和gpt活性度。
[0019]
图4为实施例3的毒性比较试验中对肝癌动物模型给药后获得的肝和肾的组织照片。
[0020]
图5为根据实施例4对肝癌动物模型给药后存活率的比较图。
[0021]
图6为示出使用实施例5的人肝癌细胞系在肝癌动物模型中进行抗癌效果试验4周内的肿瘤大小和体重变化的图表。
[0022]
图7为拍摄使用实施例5的人肝癌细胞系在肝癌动物模型中进行抗癌效果试验28天后从动物模型中分离的肿瘤的相对大小的照片。
[0023]
图8为根据实施例5对肝癌动物模型给药后存活率的比较图。
具体实施方式
[0024]
以下，本发明中使用的术语仅用于说明具体实施例，并不用来限定本发明。除非另有定义，包含技术术语及科学术语在内的本说明书中使用的所有术语具有与本发明所属技术领域的技术人员普遍理解的含义相同的含义。在普遍使用的词典中所定义的术语应解释为具有与相关技术的文脉上所具有的含义一致的含义，并且，除非在本说明书中明确定义，则不应以理想性或过于公式化的含义来进行解释。
[0025]
本发明的用于治疗肝癌的口服药物组合物，含有由以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0026]
[化学式1]
[0027][0028]
在所述化学式1中，
[0029]
x1表示nh、o或s，
[0030]
l表示(n＝0至5)，
[0031]
a表示化学式a-1：
[0032]
[化学式a-1]
[0033][0034]
所述化学式1中，x1可以表示s。另外，l可以表示(n＝0至5)。因此，由化学式1表示的化合物，例如，x1可以表示s，l可以表示(n＝0至5)。
[0035]
而且，由所述化学式1表示的化合物可以为由以下化学式1-1表示的化合物：
[0036]
[化学式1-1]
[0037][0038]
根据本发明的化学式1的化合物，可以以药学上可接受的盐的形态使用。“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的药理活性的化合物的盐，可以为，例如(i)与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸及磷酸等无机酸形成的盐；(ii)与乙酸、丙酸、异丁酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸及甲苯磺酸等的有机酸形成的盐；(iii)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时形成的盐；(iv)与乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n-甲基葡糖胺等的有机碱的配位体；或者(v)藻酸盐等的氨基酸的盐。
[0039]
本发明的药物组合物可以单独包含由所述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐，但除此之外，还可以进一步包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以为药学领域中常用的载体，可以为赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、纤维素等)或稀释剂(例如生理盐水、纯净水等)。
[0040]
此外，根据需要，本发明的药物组合物，还可以包含除药学上可接受的载体以外的药学上可接受的添加剂，例如粘合剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、薄膜包衣基质、肠溶性薄膜包衣基质、软胶囊基质、增溶剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂、表面活性剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、增稠剂、芳香剂或着色剂。
[0041]
本发明的药物组合物是口服给药的，可以是固体或液体制剂的形态、具体地，可以为液体制剂的形态。固体剂型，可以为例如片剂、胶囊(软胶囊和硬胶囊)、散剂、颗粒剂、丸剂、含片等，液体剂型，可以为例如酏剂、悬浮液、乳剂、溶液剂、糖浆剂、柠檬水剂的形态。在片剂的情况下，除了活性成分(化学式1的化合物或其盐)之外，通常可以添加乳糖、玉米淀
粉等的载体；硬脂酸镁等的润滑剂；甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯醇等的粘合剂；膨润土、藻酸钠等的崩解剂等。在液体制剂的情况下，活性成分可以与纯净水或生理盐水等的载体、及根据需要与蔗糖单硬脂酸酯等的增溶剂、聚乙烯吡咯烷酮等的稳定剂等一起制剂化，在口服用水性悬浮液的情况下，可以将活性成分与悬浮剂、及根据需要与表面活性剂、防腐剂、稳定剂等一起制剂化。
[0042]
另外，所述药物组合物的给药量，可以根据给药方法、服用者的年龄、性别、患者的重症度、病情、惰性率、及一起使用的药物来确定，可以一次性给药，也可以分次数给药。药物组合物中的有效成分，即本发明的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐，以一周为准，将0.005至100mg/kg体重的量，例如1至10mg/kg体重的量一周一次或分数次，并将其可以每日一次或分数次口服给药。
[0043]
根据本发明的另一实现例，本发明提供一种肝癌治疗方法，包括将所述化学式1的化合物或其药学上可接受的盐口服给药给需要治疗的对象的步骤。所述治疗方法，还可以包括在所述口服给药步骤之前确定需要预防或治疗肝癌的对象的步骤。
[0044]
根据需要，本发明的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐，可以与用于治疗肝癌的其他的抗癌剂一起服用。
[0045]
下面，通过实施例对本发明进行详细说明，本发明不限于以下实施例。
[0046]
实施例1.在人肝癌细胞系上进行抗癌效果的试验
[0047]
如下，以人肝癌细胞系hepg2为对象使用cck-8进行癌细胞的细胞存活率(cell viability)分析。在本实验中，作为本发明的化合物使用所述化学式1-1的化合物。作为参考，所述cck-8(cellcounting kit-8)使用高水溶性四唑盐-sst-8进行分析，所述分析，基于在电子介体的存在下[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)(2,4-二磺苯基)-2h-四唑鎓，单钠盐]被还原时，生成水溶性甲臜橙色染料，在细胞中由脱氢酶产生的甲臜染料的量与活细胞的数量直接成正比。具体实验方法为如下。
[0048]
人肝癌细胞系hepg2在添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)和1％的抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)的eagle最低必需培养基(eagle`s minimum essential medium，emem)中生长，为了分析细胞存活率，经稳定的细胞以1
×
104个/孔的密度悬浮在200μl的培养基中，并种植在96孔板的每个孔中。使其在37℃、5％co2的培养箱中附着14小时以上以等待稳定。第二天，除去生长培养基，将本发明的化合物和顺铂在100μl的emem无血清培养基中稀释至不同浓度(0、1、5、10、25、50、75、100μm)，然后，37℃、5％co2的状态下培养22小时。每孔加入10μl的cck-8溶液，继续培养2小时。对培养完成的孔板，使用酶标仪在450nm测量吸光度。
[0049]
细胞存活率公式：
[0050][0051]
(式中，a为在对照组的孔中测得的吸光度值，b为含药孔中测得的吸光度值。)
[0052]
计算的值利用graphpad prism应用程序绘制图表。所得值的统计显著性通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett`multiple comparison test)进行确认。表示具有***p《0.001vs.顺铂的显著性。将其结果示于图9。
[0053]
从上图9可知，本发明的化合物基于肝癌细胞系中的癌细胞存活率计算的ic
50
值(μ
m)比顺铂小约9倍，这表明本发明的化合物与顺铂相比，明显更好地破坏肝癌细胞。
[0054]
实施例2.使用人肝癌细胞系在肝癌动物模型中的抗癌效果试验
[0055]
人肝癌细胞系hepg2在添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)和1％的抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)的eagle最低必需培养基(eagle`s minimum essential medium，emem)中生长，为了制备肝癌动物模型，将经稳定的细胞以5
×
106个/只的密度悬浮在emem无血清培养基(serum free media):基质胶(matrigel)的1:1混合物(100μl)中，然后，经皮下移植在裸鼠(5周龄、雄)胁腹中。等待形成肿瘤3周后，当肿瘤体积达到200mm3时，测量重量和肿瘤大小，然后随机分组。将小鼠分成3个组后，对每组，仅经静脉注射生理盐水(saline)(生理盐水注射组(n＝6，i.v.))，或者经静脉注射利用nacl水溶液、hcl水溶液或naoh水溶液调节至ph4的顺铂(顺铂注射组(n＝6，i.v.))或者将溶解在生理盐水中的本发明的化合物(化学式1-1的化合物)强制口服给药(本发明的给药组(n＝6，p.o.))。在各组中，给药间隔和给药次数都相同，给药3周，一周两次间隔，每日1次。顺铂的每次给药量(静脉注射)为5mg/kg，本发明的给药组(口服给药)的每次给药量为100mg/kg。
[0056]
给药前麻醉，为了观察体重变化，测量体重。通过以下公式观察随时间的肿瘤大小变化。
[0057]
平均肿瘤体积公式：
[0058][0059]
(在式中，a为长轴长度，b为短轴长度。)
[0060]
如上所述观察3周的小鼠的体重变化和肿瘤大小的变化示于图1。从图1可知，在肝癌动物模型中，口服给药本发明的化合物时，由于没有发生体重下降，因此，可以确认整体上对药物没有毒性，而且，肿瘤全部消失或明显缩小。
[0061]
另外，给药21天后，在生理盐水组中，以肿瘤开始坏死时间为实验结束时间，处死所有参与实验的裸鼠，从侧腹仅分离肿瘤，拍摄肿瘤的相对大小。拍摄的组织照片如图2所示。在图2中，灰白色的点表示所有的肿瘤都消失，存在难以区分肿瘤的个体。从图2可知，生理盐水给药组或顺铂给药组，都存在肿瘤细胞，但是，口服给药本发明的化合物的组中，肿瘤显著减少或完全消失。
[0062]
实施例3.血液和组织学毒性比较试验
[0063]
通过got和gpt的活性分析比较毒性。具体实验方法如下：使用根据赖氏(reitman-frankel)法制备的试剂盒(asan pharm)测量血清中got和gpt活性。实验结束时，从给予化合物的小鼠的腹腔静脉采血，分离血清。将底物溶液加入血清并加热一定时间后，由于血清got的作用，在got测量用底物溶液(asparatate(天门冬氨酸)、a-ketoglutarate(α-酮戊二酸混合液))中产生草乙酸盐(oxalacetate)和谷氨酸，另外，由于gpt作用在gpt测量用底物溶液(丙氨酸(alanine)、a-ketoglutarate(α-酮戊二酸混合液))中产生丙酮酸(pyruvate)和谷氨酸。此处，加入作为显色试剂的2，4-二硝基苯腙(2,4-dinitrophenylhydrazone)，生成草酰乙酸(oxaloacetate)或丙酮酸的2，4-二硝基苯腙，再加入naoh显色后，测量吸光度(505nm)。血清中，got、gpt的活性由另外制作的标准校准曲线计算。图3中示出所述血清中的got及gpt活性。
[0064]
实验结束时，对参与实验的裸鼠的血液进行灌注，获取肝脏和肾脏。用4％多聚甲
醛固定组织，经过石蜡包埋过程，制备厚度为4μm的组织切片之后，执行天狼星红染色(sirius red staining)。然后，通过光学显微镜获得组织照片，并示于图4中。
[0065]
从图3及图4可知，当口服给药本发明的化合物时，在肝脏和肾脏的毒性显著降低。
[0066]
实施例4.存活率的比较
[0067]
比较在根据上述实施例2进行的动物模型试验中观察的给药后随时间的存活率，并示于图5中。从图5可知，当给药根据本发明的化合物时，存活率更高。
[0068]
实施例5.根据给药途径变更的抗癌效果的比较试验
[0069]
人肝癌细胞以2
×
106个/只的密度悬浮在emem无血清培养基(serum free media):基质胶(matrigel)的1:1混合物(100μl)中，然后，经皮下移植在裸鼠(5周龄、雄)胁腹中。等待形成肿瘤4周后，当肿瘤体积达到100mm3时，测量体重和肿瘤大小，然后随机分组。将小鼠分成4个组后，对每组，仅经静脉注射生理盐水(saline)(生理盐水注射组(n＝6，i.v.))，或者经静脉注射利用nacl水溶液、hcl水溶液或naoh水溶液调节至ph4的顺铂(顺铂注射组(n＝5，i.v.))，或者静脉注射溶解在生理盐水中的本发明的化合物(化学式1-1的化合物)(本发明的化合物的i.v.注射组(n＝5，i.v.))，或者强制口服给药溶解在生理盐水的本发明的化合物(化学式1-1的化合物)(本发明的给药组(n＝5，p.o.))。在各组中，给药间隔和给药次数都相同，给药4周，一周两次间隔，每日1次。静脉注射组的每次给药量为5mg/kg，口服给药组的每次给药量为100mg/kg。给药前麻醉，为了观察体重变化，测量体重。以与上述实施例1相同的方式测量4周的体重变化、肿瘤大小的变化，将结果示于图6。通过与实施例2相同的方式分离肿瘤，拍摄肿瘤的相对大小，拍摄的组织照片如图7所示。另外，与实施例4相同的方式给药后，比较随时间的存活率(如图8所示)。从图6、7及8中可知，将根据本发明的化合物口服给药时与静脉注射时相比，根据体重变化的毒性和抗癌效果显著出色。