一种吴茱萸药材基源的鉴别方法

1.本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，具体涉及一种吴茱萸药材基源鉴别方法及其应用。


背景技术：

2.吴茱萸具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的功能。可用于治疗厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻。目前药典中收录了芸香科植物吴茱萸euodia rutaecarpa(juss.)benth.、石虎euodia rutaecarpa(juss.)benth.var.officinalis(dode)huang或疏毛吴茱萸euodia rutaecarpa(juss.)benth.var.bodinieri(dode)huang的干燥近成熟果实作为吴茱萸的三种基源药材。这三种药材在中国南部各地均有广泛分布，是吴茱萸商品药材中的主流品种，但不同产地的生长环境、气候条件造成了不同基源吴茱萸药材的质量差异。
3.目前对于吴茱萸药材的质量控制多集中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的含量测定，《中国药典》2015版中将这三者的含量作为质量评价的指标，但3种吴茱萸药材的化学成分极为相似，很难实现吴茱萸药材基源的鉴别，也很难对其内在品质进行客观评价，因此建立一种简单有效的基源鉴别方法尤为重要。
4.近年来，化学模式识别以及化学计量学在药材质量分析与鉴别中应用广泛，其中正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares regression discriminant analysis，opls-da)是一种基于pls回归方法，主要反映预测变量和因变量之间的线性关系，是一种监督分类方法。由于能是现特征性地区分不同基源的药材质量而在该研究领域中备受关注。它基于x变量构建y变量的预测模型，并根据x变量预测集数预测y变量，其公式如下：
[0005][0006][0007]
u＝t h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0008]
在公式(1)中，为x的变量均值，t为x变量的得分矩阵，是对x变量的概括；p’为x变量的载荷矩阵，是对变量重要性的描述；e为x变量剩余残差矩阵，度量预测值和原始值之间的偏差；为y变量的均值；u为y变量的得分矩阵，是对y变量的概括；c’为y变量的载荷矩阵，是对变量重要性的描述；f为x变量剩余残差矩阵，度量预测值和原始值之间的偏差；h为总甚于残差矩阵。


技术实现要素：

[0009]
有鉴于此，本发明期望提供一种吴茱萸药材基源鉴别方法及其应用，采用高效液相色谱法建立吴茱萸指纹图谱，方法可靠、准确，采用液质联用技术，可明确吴茱萸药材的物质基础，结合正交偏最小二乘判别分析能特征性地区别不同基源的吴茱萸药材。
[0010]
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0011]
本发明一种吴茱萸药材基源鉴别方法及其应用，包括以下步骤：
[0012]
a)对照品溶液制备：取适吴茱萸碱，精密称定，加50％～100％甲醇或乙腈制成吴茱萸碱的对照品溶液；
[0013]
b)供试品溶液制备：取吴茱萸药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或乙醇，浓度为50％～100％，料液比为1：5～1：50，称定重量，回流或超声处理10-50min，放冷，再称定重量，用50％～100％甲醇或50％～100％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得；
[0014]
c)高效液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱；所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相a为纯甲醇或纯乙腈，流动相b为含添加剂为0.05％-0.5％甲酸、0.05％-0.5％乙酸的水相，流速为0.8ml/min-1.8ml/min，所述进样量为5-30μl，所述检测波长为200-500nm；
[0015]
d)指纹图谱的建立：取20批吴茱萸药材分别按步骤b)制备供试品溶液，按步骤c)依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次吴茱萸的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱；
[0016]
e)共有色谱峰结构的鉴定：采用液相色谱-串联质谱仪鉴定共有色谱峰，液相色谱方法与步骤c)一致，质谱所用的电离模式为电喷雾正离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：500-650℃；干燥气流速：8-12l/min；离子化压力：3500-4500v；毛细管电压：60-80v；裂解电压：15-30ev；
[0017]
f)鉴别分析：以步骤d)指纹图谱中共有色谱峰峰面积为数据，用simica 14.1(维护信息收集和分析的软件界面14.1版本)进行正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，根据opls-da得分图中样本聚集的组别，以此鉴别吴茱萸药材的基源。
[0018]
进一步地，所述步骤a)中，取适量吴茱萸碱精密称定，加甲醇制成每1ml含吴茱萸碱80～200μg的对照品溶液。
[0019]
进一步地，所述步骤b)中，取吴茱萸药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，加入浓度为50-100％甲醇，料液比为1：10～1：50，称定重量，超声处理15-45min，放冷，再称定重量，用50-100％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
[0020]
进一步地，所述步骤c)中，色谱柱长度为100-250mm，直径为2.1-4.6mm，粒径为1.7-5μm，流动相a为纯乙腈，流动相b为含添加剂浓度0.1～0.5％甲酸的水相，采用梯度洗脱，0～21min,5～27％a；21～24min,27～48％a；24～35min,48～55％a；35～50min,55～95％a；50～65min,95％a。
[0021]
进一步地，确定13个共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱。
[0022]
本发明有益效果如下：本发明方法专属性强、峰识别数目多，得到的吴茱萸指纹图谱能够全面、特征性地反应吴茱萸药材的组成成分，指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析可用于不同基源吴茱萸的鉴别，采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确吴茱萸药材的物质基础。
附图说明
[0023]
图1为本发明实施例中20批吴茱萸药材的hplc指纹图谱；
[0024]
图2为本发明实施例中吴茱萸标准对照指纹图谱；
[0025]
图3为本发明实施例吴茱萸药材的正交偏最小二乘判别分析得分图。
具体实施方式
[0026]
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
[0027]
本发明一种吴茱萸药材基源鉴别方法及其应用，包括以下步骤：
[0028]
步骤1：对照品溶液制备，取适量吴茱萸碱精密称定，加甲醇制成每1ml含吴茱萸碱80～200μg的对照品溶液；
[0029]
步骤2：供试品溶液制备，取吴茱萸药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或乙醇，浓度为50％～100％，料液比为1：5～1：50，称定重量，回流或超声处理10-50min，放冷，再称定重量，用50％～100％甲醇或50％～100％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得；
[0030]
进一步地，取吴茱萸药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，加入浓度为50-100％甲醇，料液比为1：10～1：50，称定重量，超声处理15-45min，放冷，再称定重量，用50-100％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；
[0031]
进一步地，超声处理可以为功率500w，频率40khz；
[0032]
步骤3：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱；所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相a为纯甲醇或纯乙腈，流动相b为含添加剂为0.05％-0.5％甲酸、0.05％-0.5％乙酸的水相，流速为0.8ml/min-1.8ml/min，所述进样量为5-30μl，所述检测波长为200-500nm；
[0033]
进一步地，色谱柱长度为100-250mm，直径为2.1-4.6mm，粒径为1.7-5μm，流动相a为纯乙腈，流动相b为含添加剂浓度0.1～0.5％甲酸的水相，采用梯度洗脱，0～21min,5～27％a；21～24min,27～48％a；24～35min,48～55％a；35～50min,55～95％a；50～65min,95％a；
[0034]
步骤4：指纹图谱的建立，取20批吴茱萸药材分别按步骤b)制备供试品溶液，按步骤c)依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次吴茱萸的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱；
[0035]
步骤5：共有色谱峰结构的鉴定，共有色谱峰结构的鉴定：采用液相色谱-串联质谱仪鉴定共有色谱峰，液相色谱方法与步骤c)一致，质谱所用的电离模式为电喷雾正离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：500-650℃；干燥气流速：8-12l/min；离子化压力：4500-5500v；毛细管电压：60-80v；裂解电压：15-30ev；
[0036]
步骤6：鉴别分析，以步骤d)指纹图谱中共有色谱峰峰面积为数据，用simica 14.1(维护信息收集和分析的软件界面14.1版本)进行正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，根据opls-da得分图中样本聚集的组别，以此鉴别吴茱萸药材的基源。
[0037]
下面将通过具体实施例来进一步详细阐述：
[0038]
实施例一：
[0039]
1仪器与试药
[0040]
1.1仪器
[0041]
waters alliance高效液相色谱系统，包括2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，empower色谱工作站。ms204ts电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)，岛津超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪q-tof。
[0042]
色谱柱：eclipse xdb-c18(250mm
×
4.6mm i.d.，5μm)和tnature c18(250mm
×
4.6mm i.d.，5μm)。
[0043]
1.2试药
[0044]
对照品：吴茱萸碱(批号bp0579，规格20mg，纯度98％)，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；吴茱萸对照药材(批号120986-201610，规格1g)购自中国食品药品检定研究院；药材：吴茱萸药材共20批，采自江西省樟树、湖南省祁东县、湖南怀化，质量符合2015年版《中国药典》。研究样品均为吴茱萸euodia rutaecarpa(juss.)benth.、石虎吴茱萸euodia rutaecarpa(juss.)benth.var.officinalis(dode)huang或疏毛吴茱萸euodia rutaecarpa(juss.)benth.var.bodinieri(dode)huang的干燥近成熟果实，具体信息见表1。
[0045][0046]
表1 20批吴茱萸样品信息
[0047]
试剂：乙腈(色谱级)、甲醇(色谱级)、乙醇(色谱级)均购自sigma-aldrich。磷酸(色谱级)购自sigma-aldrich。甲酸(色谱级)购自aladdin。实验室用水来自milli-q超纯水净化系统(billerica,ma,usa)。
[0048]
2方法
[0049]
2.1色谱条件
[0050]
hplc-dad色谱条件色谱柱：tnature-acchrom c18柱(4.6
×
250mm,5μm,美国沃特世公司)，流动相乙腈(a)-体积浓度0.5％甲酸溶液(b)洗脱，0～55min,5～40％a(v/v)；55～60min,40～90％a；60～65min,90％a；流速为1.5ml/min；进样量为10μl；柱温为30℃；检测波长：252nm。
[0051]
2.2溶液的制备
[0052]
2.2.1对照品溶液制备：取适吴茱萸碱，精密称定，加75％甲醇制成吴茱萸碱的对照品溶液，加甲醇制成每1ml含吴茱萸碱100μg的对照品溶液。
[0053]
2.2.2供试品溶液制备：取吴茱萸药材粉末(通过三号筛的粉末)2g，精密称定，置
具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度75％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得。
[0054]
2.3方法学考察
[0055]
2.3.1精密度试验取同一批次吴茱萸药材，制备供试品溶液，连续进样6次，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间rsd(相对标准偏差)均小于1％，主要特征峰的相对峰面积rsd小于5％，表明仪器精密度良好。
[0056]
2.3.2稳定性试验取同一批次吴茱萸药材，制备供试品溶液，分别于0h、6h、12h、18h、24h注入液相色谱仪，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间rsd均小于1％，主要特征峰的相对峰面积rsd小于5％，表明供试品溶液24h内稳定性良好。
[0057]
2.3.3重复性试验取同一批次吴茱萸药材，制备6份供试品溶液，进样，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间rsd均小于1％，主要特征峰的相对峰面积rsd小于5％，表明该方法重复性良好。
[0058]
2.4耐用性试验
[0059]
色谱柱的影响：在相同色谱条件下，比较eclipse xdb-c18(250mm
×
4.6mm i.d.，5μm)和tnature c18(250mm
×
4.6mm i.d.，5μm)等2种色谱柱对同一吴茱萸样品的分离效果。结果表明，吴茱萸样品在两根不同品牌c18色谱柱上的分离效果差别较大，其中在tnature c18色谱柱上的峰形和分离度相对较好。
[0060]
柱温的影响：在相同色谱柱上，比较30℃、35℃、40℃、45℃和50℃等5个柱温条件对同一吴茱萸样品的分离效果。结果表明，在柱温30℃条件下，特征图谱的整体分离效果最佳。随着柱温升高，20分钟左右主要色谱峰的分离度不断减小，因此，选定吴茱萸药材特征图谱的柱温为30℃。
[0061]
不同流速的影响：在1ml/min流速条件下，吴茱萸药材特征图谱的分析时间较长(80分钟)，考虑到减小特征图谱分析时间，提高检测效率，特考察1.5流速条件下特征图谱的分离效果。结果表明，在1.5ml/min流速条件下，分析时间缩短至55分钟，且色谱峰的数目和分离度基本相同。因此，选定吴茱萸药材特征图谱的流速为1.5ml/min。
[0062]
不同流动相的影响：在相同色谱条件下，比较乙腈-0.5％甲酸水溶液、乙腈-1.0％甲酸水溶液和0.5磷酸水等3种流动相体系对同一吴茱萸样品的分离效果。结果表明，在乙腈-0.5％甲酸水溶液体系下的色谱峰的峰数较多、响应值较高、分离度较好，且基线平稳。选择乙腈-0.5％甲酸水溶液作为流动相体系。
[0063]
3操作分析
[0064]
3.1吴茱萸药材指纹图谱的建立
[0065]
取表1中20批吴茱萸药材，按“2.2.2”项下方法制备得到供试品溶液，所有供试品溶液均按“2.1”项下的色谱条件分别进样进行分析，获得吴茱萸药材的hplc指纹图谱(图1)。将其全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》(2012版)，设定s1为参照谱图，采用中位数法进行自动匹配，加以多点校正，确定13个共有色谱峰(对应的共有色谱峰具有相同保留时间)，得到吴茱萸药材的对照谱图，如图2所示。
[0066]
实施例二：
[0067]
1鉴别分析
[0068]
吴茱萸样品的正交偏最小二乘判别分析：本实验将实施例一获得的20批样品的13个共有峰峰面积导入simca-p14.1软件，根据公式(1)的计算方式进行opls-da分析，获得相应模型。其模型质量参数r2x(所建模型对x矩阵的解释率)为0.987，r2y(所建模型对y矩阵的解释率)为0.989，q2(所建模型的预测能力)为0.987，说明模型稳定，预测准确度高。从opls-da得分矩阵图(图3)可以看出，三种基源的吴茱萸药材在opls-da图中呈现了各自的特定区域，分离效果明显。
[0069]
2吴茱萸指纹图谱中共有色谱峰结构的鉴定
[0070]
采用高效液相色谱-飞行时间串联四极杆高分辨质谱(hplc-qtof-ms/ms)对吴茱萸的化合物进行定性分析。通过与对照品对比及分析一级精确分子量及二级碎片离子信息，对吴茱萸指纹图谱各共有峰进行归属，液相色谱方法与2.1方法一致，所用的电离模式为电喷雾正离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：550-650℃；干燥气流速：8-12l/min；离子化压力：4500-5500v；毛细管电压：60-80v；裂解电压：15-30ev，结果见表2。
[0071][0072]
*对照品确认
[0073]
表2吴茱萸指纹图谱中共有峰的鉴定
[0074]
现有方法相似度计算：
[0075]
取20批(s1～s20)吴茱萸药材分别按2.2.2方法制备供试品溶液，按2.1方法依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，计算相似度，结果显示，20批吴茱萸药材(s1～s20)的相似度分别为
1.000，0.998，1.000，0.997，0.999，0.897，0.887，0.892，0.876，0.886，0.853，0.892，0.879，0.884，0.895，0.927，0.932，0.926，0.916，0.929。相似度结果显示20批吴茱萸药材在相似度有一定差异，但区分效果不明显，不同基源的吴茱萸药材难以实现区分。
[0076]
本发明提供的技术方案与现有技术的比较如下:
[0077] 专属性峰指认数目基源区分物质基础现有技术弱少难以区分明确本发明强多可以区分模糊
[0078]
从表中可以看出本发明方法专属性强、峰识别数目多，指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析可用于不同基源吴茱萸的鉴别，采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确吴茱萸药材的物质基础。
[0079]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。