针对艰难梭菌的适配体的制作方法

针对艰难梭菌的适配体
1.相关申请
2.本技术要求于2019年6月5日提交的美国临时申请序列no.62/857,639以及于2020年2月28日提交的临时申请序列no.62/983,095的权益和优先权，每个申请的全部公开内容通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.本技术包含随同提交的序列表，其包括具有以下大小25,602字节、创建于2020年6月1日的文件193519-010104_st25.txt，其内容在此通过引用并入本文。
技术领域
5.本发明的一些实施方案涉及与艰难梭菌(clostridium difficile)芽孢特异性结合的适配体及使用其的方法。例如，本发明的一些实施方案涉及使用本文中所述的适配体检测样品中艰难梭菌(c.difficile)细菌例如芽孢的存在、不存在或量的方法。


背景技术：

6.艰难梭菌是革兰氏阳性厌氧芽孢形成物，并且是重要的医院内和社区获得性致病性细菌。艰难梭菌感染(c.difficile infection，cdi)是全球感染的主要原因并且发病率和死亡率升高。鉴于抗生素抗性的升高和与艰难梭菌感染相关的潜在死亡率，控制措施至关重要。


技术实现要素：

7.本公开内容的一些方面涉及对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力的适配体，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白(exosporium layer protein)。
8.在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。在一些实施方案中，表面蛋白是具有如seq id no 18所示的氨基酸序列的cdec。在一些实施方案中，表面蛋白是具有如seq id no：19所示的氨基酸序列的cdem。在一些实施方案中，表面蛋白是具有如seq id no：15所示的氨基酸序列的cota。在一些实施方案中，表面蛋白是具有如seq id no：16所示的氨基酸序列的cote。在一些实施方案中，表面蛋白是具有如seq id no：17所示的氨基酸序列的cote壳多糖酶蛋白。
9.在一些实施方案中，适配体包含与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含这样的核酸序列，其具有与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少90％同一性的序列的至少约30个连续核苷酸。
10.在一些实施方案中，适配体是单链dna适配体。
11.在一些实施方案中，适配体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记包含荧光团、纳米粒、量子点、酶、放射性同位素、预定义序列部分、生物素、脱硫生物素、硫醇基、
胺基、叠氮化物、氨基烯丙基、地高辛配基(digoxigenin)、抗体、催化剂、胶体金属颗粒、胶体非金属颗粒、有机聚合物、胶乳颗粒、纳米纤维、纳米管、树枝状聚合物、蛋白质、脂质体、或其组合。
12.在一些实施方案中，提供了包含至少一种适配体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含水、盐、缓冲剂、洗涤剂(detergent)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)中的至少一种。
13.本公开内容的一些方面涉及复合体，其包含：(a)对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力的适配体，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白；以及(b)可检测分子。在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。
14.本公开内容的一些方面涉及生物传感器或测试条，其包含对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力的适配体，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白。在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。在一些实施方案中，适配体包含与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的核酸序列中的任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含这样的核酸序列，其具有与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少90％同一性的序列的至少约30个连续核苷酸。
15.本公开内容的另一些方面涉及用于检测样品中艰难梭菌芽孢的存在、不存在或水平的装置，该装置包含支持物和对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力的适配体，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白。在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。在一些实施方案中，适配体包含与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的核酸序列中的任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含这样的核酸序列，其具有与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少90％同一性的序列的至少约30个连续核苷酸。在一些实施方案中，样品是从怀疑患有或被诊断患有艰难梭菌感染的对象获得的样品或者位于医院环境中的物体。在一些实施方案中，该装置适合于表面等离子体共振(surface plasmon resonance，spr)、生物层干涉术(biolayer interferometry，bli)、侧流测定和/或酶联寡核苷酸测定(enzyme-linked oligonucleotide assay，elona)。
16.在本公开内容的一些方面中，提供了如本文中所述的适配体、复合体、组合物、生物传感器或测试条、或装置用于检测、富集、分开和/或分离艰难梭菌芽孢的用途。
17.在本公开内容的一些方面中，提供了检测样品中艰难梭菌的存在、不存在或量的方法，该方法包括使样品与本文中所述的适配体、复合体、组合物相互作用并检测艰难梭菌的存在、不存在或量。
18.本公开内容的一些方面涉及使表面上的艰难梭菌芽孢可视化的方法，其包括：使表面与对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力的适配体接触，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白；以及使表面上艰难梭菌芽孢的存在或不存在可视化。在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。在一些实施方案中，接触包括使表面接触足以使适配体能够与艰难梭菌芽孢结合的预定时间。
19.在一些实施方案中，该方法还包括在接触之后洗涤表面以除去未结合的适配体。
20.在一些实施方案中，该方法还包括使与艰难梭菌芽孢结合的适配体可视化，从而
检测艰难梭菌芽孢。
21.在一些实施方案中，适配体包含与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的核酸序列中的任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含这样的核酸序列，其具有与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少90％同一性的序列的至少约30个连续核苷酸。
22.在一些实施方案中，适配体与可检测部分缀合，从而形成适配体缀合物。在一些实施方案中，可检测部分是荧光团。在一些实施方案中，荧光团以约500nm至510nm的波长发射。
23.在一些实施方案中，该方法还包括用光源照射表面。在一些实施方案中，来自光源的光具有预定的波长，并且预定的波长对应于由适配体缀合物中可检测部分发射的光的波长。在一些实施方案中，光源被配置为以约485nm至515nm的波长产生光。在一些实施方案中，该方法还包括过滤由光源产生的光。在一些实施方案中，该方法包括使从光源产生的光通过带通滤光片。
24.在一些实施方案中，该方法还包括拍摄表面上的位置并检测与艰难梭菌芽孢结合的缀合适配体的存在或不存在。
25.本公开内容的另一些方面涉及用于使艰难梭菌芽孢可视化的试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含可检测部分的适配体，该适配体对艰难梭菌芽孢的表面蛋白具有特异性结合亲和力，其中表面蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白；(b)光源；以及(c)观察护目镜。
26.在一些实施方案中，表面蛋白是cdec、cdem、cota、cote或cote壳多糖酶。
27.在一些实施方案中，试剂盒还包含带通滤光片。
28.在一些实施方案中，可检测部分是发射约485nm至515nm的波长的荧光团，光源被配置为产生具有约485nm至515nm的波长的光，并且观察护目镜是橙色观察护目镜。
29.在一些实施方案中，光源产生具有约505nm的波长的光。
30.在一些实施方案中，带通滤光片是590nm带通滤光片。
31.在一些实施方案中，试剂盒还包含洗涤溶液以除去未结合的适配体。
32.在一些实施方案中，适配体包含在缓冲溶液中。
附图说明
33.当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方案。出于说明本发明的目的，在附图中示出了可以是优选的一些实施方案。然而，应当理解，本发明不限于所示出的精确布置和手段。
34.图1示出了艰难梭菌cdec蛋白的氨基酸序列(seq id no：18)。
35.图2示出了艰难梭菌cdem蛋白的氨基酸序列(seq id no：19)。
36.图3示出了艰难梭菌cota蛋白的氨基酸序列(seq id no：15)。
37.图4示出了艰难梭菌cote蛋白的氨基酸序列(seq id no：16)。
38.图5a示出了c端经his标记的艰难梭菌rcote蛋白(n281-f712)(mw 48,722da)的氨基酸序列(seq id no：20)。
39.图5b示出了c端经his标记的艰难梭菌rcotec壳多糖酶蛋白(p381-f712)(mw 36,
875da)的氨基酸序列(seq id no：17)。
40.图6示出了根据本公开内容的一些实施方案在比较来自cota装载珠的适配体回收(每个数据集的左侧)与来自空白珠的适配体回收(每个数据集的右侧)的测定中连续选择轮次之后的适配体回收。
41.图7示出了根据本公开内容的一些实施方案在比较来自cdec装载珠的适配体回收(每个数据集的左侧)与来自空白珠的适配体回收(每个数据集的右侧)的测定中连续选择轮次之后的适配体回收。
42.图8示出了根据本公开内容的一些实施方案在比较来自cdem装载珠的适配体回收(每个数据集的左侧)与来自空白珠的适配体回收(每个数据集的右侧)的测定中连续选择轮次之后的适配体回收。
43.图9示出了根据本公开内容的一些实施方案在比较来自cote装载珠的适配体回收(每个数据集的左侧)与来自空白珠的适配体回收(每个数据集的右侧)的测定中连续选择轮次之后的适配体回收。
44.图10示出了根据本公开内容的一些实施方案在比较来自cotec壳多糖酶装载珠的适配体回收(每个数据集的左侧)与来自空白珠的适配体回收(每个数据集的右侧)的测定中连续选择轮次之后的适配体回收。
45.图11示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cota与初始文库(初始适配体库)之间或者固定化cota与精化适配体群(cota适配体库)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
46.图12示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cdec与初始文库(初始适配体库)之间或者固定化cdec与精化适配体群(cdec适配体库)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
47.图13示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cdem与初始文库(初始适配体库)之间或者固定化cdem与精化适配体群(cdem适配体库)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
48.图14示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cote与初始文库(初始适配体库)之间或者固定化cote与精化适配体群(rcotec适配体库)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
49.图15示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cotec壳多糖酶与初始文库(初始适配体库)之间或者固定化cotec壳多糖酶与精化适配体群(cotec适配体库)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
50.图16示出了来自连续轮次的基于芽孢的选择的适配体回收％；其根据本公开内容的一些实施方案针对每个适配体群(以其蛋白质靶标-cota命名)将来自艰难梭菌芽孢(cd)的适配体回收与来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)芽孢(bs)的回收进行比较。
51.图17示出了来自连续轮次的基于芽孢的选择的适配体回收％；其根据本公开内容的一些实施方案针对每个适配体群(以其蛋白质靶标-cdec命名)将来自艰难梭菌芽孢(cd)的适配体回收与来自枯草芽孢杆菌芽孢(bs)的回收进行比较。
52.图18示出了来自连续轮次的基于芽孢的选择的适配体回收％；其根据本公开内容的一些实施方案针对每个适配体群(以其蛋白质靶标-cdem命名)将来自艰难梭菌芽孢(cd)
的适配体回收与来自枯草芽孢杆菌芽孢(bs)的回收进行比较。
53.图19示出了来自连续轮次的基于芽孢的选择的适配体回收％；其根据本公开内容的一些实施方案针对每个适配体群(以其蛋白质靶标-cote命名)将来自艰难梭菌芽孢(cd)的适配体回收与来自枯草芽孢杆菌芽孢(bs)的回收进行比较。
54.图20示出了来自连续轮次的基于芽孢的选择的适配体回收％；其根据本公开内容的一些实施方案针对每个适配体群(以其蛋白质靶标-cotec壳多糖酶命名)将来自艰难梭菌芽孢(cd)的适配体回收与来自枯草芽孢杆菌芽孢(bs)的回收进行比较。
55.图21示出了根据本公开内容的一些实施方案的明视场图像(左)和落射荧光图像(右)。艰难梭菌芽孢定位于上图，并且枯草芽孢杆菌芽孢定位于下图。定位的艰难梭菌芽孢的落射荧光图像(右上)示出了与艰难梭菌芽孢共定位的荧光点，这表明针对cota选择的经荧光标记的适配体群与艰难梭菌芽孢的结合。为清楚起见，显示荧光信号的芽孢用圆圈突出显示。为了比较，示出了定位的枯草芽孢杆菌芽孢的落射荧光图像(右下)。黑框表示镜头上的灰尘。
56.图22示出了根据本公开内容的一些实施方案的明视场图像(左)和落射荧光图像(右)。艰难梭菌芽孢定位于上图，并且枯草芽孢杆菌芽孢定位于下图。定位的艰难梭菌芽孢的落射荧光图像(右上)示出了与艰难梭菌芽孢共定位的荧光点，这表明针对cdec选择的经荧光标记的适配体群与艰难梭菌芽孢的结合。为清楚起见，显示荧光信号的芽孢用圆圈突出显示。为了比较，示出了定位的枯草芽孢杆菌芽孢的落射荧光图像(右下)。黑框表示镜头上的灰尘。
57.图23示出了根据本公开内容的一些实施方案的明视场图像(左)和落射荧光图像(右)。艰难梭菌芽孢定位于上图，并且枯草芽孢杆菌芽孢定位于下图。定位的艰难梭菌芽孢的落射荧光图像(右上)示出了与艰难梭菌芽孢共定位的荧光点，这表明针对cdem选择的经荧光标记的适配体群与艰难梭菌芽孢的结合。为清楚起见，显示荧光信号的芽孢用圆圈突出显示。为了比较，示出了定位的枯草芽孢杆菌芽孢的落射荧光图像(右下)。黑框表示镜头上的灰尘。
58.图24示出了根据本公开内容的一些实施方案的明视场图像(左)和落射荧光图像(右)。艰难梭菌芽孢定位于上图，并且枯草芽孢杆菌芽孢定位于下图。定位的艰难梭菌芽孢的落射荧光图像(右上)示出了与艰难梭菌芽孢共定位的荧光点，这表明针对cote选择的经荧光标记的适配体群与艰难梭菌芽孢的结合。为清楚起见，显示荧光信号的芽孢用圆圈突出显示。为了比较，示出了定位的枯草芽孢杆菌芽孢的落射荧光图像(右下)。黑框表示镜头上的灰尘。
59.图25a和25b示出了根据本公开内容的一些实施方案的明视场图像(左)和落射荧光图像(右)。艰难梭菌芽孢定位于上图，并且枯草芽孢杆菌芽孢定位于下图。定位的艰难梭菌芽孢的落射荧光图像(右上)示出了与艰难梭菌芽孢共定位的荧光点，这表明针对cotec壳多糖酶选择的经荧光标记的适配体群与艰难梭菌芽孢的结合。为清楚起见，显示荧光信号的芽孢用圆圈突出显示。为了比较，示出了定位的枯草芽孢杆菌芽孢的落射荧光图像(右下)。图25a示出了在3轮细胞选择之后经荧光标记的适配体群的结果。图25b示出了在4轮细胞选择之后经荧光标记的适配体群的结果。黑框表示镜头上的灰尘。
60.图26示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cota与初始文库(初始)
之间或者固定化cota与单克隆适配体：cota c1(cota c1)和cota b1(cota b1)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
61.图27示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cdec与初始文库(初始)之间或者固定化cdec与单克隆适配体cdec b3(cdec b3)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
62.图28示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cdem与初始文库(初始)之间或者固定化cdem与单克隆适配体cdem e2(cdem e2)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
63.图29示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cote与初始文库(初始)之间或者固定化cote与单克隆适配体：cote d2(cote d2)和cote g1(cote g1)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
64.图30示出了根据本公开内容的一些实施方案比较固定化cotec壳多糖酶与初始文库(初始)之间或者固定化cotec壳多糖酶与单克隆适配体：壳多糖酶d11(壳多糖酶d11)、壳多糖酶d10(壳多糖酶d10)和壳多糖酶h11(壳多糖酶h11)之间的相互作用的生物层干涉术(bli)数据。
65.图31a至图31e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在无polilight flare 2法医光(505nm)并且无590nm带通滤光片的情况下不锈钢表面上的受试样品的照片。为了比较，图31a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图31b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图31c示出了马血(阴性对照3)；图31d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图31e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
66.图32a至图32e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在有polilight flare 2法医光(505nm)而无590nm带通滤光片的情况下不锈钢表面上的受试样品的照片。为了比较，图32a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图32b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图32c示出了马血(阴性对照3)；图32d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图32e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
67.图33a至图33e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在有polilight flare 2法医光(505nm)并且有590nm带通滤光片的情况下不锈钢表面上的受试样品的照片。为了比较，图33a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图33b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图33c示出了马血(阴性对照3)；图33d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图33e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
68.图34a至图34e示出了根据本公开内容的一些实施方案在黑暗条件下在暴露于polilight flare 2法医光(505nm)并且有590nm带通滤光片的情况下不锈钢表面上的受试样品的照片。为了比较，图34a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图34b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图34c示出了马血(阴性对照3)；图34d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图34e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
69.图35a至图35e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在无polilight flare 2法医光(505nm)并且无590nm带通滤光片的情况下罩衣表面上的受试样品的照片。为了比较，图35a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图35b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图35c示出了马血(阴性对照3)；图35d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图35e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
70.图36a至图36e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在有polilight flare 2法医光(505nm)而无590nm带通滤光片的情况下罩衣表面上的受试样品的照片。为了比较，图36a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图36b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图36c示出了马血(阴性对照3)；图36d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图36e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
71.图37a至图37e示出了根据本公开内容的一些实施方案在环境光条件下在有polilight flare 2法医光(505nm)并且有590nm带通滤光片的情况下罩衣表面上的受试样品的照片。为了比较，图37a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图37b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图37c示出了马血(阴性对照3)；图37d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图37e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
72.图38a至图38e示出了根据本公开内容的一些实施方案在黑暗条件下在有polilight flare 2法医光(505nm)并且有590nm带通滤光片的情况下不锈钢表面上的受试样品的照片。为了比较，图38a示出了未经处理的不锈钢表面(阴性对照1)；图38b示出了艰难梭菌sh11芽孢(阴性对照2)；图38c示出了马血(阴性对照3)；图38d示出了在缓冲剂中的10μm cote h2适配体(阳性对照4)；以及图38e示出了10μm cote h2适配体-艰难梭菌sh11芽孢悬液。
具体实施方式
73.艰难梭菌
74.艰难梭菌是革兰氏阳性厌氧芽孢形成物，并且是重要的医院内和社区获得性致病性细菌。艰难梭菌感染(cdi)是全球感染的主要原因并且发病率和死亡率升高。尽管实际上肠毒素tcda和细胞毒素tcdb这两种主要毒力因子在cdi的发生中是必不可少的，但艰难梭菌芽孢是cdi的感染以及持续和传播的主要载体并且被认为在cdi复发的发作和水平传播中发挥重要作用。
75.艰难梭菌细菌存在于整个环境中，例如在土壤、空气、水、食品产品以及人和动物粪便中。少数人在其肠道中携带艰难梭菌而未显示出任何症状。然而，在另一些对象中，来自艰难梭菌的感染可引起从腹泻至危及生命的结肠炎症的症状。艰难梭菌感染的并发症可包括脱水、肾衰竭、中毒性巨结肠、肠穿孔，以及甚至死亡，如果感染未迅速控制的话。
76.艰难梭菌细菌通常影响医院或长期护理机构中的老年人。处于较高的感染艰难梭菌的风险中的对象包括但不限于服用过抗生素的那些、具有受损的免疫系统的那些以及经历过腹部或胃肠手术的那些。例如，在医院中体弱老年人中，艰难梭菌感染的死亡率可高至
25％，并且已假定抗生素治疗破坏正常的肠道菌群，因为艰难梭菌对许多用于治疗其他感染的药物具有天然抗性而使其定植和生长，从而使其能够产生毒素。
77.近年来，在先前被认为是低风险的对象中，例如未暴露于医疗保健机构的年轻和其他健康个体中，也已看到了艰难梭菌感染升高。最近鉴定了新的艰难梭菌菌株，即027型，已显示其比大多数其他类型的艰难梭菌产生更多的毒素，导致更大比例的严重疾病和明显更高的死亡率。
78.在美国，用于治疗患有cdi的成人的一线治疗是用于严重和非严重cdi二者的万古霉素(125mg，每天4次，持续10天)或非达霉素(200mg，每天两次，持续10天)。在英国，甲硝唑(400mg或500mg，每天3次，持续10至14天)被认为是用于治疗轻度至中度艰难梭菌感染的首次发作的一线；并且，万古霉素(125mg，每天4次，持续10至14天)被认为是用于二次发作或如果感染严重时。当存在体温或白细胞计数升高、肌酸酐升高或严重结肠炎的体征或症状时，感染被定义为严重的。万古霉素也可用于由027型菌株引起的感染。如果感染复发，可使用万古霉素或非达霉素(200mg，每天两次，持续10天)。在一些严重情况下，人可能需要进行手术以除去受感染的肠部分。
79.来自艰难梭菌的芽孢进入粪便中，并且可通过未清洗的手传播至食物、表面和物体。芽孢可在表面上持续数周或数月，并且通过与这样的表面接触来传播。
80.鉴于抗生素抗性升高和与艰难梭菌感染相关的潜在死亡率，控制措施是最重要的。目前的措施包括医疗保健提供者例如护士和医生遵循包括以下的方案：
81.·
在护理每位患者之前和之后，用皂和水或者基于酒精的洗手液清洁双手，以防止艰难梭菌和其他细菌通过他们的手从一个患者传至另一个患者。
82.·
仔细清洁已用于患有cdi的患者的病房和医疗设备。
83.·
仅当必要时给予患者抗生素。
84.·
使用接触预防措施以防止艰难梭菌传播至其他患者。接触预防措施意指：
85.ο只要可能，维持患有艰难梭菌的患者在单独的房间或与另一个患有艰难梭菌的患者在一个房间。
86.ο在照顾患有艰难梭菌的患者时医疗保健提供者穿戴手套和衣服外的罩衣。
87.ο访客穿戴手套和罩衣。
88.ο当离开患有艰难梭菌的患者的房间时，除去手套和罩衣，并清洁手。
89.ο在接触预防措施中的患者被要求尽可能多地呆在其病房中。他们可去医院的其他区域进行治疗和检测。
90.尽管有这些预防措施，艰难梭菌仍然是重要的医疗保健问题，并且因此需要快速鉴定环境中艰难梭菌的存在以使其传播最小化。
91.本文中公开的实施方案可至少部分地减轻现有技术中确定的一些问题。
92.本文中公开的实施方案可提供在检测艰难梭菌中有用的方法和产品。
93.以下描述了本发明的实施方案的另一些特征。除非另有指示，否则本发明的实施方案的实施将采用本领域普通技术人员已知的分子生物学、微生物学、重组dna技术和免疫学的常规技术。
94.大多数一般的分子生物学、微生物学重组dna技术和免疫学技术可在sambrook et al，molecular cloning，a laboratory manual(2001)cold harbor-laboratory press，
cold spring harbor，n.y.或者ausubel et al.，current protocols in molecular biology(1990)john wiley and sons，n.y.中找到。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology，juo，pei-show，第2版，2002，crc press；the dictionary of cell and molecular biology，第3版，academic press；和oxford university press为本领域技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
95.单位、前缀和符号以其国际统一体系(syst
è
me international d’unit
é
)(si)接受形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有指示，否则氨基酸序列以氨基至羧基的取向从左至右书写，并且核酸序列以5’至3’的取向从左至右书写。
96.在下文中，通过非限制性实例的方式更详细地解释一些实施方案。在非限制性示例性实验中，除非另有说明，否则使用无污染的标准试剂和缓冲液。
97.一些实施方案包括能够与艰难梭菌特异性结合的适配体。
98.在某些实施方案中，艰难梭菌是选自sh11(核糖核酸型rt078)、027型和43598的菌株。在某些实施方案中，适配体能够与菌株sh11的艰难梭菌芽孢结合。在某些实施方案中，适配体能够与菌株027型的艰难梭菌芽孢结合。在某些实施方案中，适配体能够与菌株43598的艰难梭菌芽孢结合。
99.一些实施方案涉及与艰难梭菌芽孢结合的适配体。一些实施方案包括与艰难梭菌芽孢衣壳蛋白结合的适配体。
100.艰难梭菌产生代谢休眠的芽孢。芽孢包含最外的可包含许多表面蛋白的芽孢外壁层。芽孢外壁层可包含选自bcla1、bcla2、bcla3、cdea、cdeb、cdec和cdem的一种或更多种蛋白质。显示五种衣壳蛋白cota、cotb、cotcb、cotd和cote在芽孢的外衣壳层上表达。
101.这些蛋白质中的一种或更多种可以是本文中一种或更多种适配体的靶标，并且通过本文中的一种或更多种适配体与它们中的一种或更多种结合可以是本文中检测艰难梭菌的方法的基础。
102.在一些实施方案中，适配体与如下表1中所列出的艰难梭菌芽孢衣壳蛋白特异性结合：
103.表1
104.cotaseq id no：15cot eseq id no：16cotecseq id no：17cdecseq id no：18cdemseq id no：19
105.靶蛋白
106.在一个实施方案中，适配体与本文中限定的靶标特异性结合。本文中使用的术语“靶标”用于指选自艰难梭菌cota蛋白、艰难梭菌cote蛋白、艰难梭菌cdec蛋白、艰难梭菌cdem蛋白、艰难梭菌cotec壳多糖酶蛋白和艰难梭菌芽孢中的至少一种的分子。本文中使用的术语“靶蛋白”和“靶肽”可互换使用。
107.在一些实施方案中，针对整个艰难梭菌芽孢选择适配体。因此，在一些实施方案
中，适配体选择性地与艰难梭菌芽孢结合。
108.在一些实施方案中，适配体与艰难梭菌芽孢的芽孢外壁层的表面蛋白(例如cdec、cdem)特异性结合。在一些实施方案中，适配体与艰难梭菌芽孢的衣壳蛋白(例如cota、cote、cotec)特异性结合。
109.在一些实施方案中，靶蛋白可以是表2中所列出的天然存在的靶蛋白或重组靶蛋白，并且可以是本文中所述的一种或更多种适配体的靶标：
110.表2
111.靶蛋白seq id no：cota15cot e16rcotec17cdec18cdem19rcote(ls25)20
112.cdec
113.在一些实施方案中，适配体与艰难梭菌cdec蛋白特异性结合。cdec的氨基酸序列以uniprotkb-q18as2(q18as2_pepd6)(版本1)公开，并且是如图1(seq id no：18)所示的。
114.在一些实施方案中，适配体与在艰难梭菌菌株之间保守的cdec蛋白表位结合。因此，在一些实施方案中，适配体用于检测样品中的多种艰难梭菌菌株。
115.cdem
116.在一些实施方案中，适配体选择性地与艰难梭菌表面结合的cdem蛋白的氨基酸序列结合。cdem是富含半胱氨酸的蛋白质，其被认为是芽孢的衣壳和芽孢外壁层的形态发生所必需的。艰难梭菌蛋白的氨基酸序列以uniprotkb-a0a3t1gtu1(a0a3t1gtu1_clodi)(版本1)公开并且在图2(seq id no：19)中示出。
117.在一些实施方案中，适配体与在艰难梭菌菌株之间保守的cdem蛋白表位结合。因此，在一些实施方案中，适配体用于检测样品中的多种艰难梭菌菌株。
118.在一些实施方案中，芽孢包含芽孢衣壳。芽孢衣壳可包含多种蛋白质，包括但不限于例如cota和cotb。
119.cota
120.在一些实施方案中，适配体与由艰难梭菌cota基因编码的蛋白质特异性结合。该蛋白质在本文中可称为cota或“芽孢衣壳组装蛋白”。
121.cota的氨基酸序列以uniprotkb登录no.q186g8(q186g8_pepd6)(版本1)公开，并且在图3(seq id no：15)中示出。
122.cote和cotec壳多糖酶
123.在一些实施方案中，适配体与由cote基因编码的艰难梭菌蛋白特异性结合。cote蛋白(也称为过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin))的氨基酸序列以登录号uniprotkb-q18bv5(q18bv5_pepd6)公开并且在图4(seq id no：16)中示出。
124.在一些实施方案中，将适配体改造成称为“rcote”(也称为ls25)的cote的重组形式。rcote的氨基酸序列在图5a中示出，并且由氨基酸残基n281-f712(seq id no：20)组成。
如图5a所示，重组蛋白包含壳多糖酶结构域和对cote独特的序列。
125.在一些实施方案中，适配体与称为“rcotec”(也称为ab45)的重组艰难梭菌蛋白特异性结合。rcotec的氨基酸序列在图5b中示出，并且由氨基酸残基n381-f712(seq id no：17)组成。
126.在一些实施方案中，针对经标记的rcotec蛋白选择适配体，经标记的rcotec蛋白包括但不限于经his标记的rcotec蛋白。
127.在一些实施方案中，针对经标记的重组艰难梭菌蛋白选择适配体，经标记的重组艰难梭菌蛋白包括但不限于经his标记的艰难梭菌蛋白。同样可使用本领域中通常用于有助于蛋白质纯化的其他蛋白质标签。
128.在一些实施方案中，针对整个艰难梭菌芽孢选择适配体。因此，在一些实施方案中，适配体选择性地与艰难梭菌芽孢结合。
129.在一个实施方案中，适配体与艰难梭菌cota蛋白中的表位特异性结合。
130.在一个实施方案中，适配体与艰难梭菌cote蛋白中的表位特异性结合。
131.在一个实施方案中，适配体与艰难梭菌cdec蛋白中的表位特异性结合。
132.在一个实施方案中，适配体与艰难梭菌cdem蛋白中的表位特异性结合。
133.在一个实施方案中，适配体与艰难梭菌cotec壳多糖酶蛋白中的表位特异性结合。
134.如果适配体以优先或高亲和力与靶蛋白结合但不结合或仅以低亲和力与其他结构相关分子(例如枯草芽孢杆菌芽孢)结合，则该适配体与如本文中限定的靶标“特异性”结合。在一些实施方案中，靶蛋白的解离常数在微摩尔范围内。在一些实施方案中，靶蛋白的解离常数在纳摩尔范围内。在一些实施方案中，靶蛋白的解离常数在皮摩尔范围内。在一些实施方案中，解离常数为约0.1nm或更小。在一些实施方案中，解离常数为约0.1nm至约1nm。在一些实施方案中，解离常数为约1nm至约10nm。在一些实施方案中，解离常数为约10nm至约100nm。在一些实施方案中，解离常数为约100nm至约1000nm。较低亲和力结合可指以比与靶蛋白更低的亲和力发生的结合。较低亲和力结合可选自与靶蛋白的结合的小于1倍至2倍、小于2倍至5倍、小于5倍至10倍、小于10倍至50倍、小于50倍至100倍、小于100倍至1000倍、小于1000倍至10000倍、或小于10000倍至100000倍的范围。
135.适配体
136.本文中所述的适配体是能够以高亲和力和特异性与如本文中限定的靶标特异性结合的小的人工配体，包括dna、rna或其修饰物。
137.本文中使用的“适配体”、“核酸分子”或“寡核苷酸”可互换使用以指对如本文中限定的靶标具有期望作用的非天然存在的核酸分子。
138.在一些实施方案中，适配体可以是dna适配体。例如，适配体可由单链dna(single-stranded dna，ssdna)形成。在一些实施方案中，适配体可以是rna适配体。例如，适配体可由单链rna(single-stranded rna，ssrna)形成。
139.在一些实施方案中，提供了包含选自如表3中所示的核酸序列的核酸序列的适配体。
140.表3-适配体序列
[0141][0142][0143]
引物区以粗体和斜体表示：
[0144]
表4
[0145]
[0146]
[0147][0148]
在一些实施方案中，适配体是rna适配体并且包含这样的序列：其中在seq id no：1至14和seq id no：23至26中所示的任何序列中的一个或一些或所有脱氧核糖核苷酸被替换为其等同核糖核苷酸残基amp、gmp、ump或cmp。
[0149]
本发明的一些实施方案的适配体可包含经修饰的如本文中所述的核酸。
[0150]
在一些实施方案中，使用本领域已知的体外选择原理制备本发明的适配体，所述原理包括靶标结合的迭代循环、靶标结合序列的分配和优先扩增。可使用固定化靶蛋白进行选择。固定化可包括但不限于固定至固体表面。在一个非限制性实例中，固体表面可以是珠。在一个非限制性实例中，固体表面可以是磁珠。
[0151]
扩增方法的一些非限制性实例包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、连接扩增(或连接酶链式反应(ligase chain reaction)，lcr)、链置换扩增、基于核酸序列的扩增和基于使用q-β复制酶的扩增方法。在一个非限制性实施方案中，至少一种类型的适配体可在扩增期间固定化在固体表面上。这些示例性方法中的每一种在本领域中均是公知的。
[0152]
在一些实施方案中，适配体选自核酸分子文库，例如单链dna或rna核酸分子文库。适配体可选自“通用适配体选择文库”，该文库被设计为使得任何所选择的适配体几乎不需要至不需要适应就能转换成任何列出的测定格式。
[0153]
一旦被选择，适配体可在被使用之前被进一步修饰，例如，以除去一个或两个引物序列和/或靶标结合不需要的随机序列的部分。
[0154]
通常，本发明一些实施方案的适配体包含第一引物区(例如在5’末端)、第二引物区(例如在3’末端)或二者。引物区可作为引物结合位点用于文库和选择的适配体的pcr扩增。
[0155]
技术人员将理解，不同的引物序列可根据例如起始文库和/或适配体选择方案来选择。在一些实施方案中，引物包含seq id no：21和/或22的核酸序列或者由seq id no：21和/或22的核酸序列组成。在一个实施方案中，适配体可包含seq id no：21和/或22。在另一些实施方案中，由seq id no：21或22公开的核苷酸中的一个至所有中的任一个均可被修饰。引物区长度也可变化。
[0156]
在一些实施方案中，引物在表5中示出：
[0157]
表5
[0158]
ccagtgtagactactcaatgc(引物)seq id no：21gtactatccacaggtcaacc(引物)seq id no：22
[0159]
第一引物区和/或第二区可包含如本文中所述的可检测标记。本文中使用的术语“可检测标记”和“可检测部分”可互换使用。在一个实施方案中，第一和/或第二引物区可被荧光标记。荧光标记的一些非限制性实例包括但不限于荧光素、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等。在一个实施方案中，使用荧光素标记。在一些实施方案中，可使用检测引物的其他形式，包括但不限于磷酸根(po4)标记、同位素标记、电化学传感器、比色生物传感器等。
[0160]
在一些实施方案中，本发明的适配体包含选自seq id no：1至14中任一个的核酸序列或者由选自seq id no：1至14中任一个的核酸序列组成。
[0161]
在一些实施方案中，本发明的适配体包含以下或由以下组成：与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的核酸序列。
[0162]
本文中使用的“序列同一性”是指在比对序列并且如果需要的话引入空位以实现最大序列百分比同一性之后候选序列中与所述序列中核苷酸相同的核苷酸的百分比。出于确定百分比核酸序列同一性的目的，可以以本领域技术范围内的多种方式来实现比对，例如，使用可公开获得的计算机软件例如blast、blast-2、align、clustalw或megalign(dnastar)软件。例如，可使用欧洲生物信息学研究所(european bioinformatics institute)网站(www.ebi.ac.uk)上发现的序列比较计算机程序生成％核酸序列同一性值。
[0163]
如本文中使用的，当描述核酸例如适配体的百分比同一性时，其序列与参考核苷酸序列有至少例如约90％同一性，这意指除了核酸序列可包含参考核酸序列的每100个核苷酸最多十个点突变(例如替换、缺失、插入)之外，核酸序列与参考序列相同。这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或者那些5’或3’末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或散布在参考序列内的一个或更多个连续组中。
[0164]
在一些实施方案中，适配体包含seq id no：1至14或seq id no：23至26的最小有效片段、基本上由seq id no：1至14或seq id no：23至26的最小有效片段组成或者由seq id no：1至14或seq id no：23至26的最小有效片段组成。本文中，“最小有效片段”被理解为意指能够与全长适配体相比以相同或改善的亲和力与如本文中限定的靶标结合的全长适配体的片段(例如部分)。最小有效片段可与全长适配体竞争结合如本文中限定的靶标。
[0165]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：如seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的序列中任一个的至少20个连续核酸残基，并且适配体显示出与靶分子的等同或改善的结合。在一些实施方案中，本发明的适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：如seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的序列中任一个的至少20个连续核酸残基，并且适配体显示出与靶分子的充分结合。充分结合包括以如本文中所述的亲和力和特异性发生的与靶分子的结合，或结合的亲和力和/或特异性低于上述全长适配体序列但仍能够递送其各自靶标的存在的报告。
[0166]
在一些实施方案中，本发明的适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：如seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一者所示的序列中任一个的至少25个连
续核苷酸。
[0167]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：1的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：1的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0168]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：2的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：2的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0169]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：3的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：3的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0170]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：4的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：4的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0171]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：5的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：5的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0172]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：6的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：6的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0173]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：7的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：7的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0174]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：8的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：8的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0175]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：9的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：9的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0176]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：10的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：10的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0177]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：11的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：11的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0178]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：12的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：12的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0179]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：13的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81个核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：13的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个
核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0180]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：14的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：14的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0181]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：23的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：23的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0182]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：24的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：24的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0183]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：25的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：25的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0184]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：seq id no：26的核酸序列中的25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个连续核苷酸。适配体可包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：来自seq id no：26的任何跨度的连续核苷酸，其中该跨度具有从25个核苷酸至全长以一个核苷酸增量选择的长度。
[0185]
在一些实施方案中，这些序列涉及与全长适配体相比与如本文中所述的靶蛋白具有等同、合适或改善的结合的适配体片段。
[0186]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、60或更多个连续核苷酸的核酸序列。在此上下文中，术语“约”通常意指参考核苷酸序列长度加上或减去该参考长度的10％。
[0187]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少85％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少85％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少85％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少85％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适
配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少85％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0188]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少90％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少90％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少90％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少90％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少90％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0189]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少95％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少95％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少95％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少95％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少95％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0190]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少96％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少96％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少96％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少96％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少96％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0191]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少97％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少97％或更高同一
性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少97％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少97％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少97％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0192]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少98％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq 1d no：23具有至少98％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少98％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少98％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少98％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0193]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：1至14中任一个具有至少99％或更高同一性的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：23具有至少99％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：24具有至少99％或更高同一性的序列的至少约25、30或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：25具有至少99％或更高同一性的序列的至少约25、30、35、40或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含与seq id no：26具有至少99％或更高同一性的序列的至少约25、30、35或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0194]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含含有seq id no：1至14中任一个的序列的至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0195]
在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含含有seq id no：23的序列的至少约30个或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含含有seq id no：24的序列的至少约30个或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含含有seq id no：25的序列的至少约30个或更多个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，适配体包含以下、基本上由以下组成或者由以下组成：包含含有seq id no：26的序列的至少约30个或更多个连续核苷酸的核酸序列。
[0196]
适配体可包含天然或非天然核苷酸和/或碱基衍生物(或其组合)。在一些实施方案中，适配体包含一种或更多种修饰，使得其包含除了脱氧核糖、核糖、磷酸、腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)之外的化学结构。适配体可在核碱基、糖或磷酸骨架上进行修饰。
[0197]
在一些实施方案中，适配体包含一种或更多种经修饰的核苷酸。一些示例性的修饰包括例如包含烷基化、芳基化或乙酰化、烷氧基化、卤化、氨基或其他官能团的核苷酸。经修饰的核苷酸的一些实例包括但不限于用于rna适配体的2
’‑
氟核糖核苷酸、2
’‑
nh
2-、2
’‑
och
3-和2
’‑
o-甲氧基乙基核糖核苷酸。
[0198]
适配体可以是全部或部分硫代磷酸酯或dna、二硫代磷酸酯或dna、硒代磷酸酯或dna、二硒代磷酸酯或dna、锁核酸(locked nucleic acid，lna)、肽核酸(peptide nucleic acid，pna)、n3
’‑
p5’氨基磷酸酯rna/dna、环己烯核酸(cyclohexene nucleic acid，cena)、三环dna(tcdna)或镜像适配体(spiegelmer)，或氨基磷酸酯吗啉(phosphoramidate morpholine，pmo)组分或本领域技术人员已知的任何其他修饰(也参见chan et al.，clinical and experimental pharmacology and physiology(2006)33，533-540)。
[0199]
一些修饰可使适配体针对核酸切割酶稳定化。在适配体的稳定化中，通常可在适配体的后续修饰与已经修饰的rna/dna的选择之间进行区分。稳定化可不影响经修饰的rna/dna适配体的亲和力，但可防止适配体在生物体、生物溶液或溶液中被rna酶/dna酶快速分解。如果适配体在样品(例如生物介质、生物体、溶液)中的半衰期大于一分钟、大于一小时或大于一天，则该适配体被称为稳定化的。适配体可用报道分子进行修饰，这可能够使得检测标记的适配体。报道分子也可有助于提高适配体的稳定性。
[0200]
适配体形成取决于其核酸序列的三维结构。适配体的三维结构可由于沃森(watson)和克里克(crick)分子内碱基配对、hoogsteen碱基配对(四链体)、摆动对形成或其他非典型碱基相互作用而出现。在一些实施方案中，三维结构使适配体(类似于抗原-抗体结合)能够准确地结合靶结构。适配体的核酸序列在限定的条件下可具有对限定的靶结构具有特异性的三维结构。
[0201]
一些实施方案包括与如本文中所述的适配体竞争结合如本文中限定的靶蛋白的竞争性适配体。一些实施方案包括与以下适配体竞争结合如本文中限定的靶蛋白的竞争性适配体：所述适配体示于seq id no：1至14或seq id no：23至26中的任一个，或者具有与seq id no：1至14或seq id no：23至26中任一个的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。一些实施方案包括与一种或更多种上述适配体竞争结合如本文中限定的靶蛋白的竞争性的一种或更多种适配体。在一些实施方案中，可使用竞争测定来鉴定竞争结合如本文中限定的靶蛋白的竞争性适配体。在一个示例性的非限制性竞争测定中，将固定化的如本文中限定的靶蛋白在包含与如本文中限定的靶蛋白结合的第一经标记适配体和测试其与第一适配体竞争结合如本文中限定的靶蛋白的能力的第二未经标记适配体的溶液中孵育。作为对照，可将固定化的如本文中限定的靶蛋白在包含第一经标记适配体但不包含第二未经标记适配体的溶液中孵育。在允许第一适配体与如本文中限定的靶蛋白结合的条件下孵育之后，可除去过量的未结合的适配体，并测量与固定化的如本文中限定的靶蛋白缔合的标记的量。如果相对于对照样品，受试样品中与固定化的如本文中限定的靶标缔合的标记的量显著降低，则
指示第二适配体与第一适配体竞争结合如本文中限定的靶蛋白。
[0202]
支持物
[0203]
在一些实施方案中，靶肽或靶蛋白附着于支持物。在一个非限制性实例中，支持物可以是固体支持物。固体支持物的一些非限制性实例包括膜或珠。在一些实施方案中，支持物可以是二维支持物。二维支持物的一个非限制性实例是微板。在一些实施方案中，支持物可以是三维支持物。三维支持物的一个非限制性实例是珠。在一些实施方案中，支持物可包含至少一种磁珠。
[0204]
在一些实施方案中，蛋白质在其n端或c端包含多组氨酸标签(his标签)标签(例如六-组氨酸标签)。例如，蛋白质可以是在其c端或其n端具有组氨酸残基的重组蛋白。在一些实施方案中，可将经his标记的蛋白质固定在携带组氨酸结合剂的支持物上。例如，可将经his标记的蛋白质固定在具有镍-次氮基三乙酸(ni-nta)的支持物上。
[0205]
在一些实施方案中，支持物可包含至少一种纳米粒。纳米粒的一个非限制性实例是金纳米粒等。在另一些实施方案中，支持物可包括微量滴定板或其他测定板、条、薄膜、膜、凝胶、芯片、微粒、纳米纤维、纳米管、胶束、微孔、纳米孔或生物传感器表面。在一些实施方案中，生物传感器表面可以是探针尖端表面、生物传感器流动通道或类似物。
[0206]
在一些实施方案中，支持物包括膜。膜的一些非限制性实例包括硝酸纤维素、聚乙烯(pe)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚丙烯(pp)、乙酸纤维素(ca)、聚丙烯腈(pan)、聚酰亚胺(pi)、聚砜(ps)、聚醚砜(pes)膜或者包含氧化铝(al2o3)、氧化硅(sio2)和/或氧化锆(zro2)的无机膜。可制成支持物的材料的一些非限制性实例包括无机聚合物、有机聚合物、玻璃、有机和无机晶体、矿物、氧化物、陶瓷、金属，尤其是贵金属、碳和半导体。在一个实施方案中，有机聚合物是基于聚苯乙烯的聚合物。支持物中的聚合物可以是生物聚合物，包括但不限于纤维素、葡聚糖、琼脂、琼脂糖和sephadex，其可被官能化，特别是被官能化为硝酸纤维素或溴化氰sephadex。
[0207]
可检测标记
[0208]
在一些实施方案中，本发明的适配体用于检测和/或量化样品中如本文中限定的靶标的量。通常，适配体包含可检测标记。任何能够促进适配体的检测和/或量化的标记均可在本文中使用。下文描述了可检测标记的一些非限制性实例。
[0209]
在一些实施方案中，可检测标记是荧光部分，例如荧光化合物。在一些实施方案中，适配体包含荧光和猝灭剂化合物。荧光和猝灭剂化合物是本领域已知的。例如，参见mary katherine johansson，methods in molecular biol.335：fluorescent energy transfer nucleic acid probes：designs and protocols，2006，didenko编辑，humana出版，totowa，nj，以及marras et al.，2002，nucl.acids res.30，el22(通过引用并入本文)。
[0210]
在一些实施方案中，可检测标记是fam。在一些实施方案中，fam-标记与适配体的5’端或3’端缀合。本领域普通技术人员将理解标记可位于适配体中的任何合适位置。
[0211]
在一些实施方案中，适配体在其5’端包含fam荧光团。在一些实施方案中，适配体是通过将亚磷酰胺一次一个地并入到核酸链中来合成的，并且经fam标记的亚磷酰胺是通过合成过程并入的。在一些实施方案中，fam荧光团通过接头连接在适配体的5’端。在一些实施方案中，可检测标记通过选自硫醇基、胺基、叠氮化物、六碳接头和氨基烯丙基及其组合的部分与本文中所述的适配体连接。在一些实施方案中，可使用在5’端具有fam的正向引
物将fam标记并入到适配体中。在一些实施方案中，适配体可在fam标记已就位(如在引物中那样连接到5’端)的情况下通过固相合成来制备。
[0212]
当彼此接近时导致可检测信号提高的部分也可在本文中使用，例如，作为荧光共振能量转移(“fluorescence resonance energy transfer，fret”)的结果；合适的配对包括但不限于荧光素和四甲基罗丹明、罗丹明6g和孔雀石绿、以及fitc和缩氨基硫脲(thiosemicarbazole)，仅举数个实例。
[0213]
在一些实施方案中，可检测标记是选自以下非限制性实例中至少一种的部分和/或包含选自以下非限制性实例中至少一种的部分：荧光团、纳米粒、量子点、酶、放射性同位素、预定义序列部分、生物素、脱硫生物素、硫醇基、胺基、叠氮化物、氨基烯丙基、地高辛配基、抗体、催化剂、胶体金属颗粒、胶体非金属颗粒、有机聚合物、胶乳颗粒、纳米纤维、纳米管、树枝状聚合物、蛋白质和脂质体。
[0214]
在一些实施方案中，可检测标记是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)或本领域技术人员已知的任何其他荧光蛋白。
[0215]
在一些实施方案中，可检测标记是酶。例如，酶可选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、β-半乳糖苷酶或本领域技术人员已知的任何其他酶。
[0216]
在一些实施方案中，检测的性质将取决于所使用的可检测标记。例如，标记可借助于其颜色来检测，例如金纳米颗粒。颜色可通过光学读取器或相机(例如，有成像软件的相机)定量检测。
[0217]
在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记，例如量子点。在这样的实施方案中，检测手段可包括荧光板读取器、条读取器或类似物，其被配置以记录荧光强度。
[0218]
在其中可检测标记是酶标记的一些实施方案中，非限制性检测手段可以是例如比色法、化学发光法和/或电化学法(包括但不限于使用电化学检测器)。电化学传感可通过将氧化还原报道子(包括但不限于亚甲蓝或二茂铁)与适配体的一端缀合并将传感器表面与另一端缀合。靶标结合后适配体构象的变化可改变报道子与传感器之间的距离以提供读出。
[0219]
在一些实施方案中，可检测标记还可包含酶，包括但不限于辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(app)或类似物，以催化转换底物以给出放大的信号。
[0220]
一些实施方案包括包含本发明的适配体和可检测分子的复合体(例如缀合物)。通常，本发明的适配体与可检测分子共价或物理缀合。
[0221]
在一些实施方案中，可检测分子是视觉、光学、光子、电子、声学、光声、质量、电化学、电光、谱学、酶或其他物理、化学或生物化学可检测的标记。
[0222]
在一些实施方案中，可检测分子通过发光、uv/vis光谱术、酶促、电化学或放射性来检测。发光是指光的发射。例如，光致发光、化学发光和生物发光用于检测标记。在光致发光或荧光中，激发通过吸收光子而发生。一些示例性荧光团包括但不限于二苯并咪唑、荧光素、吖啶橙、cy5、cy3或碘化丙啶，其可与适配体共价偶联，四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、德克萨斯红(texas red，tr)、罗丹明、alexa fluor染料(等来自不同公司的不同波长的荧光染料)。
[0223]
在一些实施方案中，可检测分子是具有信号产生物质的胶体金属颗粒(包括但不限于金纳米粒)、胶体非金属颗粒、量子点、有机聚合物、胶乳颗粒、纳米纤维(碳纳米纤维，
作为一个非限制性实例)、纳米管(碳纳米管，作为一个非限制性实例)、树枝状聚合物、蛋白质或脂质体。可用比色法检测胶体颗粒。
[0224]
在一些实施方案中，可检测分子是酶。在一些实施方案中，酶可将底物转化为有色产物。酶的一些实例包括但不限于过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶。例如，无色底物x-gal通过β-半乳糖苷酶的活性被转化为蓝色产物，其颜色可视觉检出。
[0225]
在一些实施方案中，检测分子是放射性同位素。检测也可通过标记适配体的放射性同位素来进行，放射性同位素包括但不限于3h、
14
c、
32
p、
33
p、
35
s或
125
i。在一个实施方案中，可进行闪烁计数，并因此间接测量由经放射性标记的适配体靶标复合体发射的放射性辐射。闪烁体物质由同位素的放射性发射激发。在闪烁物质转变回基态期间，激发能量作为由光电倍增管放大和计数的闪光再次释放。
[0226]
在一些实施方案中，可检测分子选自地高辛配基和生物素。因此，适配体也可用例如被抗体或链霉亲和素结合的地高辛配基或生物素标记，抗体或链霉亲和素转而可携带标记，例如酶缀合物。适配体与酶的预先共价连接(缀合)可以以数种已知方式完成。适配体结合的检测也可通过在ria(放射性免疫测定)中用放射性同位素，优选用
125
i标记适配体来实现，或者通过在fia(荧光免疫测定)中用荧光团，优选用荧光素或异硫氰酸荧光素(fitc)的荧光来实现。
[0227]
一些实施方案包括用于检测样品中如本文中限定的靶标的存在、不存在或量的方法。在这些方法中，样品可与如本文中所述的适配体相互作用(即接触)。例如，样品和如本文中所述的适配体可在足以使适配体的至少一部分与样品中如本文中限定的靶标结合的条件下孵育。
[0228]
本领域技术人员将理解在本文中所述的适配体与如本文中限定的靶标之间发生结合所需的条件。在一些实施方案中，样品和适配体可在约4℃至约40℃的温度下孵育。在一些实施方案中，样品和适配体可在约20℃至约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，样品和适配体可在22℃或约22℃下孵育。孵育温度可选自4℃至低于20℃、20℃至低于22℃、22℃至低于24℃、24℃至低于26℃、26℃至低于28℃、28℃至低于30℃、30℃至低于32℃、32℃至低于34℃、34℃至低于36℃、36℃至37℃、和37℃至40℃的范围。在一些实施方案中，可用缓冲剂(示例性缓冲剂包括但不限于pbs)将样品和适配体稀释至不同浓度(例如至少约1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％v/v或更多)。稀释浓度可选自1％至小于5％、5％至小于10％、10％至小于20％、20％至小于30％、30％至小于40％、40％至小于50％、50％至小于60％、60％至小于70％、70％至小于80％、或80％至小于90％的范围。在一些实施方案中，在稀释之前的适配体浓度可以是100nm至50μm。在一些实施方案中，在稀释之前的适配体浓度可选自100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至2μm、2μm至5μm、5μm至10μm、10μm至15μm、15μm至20μm、20μm至30μm、30μm至40μm、40μm至50μm、50μm至60μm、60μm至70μm、70μm至80μm、80μm至90μm、90μm至100μm的范围。在一些实施方案中，在稀释之前的适配体浓度可以是选自本文中所述范围的浓度。所选择的值可选自本文范围中的0.1μm增量浓度。在一些实施方案中，在稀释之前的适配体浓度可以是2μm。在一些实施方案中，样品和适配体可在摇动和/或混合的同时孵育。在一些实施方案中，将样品和适配体孵育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少1小时或更长。可将样品和适配体孵育1分钟至小于5分钟、5分钟至小于15分钟、15分钟至小于1小时、1小时至小于24小时、24小时至小于48小时。
[0229]
在一些实施方案中，适配体和如限定的靶标的结合导致适配体-靶标复合体的形成。结合或结合事件可例如如本文中所述视觉、光学、光子、电子、声学、光声、通过质量、电化学、电光学、谱学、酶促或在其他情况下化学、生物化学或物理学检测。
[0230]
适配体和靶标的结合可使用任何合适的技术来检测。如上所述，例如，适配体和靶标的结合可使用生物传感器来检测。在一些实施方案中，适配体与靶标的结合是使用如本文中所述的spr、rlfs、bli、lfd或elona的非限制性实例来检测的。
[0231]
在一些实施方案中，适配体可使用生物素基团附着至生物传感器的表面。在一些实施方案中，生物素基团连接在适配体的5’端或3’端。在一些实施方案中，生物传感器的表面具有附着于其上的亲和素/链霉亲和素，并且适配体固定至生物传感器的表面是通过生物素-亲和素相互作用。在一些实施方案中，将生物传感器的表面用亲和素/链霉亲和素包被。
[0232]
试剂盒
[0233]
一些实施方案还提供了用于检测和/或量化艰难梭菌的试剂盒，其中该试剂盒包含一种或更多种如本文中所述的适配体。通常，试剂盒还包含如本文中所述的可检测分子。
[0234]
一些实施方案提供了还包含如本文中所述的光源的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒还可包含如本文中所述的带通滤光片。在一个实施方案中，试剂盒可包含如本文中所述的观察护目镜或眼镜等。在一些实施方案中，试剂盒包含：
[0235]
a)包含适配体的溶液，该适配体具有与其缀合的检测分子，例如能够以约485至515nm的波长发射的荧光团。在一些实施方案中，荧光团能够以约490至505nm的波长发射。在一个实施方案中，荧光团能够以约505nm的波长发射；
[0236]
b)光源。在一些实施方案中，光源产生具有约485至515nm波长的光。在一个实施方案中，光源产生具有约490至505nm波长的光；
[0237]
c)带通滤光片。在一个实施方案中，带通滤光片是590nm带通滤光片；以及
[0238]
d)观察护目镜。在一个实施方案中，观察护目镜是橙色观察护目镜。
[0239]
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于根据本文中所述的任何方法使用的说明书。
[0240]
试剂盒还可包含用于由试剂盒预期的反应或待进行的方法的组分，例如用于富集、分开和/或分离程序的预期检测的组分。一些非限制性实例包括缓冲溶液、用于颜色反应的底物、染料或酶底物。在试剂盒中，适配体可以以多种形式提供，包括但不限于预固定化在支持物(例如固体支持物)上、冷冻干燥或在液体介质中。
[0241]
本文中的试剂盒可用于进行本文中所述的任何方法。应当理解，试剂盒的各部分可单独包装在小瓶中或组合包装在容器或多容器单元中。通常，试剂盒的制造遵循本领域技术人员已知的标准程序。
[0242]
用途
[0243]
在一些实施方案中，提供了使用本文中所述的适配体检测艰难梭菌，例如艰难梭菌芽孢的方法。该方法可包括使样品与本文中所述的适配体相互作用并检测艰难梭菌的存在、不存在和/或量。该方法可用于使用检测方法检测样品中艰难梭菌芽孢的存在、不存在和/或量，所述检测方法包括但不限于光子检测、电子检测、声学检测、电化学检测、电光检测、酶促检测、化学检测、生物化学检测或物理检测。
[0244]
在一些实施方案中，该方法用于检测表面上艰难梭菌，例如艰难梭菌芽孢的存在、不存在或量。在一些实施方案中，所提供的适配体和方法可用于检测医院和保健机构中表面上的艰难梭菌。表面的一些非限制性实例可包括床上用品、医疗设备、衣服、地板、墙等。在一个非限制性实例中，本发明的适配体可用于检测患者身体上艰难梭菌，例如艰难梭菌芽孢的存在、不存在和/或量。
[0245]
在一些实施方案中，适配体可用于检测预先从如本文中所述的表面获得的样品中的艰难梭菌，例如艰难梭菌芽孢。
[0246]
在一些实施方案中，本发明的适配体可用于检测完整的艰难梭菌芽孢。在一些实施方案中，适配体可用于检测如本文中所述的艰难梭菌蛋白。
[0247]
在一些实施方案中，适配体可用于实时检测艰难梭菌芽孢或蛋白质。在检测和/或量化艰难梭菌之后，可采取行动杀伤和/或除去芽孢。这样的行动的一些非限制性实例可包括洗涤或破坏床上用品，和/或清洁表面，包括但不限于医疗设备、床、墙、地板等。还可采取措施例如隔离患者和执行严格的卫生规程。
[0248]
在一些实施方案中，本发明的适配体用于使用光源检测艰难梭菌芽孢的存在或不存在的方法。在某些实施方案中，提供了检测艰难梭菌芽孢的存在或不存在的方法，其包括：
[0249]
a)提供包含本文中所述适配体的适配体缀合物，其中适配体与可检测部分缀合。在一个实施方案中，可检测部分是荧光部分；
[0250]
b)使适配体缀合物与目的位置接触，其中目的位置可能包含艰难梭菌芽孢；
[0251]
c)将适配体缀合物在目的位置处孵育预定时间，以允许适配体缀合物与艰难梭菌芽孢(如果存在的话)结合；
[0252]
d)任选地洗涤目的位置以除去任何未结合的适配体缀合物；以及
[0253]
e)使与艰难梭菌芽孢结合的适配体缀合物可视化。
[0254]
在一些实施方案中，该位置包括表面。在一些实施方案中，该位置包括人例如患者身体，或者从怀疑患有或被诊断患有艰难梭菌感染的对象获得的样品。在一些实施方案中，该位置包括位于医院环境中的物体。
[0255]
在一些实施方案中，使适配体缀合物可视化包括用光源照射该位置。在一些实施方案中，光源产生预定波长的光，其中预定波长对应于由适配体缀合物中可检测部分发射的光的波长。
[0256]
在一些实施方案中，使位置可视化的步骤可在环境光或在黑暗条件下进行。
[0257]
在一些实施方案中，该方法还包括过滤由光源产生的光。
[0258]
在一些实施方案中，该方法还包括对该位置进行成像(例如拍摄)并检测艰难梭菌芽孢的存在或不存在。
[0259]
在一些实施方案中，检测艰难梭菌的方法可包括将一种或更多种本发明的适配体施加至怀疑包含艰难梭菌芽孢的位置。在足以允许适配体与艰难梭菌芽孢结合的预定时间之后，可将该位置洗涤一次或更多次以除去任何未结合的适配体。随后，该方法可包括用于使用光源照射该位置的一组条件。在一个实施方案中，光源可以是法医光源的形式。在一个实施方案中，光源可以是flare的形式。
[0260]
在一些实施方案中，光源可以能够在不同波长之间切换，每种波长适合于特定的
可互换滤光片。法医光源可以是led、激光、等的形式。在一些实施方案中，光源是手持式光源。在一个实施方案中，手持式光源可以是从例如rofin forensic获得的polilight flare 2，其是电池供电的手持式led光源。
[0261]
适当地，每个polilight flare“手电筒”可产生在指定波长范围内的光。例如，在一些实施方案中，光源可在约360nm至385nm波长处产生光(uv光)。在一些实施方案中，光源可在约405nm至420nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约435nm至465nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约485nm至515nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约490nm至505nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约510nm至545nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约530nm至560nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约585nm至605nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约615nm至635nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约400nm至700nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约835nm至865nm波长处产生光。在一些实施方案中，光源可在约935nm至965nm波长处产生光。
[0262]
在一些实施方案中，使用的光源可与与适配体缀合的可检测分子相容。在一些实施方案中，适配体与检测分子缀合。在一些实施方案中，检测分子可以是在对应于光源输出的光谱范围内发射的荧光团。在一些实施方案中，适配体可与在约505nm波长处发射的荧光团缀合。在一些实施方案中，光源产生具有约505nm波长的光。
[0263]
在一些实施方案中，该方法可包括将带通滤光片与光源组合使用。带通滤光片可被配置为透射特定波长带的光并且拒绝在预定波长带之外的杂散光。在一些实施方案中，光源被配置为产生具有365nm、415nm、450nm、505nm、530nm、545nm、620nm和850nm的中心波长的窄光带。在一些实施方案中，光源被配置成产生除了白光波长之外还具有505nm的中心波长的窄光带。在一些实施方案中，带通滤光片是590nm带通滤光片。
[0264]
在一些实施方案中，该方法还可包括用观察护目镜、眼镜等来使位置可视化。在一些实施方案中，观察护目镜的颜色对应于由光源产生并由与适配体缀合的检测分子发射的光的颜色。在一些实施方案中，护目镜是橙色的并且因此适合于与产生波长为约485nm至515nm例如505nm的光的光源和包含在约505nm波长处发射的检测分子的适配体组合使用。
[0265]
在一个方面中，本发明涉及与艰难梭菌结合的适配体及其使用方法的开发。在一个方面中，本发明涉及与艰难梭菌芽孢特异性结合的适配体。适配体可与艰难梭菌蛋白，例如表面蛋白特异性结合。与适配体结合的分子可称为靶分子。本文中提供了靶分子的另外的细节。
[0266]
出乎意料的是，本发明人已鉴定出能够鉴定艰难梭菌芽孢的适配体。
[0267]
在一些实施方案中，本发明提供了能够与艰难梭菌蛋白特异性结合的适配体。
[0268]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是艰难梭菌芽孢的表面蛋白。在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是芽孢衣壳表面蛋白或芽孢外壁层蛋白。
[0269]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白选自cdec、cdem、cota、cote和cote壳多糖酶。
[0270]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是具有如seq id no 18所示的氨基酸序列的cdec蛋白。
[0271]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是具有如seq id no：19所示的氨基酸序列的cdem蛋白。
[0272]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是具有如seq id no：15所示的氨基酸序列的cota蛋白。
[0273]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是具有如seq id no：16所示的氨基酸序列的cote蛋白。
[0274]
在一些实施方案中，艰难梭菌蛋白是具有如seq id no：17所示的氨基酸序列的cote壳多糖酶蛋白。
[0275]
在一些实施方案中，适配体包含以下或由以下组成：
[0276]
a)选自如seq id no：1至14中任一者所示的核酸序列中的任一个的核酸序列；
[0277]
b)与如seq id no：1至14中任一者所示的核酸序列中任一个核酸序列具有至少85％、例如90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；
[0278]
c)具有如seq id no：1至14中任一者所示的核酸序列中任一个的至少约30个连续核苷酸的核酸序列；
[0279]
d)具有与seq id no：1至14中任一个具有至少85％同一性的序列的至少约30个连续核苷酸的核酸序列；
[0280]
e)具有从seq id no：5的第28位延伸至第64位(也称为seq id no：23)的片段的核酸序列；或者
[0281]
f)具有从seq id no：5的第28位延伸至第64位(也称为seq id no：23)的片段的与seq id no：23具有至少85％同一性的核酸序列。
[0282]
在一些实施方案中，适配体是单链dna适配体。
[0283]
在一些实施方案中，提供了与如本文中所述的适配体竞争结合艰难梭菌蛋白的适配体。
[0284]
在一些实施方案中，适配体包含可检测标记。
[0285]
在一些实施方案中，可检测标记是选自以下的部分和/或包含选自以下的部分：荧光团、纳米粒、量子点、酶、放射性同位素、预定义序列部分、生物素、脱硫生物素、硫醇基、胺基、叠氮化物、氨基烯丙基、地高辛配基、抗体、催化剂、胶体金属颗粒、胶体非金属颗粒、有机聚合物、胶乳颗粒、纳米纤维、纳米管、树枝状聚合物、蛋白质和脂质体。在一些实施方案中，可检测标记是荧光团、量子点、胶体金属颗粒或胶体非金属颗粒。在一些实施方案中，可检测标记通过选自硫醇基、胺基、叠氮化物和氨基烯丙基及其组合的部分与本文中所述的适配体连接。
[0286]
在本发明的一个方面中，提供了复合体，其包含任何在先要求保护的适配体和可检测分子。
[0287]
在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种适配体的组合物，其中至少一种适配体是如本文中所述的，其中该组合物任选地包含水、盐、一种或更多种本文中的缓冲剂、洗涤剂和bsa中的至少一种。
[0288]
在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种适配体的组合物，该适配体具有如seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或23所示的核酸序列，其中该组合物任选地包含水、盐、一种或更多种本文中的缓冲剂、洗涤剂和bsa中的至少一种。
[0289]
在本发明的一个方面中，提供了包含如本文中所述的适配体的生物传感器或测试条。
[0290]
在本发明的一个方面中，提供了用于检测样品中艰难梭菌的存在、不存在或水平的装置，该装置包含：
[0291]
i.支持物；和
[0292]
ii.如本文中所述的适配体。
[0293]
在一些实施方案中，该装置用于检测样品中艰难梭菌芽孢的存在、不存在或水平。
[0294]
在一些实施方案中，样品选自：
[0295]
a)预先从怀疑患有或被诊断患有艰难梭菌感染的对象获得的样品；以及
[0296]
b)位于医院环境中的物体，例如床上用品、家具、建筑结构。
[0297]
在一些实施方案中，支持物是珠、微量滴定板或其他测定板、条、薄膜、膜、凝胶、芯片、微粒、纳米粒、纳米纤维、纳米管、胶束、微孔、纳米孔或生物传感器表面。
[0298]
在一些实施方案中，该装置适合于表面等离子体共振(spr)、生物层干涉术(bli)、侧流测定和/或酶联寡核苷酸测定(elona)。
[0299]
在本发明的一个方面中，提供了如本文中所述的适配体、复合体、生物传感器或测试条、组合物或装置用于检测、富集、分开和/或分离艰难梭菌的用途。在某些实施方案中，该用途是用于特异性检测、富集、分开和/或分离艰难梭菌芽孢。
[0300]
在本发明的一个方面中，提供了检测样品中艰难梭菌的存在、不存在或量的方法，该方法包括：
[0301]
i.使样品与如本文中所述的适配体、复合体或组合物相互作用；以及
[0302]
ii.检测艰难梭菌的存在、不存在或量。
[0303]
在一些实施方案中，该方法用于检测样品中艰难梭菌芽孢的存在、不存在或量。
[0304]
在一些实施方案中，艰难梭菌的存在、不存在或量通过光子检测、电子检测、声学检测、电化学检测、电光检测、酶促检测、化学检测、生物化学检测或物理检测来检测。
[0305]
在本发明的一个方面中，提供了用于检测和/或量化艰难梭菌的试剂盒，该试剂盒包含如本文中所述的适配体。
[0306]
实施例
[0307]
在下文中，将通过特定实施方案的非限制性实例更详细地解释本发明。在示例性实验中，使用无污染的标准试剂和缓冲液。
[0308]
实施例1-适配体选择
[0309]
靶标信息
[0310]
针对艰难梭菌的数种蛋白质靶标选择适配体。靶标如下：
[0311]
1.cdec，其为分子量(molecular weight，mw)为46,000da的蛋白质。储存在具有以下组成的缓冲液中：
[0312]
20mm hepes-na，ph 7.9，5％甘油，200mm nacl，0.2mm cacl2，0.1％triton x114
[0313]
浓度：0.75mg ml-1
[0314]
2.cdem，其为mw为25,000da的蛋白质。储存缓冲液：20mm hepes-na，ph 7.9，5％甘油，200mm nacl，0.2mm cacl2，0.1％triton x114
[0315]
浓度：0.50mg ml-1
[0316]
3.cdem，其为mw为25,000da的蛋白质。储存缓冲液：20mm hepes-na，ph 7.9，5％甘油，200mm nacl，0.2mm cacl2，0.1％triton x114
[0317]
浓度：0.50mg ml-1
[0318]
4.cota-his6，其为mw为34,900da的蛋白质，水中的ext.co：27695
[0319]
储存缓冲液：20mm hepes、5％甘油、200mm nacl、1mm dtt，浓度：4.17mg ml-1
[0320]
5.rcote，n281-f712，分子量：48,000da，
[0321]
储存缓冲液：20mm hepes-na，ph 7.9，5％甘油，200mm nacl，0.2mm cacl2，0.1％triton x114
[0322]
浓度：约0.8mg ml-1
[0323]
6.spg-hu58。非致病性芽孢。储存缓冲液：无菌dh2o
[0324]
浓度：在0.5ml无菌水中的1
×
107cfu纯芽孢
[0325]
适配体选择的准备
[0326]
使用nanodrop分别分析蛋白质靶标以产生一系列uv光谱，以确定靶标的浓度和聚集状态(数据未显示)。提供的cdec、cdem和cote的uv光谱分析显示出明显的聚集或多聚化的迹象。cota和cotec壳多糖酶显示出轻微的聚集迹象。认为一些蛋白质可多聚化。
[0327]
另外，用一组选择缓冲液对靶标进行“缓冲液筛选”。比较了适配体文库与固定有每种靶标的珠或空白珠的结合(数据未显示)。鉴定并选择促进了适配体文库与靶标之间较大相互作用的用于每种靶标的缓冲液以用于将来在选择过程中使用。
[0328]
一些非限制性的示例性缓冲液对于所有靶标可以是大致类似的。在一些实施方案中，缓冲液可以是tris缓冲液。在一些实施方案中，ph可以为约7.4至7.6。在一些实施方案中，离子强度可以为约100mm。包含在缓冲液中的盐的一些非限制性实例是mgcl2和cacl2。在一些实施方案中，缓冲液可包含洗涤剂，包括但不限于吐温。在一些实施方案中，缓冲液可包含牛血清白蛋白(bsa)或本领域已知的其他稳定剂。
[0329]
缓冲液如下：
[0330]
·
cdec-50mm tris ph 7.6、2.5mm mgcl2、2.5mm cacl2、85mm koac、0.01％吐温20、0.01％bsa。
[0331]
·
cdem-50mm tris ph 7.6、2.5mm mgcl2、2.5mm cacl2、85mm nacl、0.01％吐温20、0.01％bsa。
[0332]
·
cota-50mm tris ph 7.4、5mm mgcl2、1mm cacl2、77.5mm nacl、4.5mm kcl、0.01％吐温20、0.01％bsa。
[0333]
·
cote-50mm tris ph 7.6、2.5mm mgcl2、2.5mm cacl2、28mm k2so4、0.01％吐温20、0.01％bsa。
[0334]
·
rcote壳多糖酶-50mm tris ph 7.4、5mm mgcl2、1mm cacl2、77.5mm nacl、4.5mm kcl、0.01％吐温20、0.01％bsa。
[0335]
多克隆适配体选择
[0336]
选择方案大致如下：
[0337]
将经his标记的靶蛋白各自装载至经ni-nta包被的磁珠上并在pbs中孵育1小时。洗涤并量化装载的珠，并用于适配体选择。
[0338]
将适配体文库与各种靶标一起孵育一小时，并在室温下在如缓冲液筛选中鉴定和如上所示的选择缓冲液中不断混合。
[0339]
使用咪唑洗脱靶蛋白和结合的适配体。随后纯化回收的物质以除去咪唑并扩增以
创建用于后续选择轮次的富集文库。
[0340]
使用从一轮选择至下一轮提高严格性来重复该过程。
[0341]
在前期筛选中鉴定的缓冲液条件用于前两轮体外选择。随后的轮次使用多种不同的选择“压力”进行。来自每轮选择中最佳执行条件的群体被选择向前进行后续选择轮次。在选择期间回收的适配体的量被量化并在图6至10中示出。
[0342]
图6至10示出了来自靶标装载珠的适配体文库回收(蓝色，在每个数据集的左侧)，其随着选择轮次次序而逐渐提高。回收的任何下降通常与该轮选择期间引入的严格性提高相一致。对于靶标cota、cdec、cdem和cotec壳多糖酶在第7轮(r7)中并且对于靶标cote在r10中分别获得了最佳的靶标：阴性比例(来自靶标装载珠的回收vs.来自空白珠的回收)。随后将这些适配体群中的每种向前进行生物物理测定，以确定靶标结合物种的富集。
[0343]
生物物理表征
[0344]
生物层干涉术(bli)用于评估每个适配体群与其各自靶标的结合。将靶蛋白固定在单独的生物层干涉术传感器探针上。随后将装载的探针与初始适配体文库或各自的适配体群一起孵育，以监测和比较相互作用。
[0345]
bli是在室温下使用与选择期间使用的那些相同的缓冲液来进行的。bli探针在1
×
pbs中装载靶蛋白180秒。随后，将初始适配体文库或各自的适配体群孵育300秒。随后将适配体在选择缓冲液中解离300秒。
[0346]
结果在下文中在图11至15中呈现。
[0347]
图11至15示出了，与未经选择的初始文库相比经过本文中所述的适配体选择过程的精化适配体群整体上具有改善的与其各自靶标的结合(比其他更好的一些)。固定化靶标显示与未精化的初始适配体群的相互作用很低至没有。在固定化靶标与各自的精化适配体群之间观察到结合。对于固定化cota、cote和cotec壳多糖酶，观察到各自的适配体库的快速缔合(信号在约480至780秒处)。cdec和cdem二者的适配体库均显示出与其各自靶标的较慢缔合。结合的适配体群未显现出显示与其靶标的显著解离(信号在780至1080秒处)。
[0348]
芽孢选择
[0349]
使用艰难梭菌芽孢作为“阳性靶标”，将上述精化适配体群纳入“基于芽孢的选择”中。枯草芽孢杆菌芽孢用作“阴性靶标”(反选择)以降低与芽孢表面的非特异性结合。进行了随后四轮基于芽孢的选择(第s1至s4轮)。在这些选择轮次期间回收的适配体的量被量化并在图16至20中示出。
[0350]
在连续4轮基于芽孢的选择(s1至s4)之后；针对cota、cdec、cdem和cote选择的五个适配体群均显示与枯草芽孢杆菌芽孢(“阴性”)相比，与艰难梭菌芽孢(“阳性”)的结合增强。这表明在芽孢“衣壳”的背景下每个适配体群均进一步精化。
[0351]
选择性分布
[0352]
将针对重组cota、cdec、cdem、cote和cotec壳多糖酶分离并随后通过基于芽孢的选择进一步精化的精化适配体群荧光标记并与艰难梭菌芽孢或枯草芽孢杆菌芽孢一起孵育。通过洗涤除去未结合的物质，之后通过落射荧光显微术对芽孢进行成像。结果在图21至25中示出。
[0353]
图21至24显示，与枯草芽孢杆菌芽孢相比，四个分离的适配体群显示优先与艰难梭菌芽孢结合。这些适配体群分别包括cota、cdec、cdem和cote。
[0354]
结论
[0355]
报道的数据在以下示出：
[0356]
·
生物层干涉术显示，针对cota、cdec、cdem、cote和cotec壳多糖酶蛋白选择的精化适配体群与其各自的固定化靶标相互作用。相互作用是选择过程(不仅仅是通过非特异性结合)的结果，因为“初始”群未显示出这样的相互作用。
[0357]
·
落射荧光显微术显示，与枯草芽孢杆菌芽孢相比，四个适配体群优先与艰难梭菌芽孢结合。这些适配体群是针对cota、cdec、cdem和cote进行分离的，并且随后通过基于芽孢的选择使用艰难梭菌芽孢(“阳性”)和枯草芽孢杆菌芽孢(“阴性”)进行精化。
[0358]
·
针对cotec壳多糖酶分离的适配体群显示在3轮基于芽孢的选择之后与艰难梭菌和枯草芽孢杆菌芽孢二者结合。在第4轮基于芽孢的选择之后，未看到针对艰难梭菌的结合。
[0359]
实施例2-单克隆适配体的分离
[0360]
将精化的库(在图21至25中表征)用于单克隆分离。所有适配体均经过纯化(在洗脱之后)，重悬并储存在水中。在用于选择或结合测定之前，适配体在终浓度1
×
缓冲液中稀释。通过bli使用0.5μm、1μm或2μm的适配体浓度分离并筛选单独适配体克隆。再次，将靶标固定在生物层干涉术传感器探针上，并随后与每种适配体克隆一起孵育。结果在下文(图26至30)呈现。为清楚起见，将不符合规格的克隆的结果排除。
[0361]
图26至30显示与未经选择的初始文库相比，经选择的单克隆适配体改善了与其各自靶标的结合。固定化靶标显示与未精化初始适配体群几乎无相互作用至无相互作用。在固定化靶标与各自经选择单克隆适配体之间观察到结合。
[0362]
对于固定化cdem、cdec、cote和cotec壳多糖酶观察到单克隆适配体的快速缔合(信号在约60至240秒处)。结合的单克隆适配体显示未表现出与cotec壳多糖酶、cota和cdec的显著解离。对于该实施例中使用的特定单克隆适配体库，单克隆适配体与cdem和cote的解离率较高(信号在约240至420秒处)；然而，其各自固定化靶蛋白的快速缔合如本文中所述发生。
[0363]
两种用于cota的经选择单克隆适配体显示出与其各自靶标的缔合较慢，但结合的适配体很少解离。
[0364]
cote适配体的初始文库对照显示出轻微的缔合。这被认为是对数据完整性无影响的异常结果。
[0365]
结论
[0366]
生物层干涉术显示，针对cota、cdec、cdem、cote和cotec壳多糖酶蛋白选择的经选择单克隆适配体与其各自固定化靶标相互作用。相互作用是选择过程(不仅仅是通过非特异性结合)的结果，因为“初始”群未显示出这样的相互作用。
[0367]
实施例3-检测
[0368]
评估了biovector cote h2适配体在环境光和黑暗条件下使不锈钢和罩衣表面上的艰难梭菌sh11细菌芽孢可视化的能力。
[0369]
材料和方法
[0370]
本研究中使用的艰难梭菌经纯化芽孢悬液在表6中列出。艰难梭菌悬液由提供并在到达之后储存在4℃。
[0371]
表6-受试生物体
[0372][0373]
整个研究中使用的受试试剂在表7中描述。cote h2适配体和tbkst缓冲剂由aptamer group提供。
[0374]
表7-受试试剂
[0375][0376][0377]
设备：
[0378]
ukas校准移液器-sartorius，
[0379]
uk eppendorf 5452
[0380]
minispin离心机-eppendorf，de
[0381]
flare 2法医光(波长505nm)-rofin，
[0382]
uk不锈钢桌
[0383]
医院用罩衣表面
[0384]
佳能eos 2000d相机-[0385]
590nm波长过滤器，midwest optical systems，inc.
[0386]
介质：
[0387]
无核酸酶的水-由aptamer group提供
[0388]
tbkst缓冲剂-由aptamer group提供。缓冲溶液包含50mm tris ph 7.6、2.5mm mgcl2、2.5mm cacl2、28mm k2so4、0.01％吐温、0.01％bsa。
[0389]
clinell杀芽孢擦拭物-gama医疗保健，
[0390]
uk 70％异丙醇(ipa)-fisher scientific，uk-[0391]
1％virkon溶液-scientific laboratory supplies，uk
[0392]
方法
[0393]
biovector cote h2适配体在环境光和黑暗条件下检测不锈钢和罩衣表面上的艰
难梭菌sh11细菌芽孢的能力的评估
[0394]
cote h2适配体与艰难梭菌sh11结合程序：
[0395]
在测试之前，通过加热至95℃ 5分钟将cote h2适配体在无核酸酶的水中折叠。cote h2适配体立即在冰上冷却至2℃。将艰难梭菌sh11细菌芽孢的接种物在无核酸酶的水中从储备溶液制备成1
×
107cfuml-1。一旦折叠，将20μl的艰难梭菌sh11芽孢悬液添加至20μl的20μm折叠cote h2适配体中，以获得10μm的终浓度。适配体包含通过接头在5’端并入的fam荧光团。
[0396]
将适配体-芽孢悬液混合并涡旋5秒以获得均匀的悬液并在室温下孵育1小时。在孵育之后，通过离心洗涤适配体-芽孢悬液以除去未结合的cote h2适配体。将100微升tbkst缓冲剂添加至适配体-芽孢悬液中并以12,100x g(13,000rpm)离心10分钟。弃去上清液。将适配体-芽孢沉淀重悬在100μl tbkst缓冲剂中并涡旋10分钟以获得均匀悬液。对于阴性对照4(无芽孢的在tbkst缓冲剂中的cote h2适配体)，将10μl tbkst缓冲剂添加至10μl的20μm折叠cote h2适配体中，以获得10μm的终浓度。
[0397]
在环境光和黑暗条件下不锈钢和罩衣表面上来自艰难梭菌sh11的细菌芽孢的检测
[0398]
用杀芽孢擦拭物、1％virkon
tm
溶液和70％异丙醇(ipa)顺序清洁不锈钢表面。在清洁之后，用水冲洗表面。将表面分成五个标记为s1至s5的10
×
10厘米的样品。样品s1未经处理以作为不锈钢表面的清洁表面对照(阴性对照1)。将阴性对照2(仅艰难梭菌sh11芽孢)、阴性对照3(仅马血)、阳性对照4(tbkst缓冲剂中10μm的cote h2适配体)和适配体-芽孢悬液的5x5μl等分试样分别移液到样品s2、s3、s4和s5上。使表面在室温下干燥1小时。在干燥之后，在有和无flare 2法医光(505nm)的情况下在环境光和黑暗条件下评估适配体-芽孢悬液的荧光。使用有和无590nm带通滤光片的佳能eos 2000d拍摄荧光的图像。还评估了阴性对照的自体荧光。在医院用罩衣表面上重复该测试。
[0399]
结果
[0400]
cote h2适配体在环境光和黑暗条件下检测不锈钢和罩衣表面上的艰难梭菌sh11细菌芽孢的能力的评估：
[0401]
不锈钢表面：
[0402]
环境光，无flare 2法医并且无590nm带通滤光片
[0403]
在环境光条件下在未暴露于flare 2法医光(505nm)和590nm带通滤光片下对所有受试样品均未观察到可见荧光(图31a至图31e)。
[0404]
环境光，有flare 2法医而无590nm带通滤光片
[0405]
当在环境光条件下在暴露于flare 2法医光(505nm)而无590nm带通滤光片时，针对受试样品观察到由不锈钢表面引起的flare 2法医光的可见反射(图32a)。在包含艰难梭菌sh11芽孢(图32b)、马血(图32c)、10μm的cote h2适配体(图32d)和10μm cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合(图32e)的样品中也观察到受试样品的可见反射。
[0406]
环境光，有flare 2法医并且有590nm带通滤光片
[0407]
当在环境光条件下使用590nm带通滤光片时在暴露于flare 2法医光
(505nm)时，未观察到由不锈钢表面引起的flare 2法医光的可见反射(图33a至图33e)。在包含不锈钢表面(图33a)、艰难梭菌sh11芽孢(图33b)或马血(图33c)的样品上未观察到可见的自体荧光。在包含10μm的cote h2适配体的样品中观察到荧光，如由图33d中亮光(实线箭头)所示。在包含10μm cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合(图33e)的样品中未观察到可见荧光。
[0408]
黑暗条件，有flare 2法医并且有590nm带通滤光片
[0409]
在黑暗条件下当暴露于polilight flare 2法医光(505nm)且有590nm带通滤光片时，针对所有受试样品观察到由不锈钢表面引起的flare 2法医光的一些可见反射(图34a至图34e)。在包含不锈钢表面(图34a)、艰难梭菌sh11芽孢(图34b)或马血(图34c)的样品中观察到极少的自体荧光。从存在于表面上的颗粒中也观察到一些自体荧光(由虚线箭头指示，图34，a、b、c和e)。在包含10μm cote h2适配体的样品中在不锈钢表面上观察到荧光，如由图34d中亮光(实线箭头)所示。在包含10μm cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合的样品中也观察到荧光(图34e；实线箭头)。
[0410]
罩衣表面
[0411]
环境光，无flare 2法医并且无590nm带通滤光片
[0412]
在环境光条件下，在未暴露于flare 2法医光(505nm)和590nm带通滤光片下针对罩衣表面受试样品未观察到荧光(图35a至图35e)。
[0413]
环境光，有flare 2法医并且无590nm带通滤光片
[0414]
在环境光条件下当在无590nm带通滤光片的情况下观察时，当暴露于flare 2法医光(505nm)时，针对罩衣表面上的受试样品未观察到可见荧光(图36a至图36e)。在环境光条件下在暴露于flare 2法医光(505nm)而无590nm带通滤光片时，针对受试样品观察到由罩衣表面引起的flare 2法医光的可见反射(图36a)。在包含艰难梭菌sh11芽孢(图36b)、马血(图36c)、10μm cote h2适配体(图36d)和10μm coteh2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合(图36d)的样品中也观察到受试样品的可见反射。
[0415]
环境光，有flare 2法医并且有590nm带通滤光片
[0416]
在包含10μm cote h2适配体的样品中观察到亮绿色/黄色荧光(图37d；实线箭头)，并且在包含10μm cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合的样品中观察到可见荧光(图37e；实线箭头)。在环境光条件下当将罩衣表面暴露于flare 2法医光(505nm)并在590nm带通滤光片的情况下观察时，在罩衣表面上未观察到flare 2法医光的可见反射(图37a至图37e)。
[0417]
黑暗条件，有flare 2法医并且有590nm带通滤光片
[0418]
在包含10μm cote h2适配体的样品中观察到明亮的荧光(图38d；实线箭头)。在包含10μm cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合的样品中观察到荧光(图38e；实线箭头)。在包含罩衣表面、艰难梭菌sh11芽孢或马血的样品中未观察到自体荧光(图38a至38c)。
[0419]
讨论
[0420]
艰难梭菌是一种厌氧产芽孢微生物并且被认为是全世界感染的主要原因且发病率升高。视觉鉴定医疗保健环境中艰难梭菌芽孢污染的方法将允许改善清洁程序。
[0421]
针对不锈钢的荧光评估显示，仅在黑暗条件下检测到荧光。针对罩衣表面的荧光评估显示，在环境光和黑暗条件二者下均检测到与艰难梭菌sh11芽孢组合的cote h2适配体的荧光。在环境光条件下响应于cote h2适配体与艰难梭菌sh11芽孢的组合的存在的在罩衣表面上观察到的荧光强度低于黑暗条件下的荧光强度。在罩衣表面对照上未检测到可见反射或自体荧光，但在不锈钢样品上观察到大量反射。
[0422]
实施例4-最小结合片段
[0423]
发现壳多糖酶_d11适配体(seq id no：5)的片段与艰难梭菌芽孢结合。该片段从seq id no：5的第28位延伸至第64位。该序列也在seq id no：23中示出。使用elisa型测定来鉴定结合，其中以类似于一抗的方式使用了seq id no：23的生物素化片段。链霉亲和素-hrp缀合物用作二级结合配偶体。
[0424]
发现艰难梭菌-f1适配体(seq id no：1)的数个片段与艰难梭菌芽孢结合。最小片段艰难梭菌-f1-f10的序列是5
’‑
ccatactcaatgctcttacgatcctcatcaacc-3’，并且长33个碱基(seq id no：24)。该片段包含从seq id no：1的第12位延伸至第35位的23个连续核苷酸。
[0425]
发现艰难梭菌-g1适配体(seq id no：2)的数个片段与艰难梭菌芽孢结合。最小片段艰难梭菌-g1-f6的序列是5
’‑
ccagtgtagactactcaatgctcttacgatcctcatcaacc-3’，并且长41个碱基(seq id no：25)。该片段包含从seq id no：2的第1位延伸至第21位的21个连续核苷酸。
[0426]
发现cote-h2适配体(seq id no：11)的数个片段与艰难梭菌芽孢结合。最小片段cote-h2-f4的序列是5
’‑
agtgtagactactcaatgcggctggccacaggtcaacc-3’，并且长40个碱基(seq id no：26)。该序列包含来自seq id no：11的5’端的24个连续核苷酸和来自3’端的13个连续核苷酸(具有来自seq id no：11的42个核苷酸的内部截短)，其与另外的鸟嘌呤桥组合。
[0427]
在单点elisa测定中，最小片段艰难梭菌-f1-f10、艰难梭菌-g1-f6和cote-h2-f4各自显示相对于枯草芽孢杆菌(b.sub)优先与来自艰难梭菌的芽孢结合(约两倍)。
[0428]
实施例5-与蛋白质的适配体结合
[0429]
通过平衡解离常数(kd)报道的结合亲和力是针对数种适配体和蛋白质测定的(由neoventures biotechnology inc.(london，ontario，canada)根据合同进行)。
[0430]
对于cote d2、cote h2和cotec壳多糖酶，将适配体在pbs中以5μm的浓度以约10nl的体积点样在金表面上，一式三份。与阳性适配体长度相同的阴性适配体以相同方式点样，同样一式三份。随后在horiba(openplex)表面等离子体共振成像(spri)仪器中以200μl的体积以50μl/分钟的流量将蛋白质注射到芯片上。由于结合的共振是通过从阳性序列上的总共振中减去阴性序列上的总共振来获得的。解离值用以下等式计算：dx/dt～-kd*x，其中dx/dt是作为时间函数的共振值的导数，并且x是任何给定时间点的共振值。缔合值用以下等式计算：dx/dt～ka＊c＊rmax-(ka＊c kd)＊x，其中x是在特定时间点由于结合的共振，c是注射剂的浓度，并且rmax是观察到的最大共振。
[0431]
对于cota c1，将该蛋白质固定在水凝胶芯片上，其中在蛋白质上的伯胺(残基上的侧链)与芯片表面上的羧酸基团之间具有edc介导的缀合。将类似尺寸的蛋白质以相同的
方式固定，作为阴性对照。该数据的浓度变化在于注射的适配体的量。对于cdec d1，该蛋白质以聚集的不溶性蛋白质球形式接收。结合测定是通过将荧光标记的适配体(fam)与该蛋白质一起孵育，并随后在微量离心机中旋转沉降管以除去未结合的物质来进行的。将沉淀在选择缓冲液中重悬并再次旋转沉降。通过添加6m尿素洗脱结合的适配体，并再次旋转，保留上清液。用pcr清除柱清除适配体，并在tecan sapphire ii荧光计上读取荧光。在497nm处激发，在515nm处发射。将在洗脱液中测量的荧光的量除以所有级分的荧光的总量。
[0432]
对于适配体cote h2(seq id no：11)，kd分别确定为1.43e-07(在250nm蛋白质下)、9.16e-08(在125nm蛋白质下)和8.47e-08(在62.5nm蛋白质下)。对于适配体cote d2(seq id no：13)，kd确定为大于250nm。对于适配体cota c1(seq id no：10)，kd确定为6.874e-09。对于适配体cotec壳多糖酶d11(seq id no：5)，kd分别确定为2.54e-07(在500nm蛋白质下)、2.35e-07(在750nm蛋白质下)和2.75e-07(在1000nm蛋白质下)。对于适配体cdec d1(seq id no 6)，由于蛋白质聚集，未确定kd。
[0433]
出于本文中和参考文献本身中显而易见的所有目的将整个本技术中引用的参考文献的全部内容并入本文，就好像每个参考文献均被充分阐述一样。为了呈现，在本文中的特定位置引用了这些参考文献中的特定参考文献。在特定位置对参考文献的引用表明了将参考文献的教导并入的方式。然而，在特定位置对参考文献的引用并不限制出于所有目的并入所引用参考文献的所有教导的方式。
[0434]
因此，应理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，而是旨在涵盖在由所附权利要求书、上述说明书限定和/或附图中示出的在本发明精神和范围内的所有修改方案。