一种基于网络药理学分析中药组合物治疗肝纤维化作用机制的方法与流程

1.本发明属于药理学领域，具体地，涉及一种基于网络药理学分析中药组合物治疗肝纤维化作用机制的方法。


背景技术：

2.肝纤维化是一种严重的健康问题，在全球范围内普遍存在且预后较差，可响应几乎所有引起慢性肝损伤的原因，包括酒精中毒，非酒精性肝脂肪性肝炎，慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病。肝纤维化的特征是由于ecm产生和降解之间的不平衡，导致肝内细胞外基质(ecm)的沉积过多。肝星状细胞(hsc)的激活已被确认为肝纤维化发展中的关键事件，它调节ecm的大量生产和分泌。肝纤维化被认为是可逆的病理生理过程，其晚期会导致肝硬化，肝衰竭和门脉高压，可能需要进行肝移植。肝纤维化的预防和逆转是预防和治疗慢性肝病的关键步骤。当前，仍然没有批准用于人类的有效抗纤维化药物。因此，开发有效且安全的抗纤维化药物并揭示其潜在机制至关重要。中药(tcm)由于其疗效好，不良反应少而在中国的临床实践中一直使用了数千年，已成为当前医疗体系中不可或缺的一部分。临床证明中医在预防和治疗肝纤维化和肝硬化方面具有独特的功效和优势。
3.肝纤维化是一个多因素、多途径参与的复杂病理过程。化药的治疗仍有很大的局限性，而中药治疗无论从历史经验还是现代研究支持来说，均为广大医患所接受。现代发现，肝纤维化通常不是单个基因或靶点缺陷的结果，而是由多个基因或靶点异常引起的，构成了发病的“细胞或表型网络”，因此从单一基因或靶点进行干扰可能达不到治疗效果。而传统的中药复方由于包括多种以上的化学成分，构成了“化学空间网络”，能同时对机体多个基因靶点进行有效的干扰。
4.网络药理学是一种借助于数据库在分子水平上来预测药物作用机制的一种方法。网络药理学可以通过目标分子所延伸出的分子网络、网络靶点等信息揭示生物系统与药物之间复杂的关系为生物活性物质的发现、机理研究以及新药的研发等领域提供了新的思路。
5.cn200810055636.0公开了一种治疗肝病的中药，它由黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草、叶下珠十味中药制成，该中药具有益气疏肝、活血软坚的功效，用于治疗慢性肝炎、肝纤维化、早期肝硬化，目前正在开展新药临床研究，属于一类中药新药。目前未见关于此种中药治疗肝纤维化作用机制的报道。因此，需要建立一种科学分析该中药组合物治疗肝纤维化作用机制的方法。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于网络药理学分析中药组合物治疗肝纤维化作用机制的方法，为后续的新药开发应用提供参考。
7.为了实现上述目的，本发明提供一种基于网络药理学分析中药组合物治疗肝纤维
化作用机制的方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行:
8.s1、中药组合物活性成分的获取及靶点筛选：依托中药数据库，例如中药系统药理学数据库与分析平台(tcmsp)收集中药组合物全方中10味中药黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草、叶下珠的化学成分；设置筛选条件，根据口服生物利用度(ob)和类药性(dl)筛选，ob和dl筛选阈值分别为ob≥30％、dl≥0.18。得到数据库筛选与活性成分相关的靶标蛋白，通过unitprot数据库确定靶标蛋白所对应的基因名称，选择人类的靶点蛋白，最终确定中药组合物的活性成分及其对应靶点。
9.s2、肝纤维化靶点筛选：运用omim数据库、ttd数据库、genecards数据库、disgenet数据库，收集肝纤维化的相关靶点，将所得靶点取并集，以得到肝纤维化的相关靶标信息。
10.s3、“成分-靶点”网络构建与分析：将所得活性成分对应靶标蛋白与肝纤维化的相关靶点进行映射，即两者取交集，得到中药组合物治疗肝纤维化的预测靶点，利用cytoscape软件构建构建“c(成分)-t(靶点)”作用网络图。
11.s4、go富集与kegg通路富集分析：采用davidv数据库对网络中的靶点进行go富集与kegg通路富集。通过omicshare对富集分析结果进行可视化处理。
12.s5、关键基因以及关键化合物筛选与评价：利用cytoscape软件确定了前10 个关键基因，通过metascape数据库对关键基因进行了go和kegg路径分析，揭示关键基因与治疗成分之间的关系；根据ppi网络发现，上述10个关键基因，包括ptgs2、ptgs1、ncoa2、hsp90ab1、adrb2、ncoa1、scn5a、htr、 chrm1、rxra，主要通路为调节炎症反应、对氧化应激的反应、mapk活性、诱导细胞凋亡、erbb信号通路、vegf信号通路、胞质dna传感途径、 rap1信号通路等。go与kegg通路富集分析发现，中药组合物治疗肝纤维化的可能关键成分10个，为槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-o-methylisomucronulatol、甾醇、二氢丹参内酯、丹参酮iia、刺芒柄花素、糖甙、4-亚甲丹参新酮。
13.本发明的有益技术效果如下：
14.1、与现有技术相比，本发明基于网络药理学技术首次建立了中药组合物的活性成分治疗肝纤维化的“成分-靶点-疾病”系统网络图，分析和确定了中药组合物如何通过“多活性、多靶点、多通路”的网络系统发挥作用。
15.2、本发明运用大数据高通量整合分析技术的网络药理学具有药物筛选速度快、筛选信息全，可辅助用于药物研发，具有很好的应用价值和市场前景。
16.3、本发明方法为研究中药组合物治疗肝纤维化的药物-靶点的相互作用机理提供了新的思路和方法。这些系统化和网络信息化的研究方法，有助于解决中药复方多活性成分和多靶点蛋白之间相互作用的数量太大，很难做到在实验上进行一一筛选的难题，对于指导中药复方的研发具有重要意义。
附图说明
17.图1：“活性成分—对应靶点”网络图；
18.图2：“中药组合物c(成分)-t(靶点)”网络图；
19.图3：“成分—靶点ppi”网络图；
20.图4：go功能富集分析图；
21.图5：kegg通路富集分析图。
具体实施方式
22.实施例1
23.1.中药组合物活性成分的获取及靶点筛选：
24.通过中药系统药理学数据库与分析平台(tcmsp)收集中药组合物全方中 10味中药黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草、叶下珠的化学成分，根据口服生物利用度(ob)和类药性(dl)筛选，ob和dl筛选阈值分别为ob≥30％、dl≥0.18。剔除掉未找到靶点的化学成分，得到活性化合物208个，其中黄芪20个、鳖甲0个、葛根4个、柴胡17个、灵芝61 个、赤芍29个、丹参65个、三七8个、鸡骨草4个、叶下珠0个；相关靶标共 2398个，见表1。
25.表1中药组合物“中药-活性成分-相关靶标”信息
[0026][0027]
通过tcmsp数据库筛选与活性成分相关的靶标蛋白，通过unitprot数据库确定靶标蛋白所对应的基因名称，选择人类的靶点蛋白，最终确定中药组合物的活性成分及其对应靶点。
[0028]
将活性成分和相关靶标综合筛选保留唯一值，共搜集到117个活性成分，266 个对应靶点，
[0029]
利用cytoscape软件构建“活性成分-对应靶点“网络，见图1。
[0030]
2.疾病靶点筛选结果
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在omim数据库、ttd数据库、genecards数据库、disgenet数据库中检索肝纤维化所得结果进行并集，删除重复项，得到肝纤维化相关靶点6398个。
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3.“成分-靶点”构建与结果分析
[0033]
将所得到的中药组合物的药物靶点与肝纤维化相关靶点进行映射，得到161 个共有靶点，对应中药组合物活性成分117个，利用cytoscape软件构建的c(成分)-t(靶点)网络见图2。靶点数排前10位的成分为槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素
(luteolin)、7-o-methylisomucronulatol、甾醇 (beta-sitosterol)、二氢丹参内酯(dihydrotanshinlactone)、丹参酮iia(tanshinone iia)、刺芒柄花素(formononetin)、糖甙(isorhamnetin)、4-亚甲丹参新酮 (4-methylenemiltirone)，见表2，这些可能为中药组合物治疗肝纤维化的有效成分。靶点对应基因排前10位的为ptgs2、ptgs1、ncoa2、hsp90ab1、adrb2、 ncoa1、scn5a、htr、chrm1、rxra，见表3，将映射所得的161个靶点利用string作ppi网络，见图3，上面所得到的前10个靶点均包含在主要靶点内，表明这些基因可能为中药组合物治疗肝纤维化的关键基因。
[0034]
表2中药组合物靶点数排名前10位成分信息
[0035][0036]
表3靶点对应基因的前10位
[0037][0038]
4.go功能富集分析和kegg分析
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采用davidv数据库对网络中的蛋白进行go富集分析。go是为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划，旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。go有3个分类：(1)分子功能(mf)，描述基因产物在分子生物学上的活性；(2)生物学过程(bp)，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的过程；(3)细胞组分(cc)，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中，表明基因产物在什么地方起作用。通过根据显著性程度p《0.05 (p值由小到大)，go分析共包含960条富集结果，其中生物过程相关的条目最多，有845个，主要涉及细胞凋亡的调控、抗凋亡、抗炎症反应、抗氧化应激反应、调节细胞因子的产生、nf-κb通路调控、mapk通路调控、激活蛋白激酶活性、调节白介素12的产生、诱导细胞凋亡、调节免疫球蛋白的分泌、调节肿瘤坏死因子的产生、转化生长因子β受体信号通路、过氧化物酶活性等。通过文献查询，选出与之相关性较多的，通过omicshare对分析结果进行可视化处理，见图4。
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利用davidv数据库进行通路富集分析。在david的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“official_gene_symbol”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“homo sapiens”，背景也选择“homo sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合，获得通路富集结果。对筛选出的核心靶点蛋白进行kegg通路富集分析，共获得87条富集结果。根据显著性程度p《0.05(p值由小到大)，筛选出69条通路在肝纤维化方面具有作用。其中前20条通路为乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、tnf信号通路、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恰加斯病(美国锥虫病)、破骨细胞分化、慢性粒细胞白血病、toll样受体信号通路、弓形虫病、t细胞受体信号通路、甲型流感、丙型肝炎、百日咳、胶质瘤、htlv-i 感染、nod样受体信号通路、结核。其结果见图5。其中，y轴代表
pathway名称，x轴代表基因数(count，即目标基因中属于这个pathway的基因的数量)，气泡颜色代表富集显著性，即p值的大小。在69条通路中近期研究新型热点通路包括erbb信号通路、胞质dna传感途径、rap1信号通路等。
[0041]
5、关键基因以及关键化合物筛选与评价
[0042]
本发明运用网络药理学，探讨了中药组合物治疗肝纤维化的作用网络与潜在机制，研究显示，中药组合物治疗肝纤维化的关键成分10个，为槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-o-methylisomucronulatol、甾醇、二氢丹参内酯、丹参酮iia、刺芒柄花素、糖甙、4-亚甲丹参新酮；关键靶点10个，为ptgs2、ptgs1、ncoa2、hsp90ab1、adrb2、ncoa1、scn5a、htr、chrm1、rxra；go与kegg 通路富集分析发现，主要通路为调节炎症反应、对氧化应激的反应、mapk 活性、诱导细胞凋亡、erbb信号通路、vegf信号通路、胞质dna传感途径、 rap1信号通路等。
[0043]
肝纤维化是肝组织抗损伤的修复过程，早期对肝组织的损伤修复有重要的防御作用。因此，在肝纤维化发生的早期阶段，此时以病因治疗及抗炎保肝治疗为主，进展期和显著肝纤维化期以及肝硬化期时需要进行抗肝纤维化治疗。慢性炎症反应是纤维化形成的前提及进展的驱动力，抑制肝脏炎症、肝细胞保护和抗氧化是抗肝纤维化的重要措施。从图1中可以发现中药组合物治疗肝纤维化中包括il-1β、il-6、il-2、tnf、il-4、il-10、ptgs1、ptgs2等因子，这些都是在炎症中起到主要作用的炎症细胞因子，说明炎症与肝纤维化的发生发展关系密切。