一种β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用

一种
β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用。


背景技术：

2.β-葡萄糖苷酶(ec 3.1.2.21，β-glucosidase)属于纤维水解酶类，主要水解糖苷或寡糖中的β-1,4-糖苷键，同时释放出葡萄糖以及糖苷配体，在生物质转化、食品、医药等产业中都具有重要的应用价值，尤其在以纤维素降解为主的新能源开发领域。该酶与内切葡聚糖酶(eg) 和外切葡聚糖酶(cbh)协同催化，最终产生的葡萄糖能被酵母等微生物利用生成生物燃料乙醇。其中β-葡萄糖苷酶是纤维素降解过程中的限速酶，可以缓解纤维二糖对cbh和eg的抑制作用，其活力的高低直接决定纤维素的降解效率。因此，采用蛋白质工程技术，获得高比活力的β-葡萄糖苷酶对纤维素的高效降解具有潜在应用价值。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用。本发明以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过定点突变，获得突变基因。含有突变质粒的工程菌诱导表达后，获得比酶活提高且稳定性提升的β-葡萄糖苷酶。以p-nitrophenyl β-glucopyranoside(pnpg)和纤维二糖为底物时，突变体的比酶活分别提高了1.3和1.5倍。动力学参数测定结果表明突变体对底物pnpg、纤维二糖的k
cat
值分别为bgl2a的约3.8和2.7 倍。在比活力提高的同时，突变体的稳定性也得到了提升。在30-35℃、ph7.0-7.5条件下，突变体的稳定性较bgl2a提升了1倍。在纤维二糖水解实验中，反应3h后，每毫克突变体酶蛋白水解纤维二糖生成的葡萄糖量约为bgl2a的1.35倍、商品酶的3.28倍。该突变体在以纤维素降解为基础的生物燃料领域具有潜在应用价值。
4.本发明β-葡萄糖苷酶突变体，其氨基酸序列是如seq id no：1所示的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第22位的丙氨酸突变为丝氨酸，且第224位的缬氨酸突变为丝氨酸。
5.本发明β-葡萄糖苷酶突变体，其氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。
6.所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
7.本发明突变质粒，为含有如seq id no：2所述的β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因。
8.本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的菌株，含有所述突变质粒。
9.本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的工程菌株，其分类命名为escherichia colibl21(de3)/pet22b( )-bgl2a(a22s/v224s)，已送至中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：m 20211098，保藏时间为2021年8月30日，保藏地址：中国
·
武汉
·
武汉大学。
10.本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
11.首先以来自多粘芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)的β-葡萄糖苷酶结构为模
板，利用 swiss-model对β-葡萄糖苷酶bgl2a的结构进行同源建模。采用半理性设计策略，选择催化活性中心附近非完全保守的氨基酸残基作为候选位点，通过序列保守分析确定突变的目标氨基酸。
12.根据β-葡萄糖苷酶bgl2a的基因序列，设计并合成突变引物，以含β-葡萄糖苷酶bgl2a 基因的重组质粒为模板，以上述的合成突变引物为引物，基于重叠延伸pcr的方法进行定点突变，获得比酶活提高且稳定性提升的β-葡萄糖苷酶的突变基因。
13.将突变基因与peasy-t3质粒连接并转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，挑取阳性克隆，对突变基因进行dna序列测定。挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有突变β-葡萄糖苷酶基因的peasy-t3重组质粒，用nde i和xho i双酶切peasy-t3重组质粒和表达质粒载体，然后用t4 dna连接酶连接酶切后的突变基因与表达质粒载体，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明突变基因的工程菌株。
14.上述构建方法中所述表达质粒载体包括pcold、pet15、pet22或pet28等。
15.上述构建方法中所述宿主菌包括e.coli bl21(de3)、e.coli dh5α、e.coli jm109或e.colirosetta等。
16.本发明β-葡萄糖苷酶突变体可由所述工程菌株发酵获得。
17.本发明β-葡萄糖苷酶突变体的应用，是将所述β-葡萄糖苷酶突变体应用于纤维素降解过程中，以pnpg、纤维二糖为底物时，在30-35℃、ph7.0-7.5条件下，突变体的比酶活分别提高了1.3和1.5倍。动力学参数测定结果表明突变体对底物pnpg、纤维二糖的k
cat
值相较bgl2a 大幅度增加。在比活力提高的同时，突变体的稳定性也得到了提升。在30-35℃、ph7.0-7.5 条件下，突变体的稳定性较出发酶bgl2a提升了1倍。在纤维二糖水解实验中，反应3h后，每毫克突变体酶蛋白水解纤维二糖生成的葡萄糖量约为出发酶bgl2a的1.35倍、商品酶的 3.28倍。该突变体在以纤维素降解为基础的生物燃料领域具有潜在应用价值。
18.本发明对突变体蛋白和原始野生型蛋白的比酶活、最适ph、最适温度、动力学参数、稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示，以pnpg、纤维二糖为底物时，本发明获得的突变体的比酶活相对出发酶bgl2a分别提高了1.3和1.5倍。动力学参数测定结果表明突变体对底物pnpg、纤维二糖的k
cat
值分别为出发酶bgl2a的3.8倍和2.7倍。在比活力提高的同时，突变体的稳定性也得到了提升。在30-35℃、ph7.0-7.5条件下，突变体的半衰期相对出发酶bgl2a延长了1倍，且突变并未引起最适温度和最适ph的变化。
附图说明
19.图1、2为本发明pcr扩增产物的电泳图谱：图1中各泳道分别为dnamarker、pcr扩增的片段v224s-s、v224s-x、a22s-s和a22s-x；图2中各泳道分别为dnamarker、v224s-s 和v224s-x组合为模板的pcr扩增产物、a22s-s和a22s-x组合为模板的pcr扩增产物。
20.图3为纯化的突变蛋白和出发酶bgl2a的sds-page图谱：1为bgl2a破碎上清，2为 bgl2a纯酶，3为bgl2a:a22s/v224s破碎上清，4为bgl2a:a22s/v224s纯酶，m为蛋白marker。
21.图4中a为最适温度测定结果，b为最适ph测定结果。
22.图5为30-35℃、ph7.0-7.5条件下的稳定性。
具体实施方式
23.下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
24.(一)含有本发明β-葡萄糖苷酶突变基因的表达菌株的构建
25.1、β-葡萄糖苷酶基因突变位点的选择
26.基于序列比对，bgl2a与来自多粘芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa的β-葡萄糖苷酶bglb (pdb code:2o9r)最为相似，氨基酸序列一致性为43％。以bglb的结构作为模板，利用 swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/；kiefer f,arnold k,k
ü
nzli m,bordoli l,schwede t. the swiss-model repository and associated resources.nucleic acids research.2009,37, d387-392.)对β-葡萄糖苷酶bgl2a的结构进行同源建模。
27.根据模拟结构及多序列比对分析，确定定点突变的位点为22位点的丙氨酸a和224位点的缬氨酸v，突变方向为22位点的丙氨酸a被丝氨酸s替代，224位点的缬氨酸v被丝氨酸s替代。
28.2、突变引物的设计和突变基因的pcr扩增
29.根据β-葡萄糖苷酶bgl2a的基因序列：seq id no:2(其氨基酸序列如seq id no:1)，以及选定的突变位点22a和224v，设计以下6个定点突变引物(表1)。
30.以包含β-葡萄糖苷酶bgl2a基因的重组质粒为模板质粒，将上述的合成突变引物进行配对，分别为：bgl2a-f与a22s-r、a22s-f与bgl2a-r、bgl2a-f与v224s-r、v224s-f与bgl2a-r，作为pcr引物对，扩增产物依次命名为a24s-s和a24s-x、v224s-s和v224s-x；回收4 条扩增片段，将a22s-s和a22s-x加入同一反应体系中，v224s-s和v224s-x加入另一反应体系中，作为各自反应体系中的pcr反应模板，并利用bgl2a-f、bgl2a-r引物对作为扩增引物，扩增bgl2a突变基因全长序列并回收备用。
31.表1引物序列
[0032][0033]
3、表达载体的构建
[0034]
将步骤2中得到pcr扩增产物，与peasy-t3质粒(takara)连接，建立如下酶切体系： 10ng peasy-t3载体，70ng pcr扩增产物，25℃连接15min。连接产物热激转化大肠杆菌 trans1-t1感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有本发明β-葡萄糖苷酶突变基因的peasy-t3重组质粒；用ndei和xhoi双酶切所得的 peasy-t3重组质粒和pet-22b( )载体，然后用t4 dna连接酶将酶切后的突变基因与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pet-22b( )载体，50ng突变基因酶切片段，2μl 10
×
ligation buffer，1μlt4 dna连接酶(takara)，补水至20μl，22℃连接1h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正确的转化子得到含有本
发明突变基因的工程菌株escherichia coli bl21(de3)/pet-22b( )-bgl2a(a22s/v224s)。
[0035]
本发明的菌株escherichia coli bl21(de3)/pet-22b( )-bgl2a(a22s/v224s)已送往中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，cctcc)保藏。保藏编号为no： cctcc m 20211098，保藏时间为2021年8月30日，保藏单位地址：中国武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0036]
(二)含本发明β-葡萄糖苷酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化
[0037]
将(一)中获得的基因的工程菌株escherichia coli bl21(de3)/pet22b( )
ꢀ‑
bgl2a(a22s/v224s)接种于含有氨苄青霉素的400ml lb液体培养基中，放置于37℃、200 rpm条件下培养至od
600
为0.6(unico uv2102紫外可见分光光度计，以培养lb培养基为空白对照)；加入终浓度为0.2mm的iptg进行诱导，并于16℃、120rpm条件下继续培养 16小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入3倍菌液体积的bindingbuffer，冰浴条件下350w 超声30min破碎细胞，12000g离心收集上清，得到粗酶液。粗酶液经过ni-nta柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度为60mm，洗脱3个柱体积。得到的蛋白经过检测达到sds-page 纯度。
[0038]
以pnpg为底物，突变体的最适ph为6.5，酶在ph6.0-7.5范围内能够显示70％以上的酶活力。突变体在30℃-55℃范围内均有催化活性，其最适温度为45℃。
[0039]
(三)含本发明β-葡萄糖苷酶突变体比活力的检测
[0040]
1、以pnpg为底物测定酶活力
[0041]
反应体系为500μl，在ph6.5的citrate-na2hpo4缓冲液中加入终浓度为5mm的pnpg， 45℃下预热5min后加入酶液，反应5min后加入500μl 1mna2co3终止反应。实验组做3 个平行实验，对照组以缓冲液代替酶液。以对照组调零，测定405nm下的光吸收值。酶活力 (u)定义为：每分钟产生1μmol pnp所用的酶量。
[0042]
2、以纤维二糖为底物测定酶活
[0043]
反应体系为500μl，在ph6.5的citrate-na2hpo4缓冲液加入终浓度为100mm的纤维二糖，45℃下预热5min后加入酶液，反应5min后将反应体系放置沸水浴中煮沸5min，使酶充分失活，按照葡萄糖测定试剂盒操作说明进行操作，实验组3个平行，对照组以去离子水代替葡萄糖溶液。以对照组调零，测定505nm下的光吸收值。酶活力(u)定义为：每分钟产生1μmol葡萄糖所用的酶量。
[0044]
测定结果显示，以pnpg和纤维二糖为底物时，本发明获得的突变体的比酶活较出发酶 bgl2a分别提高了1.3和1.5倍。
[0045]
(四)含本发明β-葡萄糖苷酶动力学参数的测定
[0046]
β-葡萄糖苷酶对人工底物pnpg及天然底物纤维二糖的动力学参数如表2所示。测定缓冲液为50mm、ph6.5 citrate-na2hpo4缓冲液，其中pnpg浓度范围为0-20mm，纤维二糖浓度范围为0-200mm，具体测活方法参照本发明实施方式(三)。以michaelis-menten方程为基础，横坐标为底物浓度，纵坐标为反应速度，利用软件origin 8.5进行非线性拟合，得到 km、v
max
、k
cat
。
[0047]
结果显示，突变体对底物pnpg、纤维二糖的亲和力虽明显下降，但k
cat
值呈现不同程度的增长，其中以pnpg为底物时的k
cat
值为出发酶bgl2a的约3.8倍，对纤维二糖的k
cat
值为出发酶bgl2a的2.7倍
[0048]
表2β-葡萄糖苷酶的动力学参数
[0049][0050]
(五)含本发明β-葡萄糖苷酶稳定性的检测
[0051]
在30-35℃、ph7.0-7.5条件下，对bgl2a与突变体进行热处理，每隔半小时或一小时取样，以初始酶活为100％，计算热处理一定时间后的酶活剩余率，公式如下：酶活剩余率＝ (热处理前酶活-损失酶活)/热处理酶活
×
100％。
[0052]
测定结果显示，该条件下突变体的半衰期为3h，较野生型提升了1倍。
[0053]
(六)含本发明β-葡萄糖苷酶突变体在纤维二糖水解中的应用
[0054]
反应体系包括终浓度为200g/l的纤维二糖，50mm、ph6.5 citrate-na2hpo4缓冲液和100u β-葡萄糖苷酶突变体，在35℃、200rpm水浴摇床振荡反应，定期取样，用葡萄糖测定试剂盒检测生成的葡萄糖，同时加入相同酶量的bgl2a与商品β-葡萄糖苷酶(购自sigma公司， g0395)设为对照组。
[0055]
反应3h后，每毫克突变体蛋白水解纤维二糖生成的葡萄糖量约为bgl2a的1.35倍、商品酶的3.28倍。
[0056]
seq id no:1
[0057]
mtkislptcsplltkefiygvstssfqieggsahrlpciwdtfcdtpgkiadnsnghvacdhy nnwkqdidlieslgvdayrlsiswprvitksgelnpegvkfytdildelkkrnikafvtlyh wdlpqhledeggwlnretayafahyvdlitlafgdrvhsyatlnepfcsaflgyeigihapg kvgkqygrkaahhlllahglamtvlkqnspttlngislnftpcysisedaddiaatafadd ylnqwymkpimdgtypaiieqlpsahlpdihdgdmaiisqsidylginyytrqfykahpteiy epieptgpltdmgweiypksftellvtlnntytlppifitengaampdsynngeindvdrldy ynshlnavhnateqgvridgyfawslmdnfewaegylkrfgivyvdystqqrtiknsgla ykalisnr
[0058]
seq id no:2
[0059]
atgactaaaatatctttaccaacttgttcacctctattaacaaaagagtttatttatggtg taagcacatcatctttccaaatagaaggtggctcagctcaccgtctgccgtgtatctggga taccttttgtgatactccaggtaaaatagctgataactcaaatgggcatgttgcatgcgat cattacaataattggaaacaagacatagatttaatcgaatcattaggagtagatgcttac agactttctatttcttggcctcgtgttattacaaaaagtggtgagcttaaccctgaaggc gtaaagttttacaccgacatcttagatgaactgaaaaagcgcaatattaaagcgtttgtc acgttataccactgggatttacctcaacacctagaagacgaagggggttggttaaatcg agaaacagcttacgcgtttgctcactatgttgatttaattaccttggcattcggtgaccg ggtgcattcatacgctaccttaaacgaacccttttgcagtgcttttttaggttacgaaatt ggcattcatgcgccagggaaagtcggcaaacaatacgggcgcaaagccgcccaccatt tgttattagcacatggccttgccatgaccgtattaaagcaaaactcaccgacgactttaa acggtatctcccttaactttactccctgttatagcatctctgaagacgctgatgacattgc tgcaacagcgtttgcagatgactacttaaaccagtggtacatgaaacccatcatggatg gtacatacccagcaattattgaacaattaccttcagcacatctgccagatattcacgatgg tgacatggccattatttcacaatcaattgattatttaggtattaacta
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