一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞可从各种组织中分离，如骨髓、脂肪组织、皮肤、骨骼肌和脐带血等。其中，源自脂肪组织的干细胞称为脂肪间充质干细胞。脂肪间充质干细胞产量高于骨髓来源的间充质干细胞。并且含有丰富的生长因子和细胞因子，在细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景。脂肪间充质干细胞已经广泛地用作临床的细胞治疗以及各种美容护肤品中，对于干细胞自我更新机制的研究、干细胞信号调控以及探索很多疾病的发病机制并寻找治疗方法都有很大意义。
3.随着脂肪间充质干细胞的应用越来越广泛，对于脂肪间充质干细胞的保存需求也越来越多。现有的保存方法都是将脂肪间充质干细胞和低温保护剂一起保存在-196℃的液氮中。常用的低温保护剂中含有二甲基亚砜，是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶形成，减少自由基对细胞的损害。但二甲基亚砜存在一定的毒性作用，可与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。并且在液氮中保存细胞对设备要求高，随着保存时间的延长需要经常补充液氮，增加保存的成本。为了解决上述问题，有必要提供一种不添加二甲基亚砜的脂肪间充质干细胞保存添加剂，提高低温保护剂的安全性，并且探索无需液氮的细胞保存条件。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，成分安全稳定，并且实现了脂肪间充质干细胞在-80℃条件下的保存。
5.本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂的应用。
6.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
7.一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，包括以下成分：甘露醇、丝素蛋白、多库酯钠、谷胱甘肽、甘油、槲皮素。
8.进一步地，所述添加剂在培养基中的质量浓度为：甘露醇1-5mg/ml、丝素蛋白7-12μg/ml、多库酯钠5-10μg/ml、谷胱甘肽1-5μg/ml、甘油0.5-1mg/ml、槲皮素10-15ng/ml。
9.进一步地，所述添加剂在培养基中的质量浓度为：甘露醇2mg/ml、丝素蛋白10μg/ml、多库酯钠8μg/ml、谷胱甘肽3μg/ml、甘油0.8mg/ml、槲皮素12ng/ml。
10.进一步地，所述培养基为低糖dmem培养基。
11.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
12.上述脂肪间充质干细胞保存用添加剂的应用，包括以下步骤：
13.(1)向培养基中加入添加剂，混合均匀得到保存液，备用；
14.(2)将待保存的脂肪间充质干细胞用步骤(1)的保存液重悬；
15.(3)将步骤(2)的保存液程序降温至-80℃保存。
16.进一步地，步骤(2)保存液中脂肪间充质干细胞密度为1-3
×
107个/ml。
17.进一步地，步骤(3)中程序降温过程为：以1-3℃/min降温至-20℃，再以15-20℃/min降温至-80℃保存。
18.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，添加剂中的甘露醇、丝素蛋白、多库酯钠、谷胱甘肽、甘油、槲皮素各组分协同作用，实现了脂肪间充质干细胞在-80℃条件下的保存，成分安全，保存环境稳定，保存三月后的脂肪间充质干细胞复苏后的存活率还在90％以上。保存过程中无需液氮，经保存后的脂肪间充质干细胞复苏后存活率高，仍能保持较好的增殖活性。
19.本发明还提供了上述添加剂的具体应用，将上述添加剂加入至培养基中用于脂肪间充质干细胞的保存，操作方便，保存条件易于实现，降低了脂肪间充质干细胞的保存成本。
附图说明
20.图1为本发明实施例1，对比例1至7中的脂肪间充质干细胞的增殖曲线。
具体实施方式
21.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
22.本发明实施例以及对比例所用的脂肪间充质干细胞采用以下方法制备得到：将脂肪组织用pbs清洗干净，用手术剪剪成约1-2mm3大小的碎块，加入等体积的0.1％ⅰ型胶原酶，在37℃振荡消化30min，消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1000r/min，离心10min，弃上清，将细胞沉淀采用培养基(dmem/f12，10％fbs)重悬，细胞密度调整至1
×
105个/ml，然后接种在t75培养瓶中在37℃，5％co2培养箱中进行培养，待细胞融合度达到85％后，加入0.25％胰酶和0.02％edta消化细胞，向消化后的细胞中加入培养基，转移至离心管中进行离心，弃上清后再次加入培养基进行重悬，作为p0代细胞进行传代培养，以1:2的比例进行传代培养，取处于对数生长期的p3代细胞进行保存实验。
23.实施例1
24.一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，添加剂在低糖dmem培养基中的质量浓度为：甘露醇2mg/ml、丝素蛋白10μg/ml、多库酯钠8μg/ml、谷胱甘肽3μg/ml、甘油0.8mg/ml、槲皮素12ng/ml。
25.上述脂肪间充质干细胞保存用添加剂的应用，包括以下步骤：
26.(1)向培养基中加入添加剂，混合均匀得到保存液，备用；
27.(2)将待保存的脂肪间充质干细胞加入步骤(1)的保存液重悬，分装在2ml的冻存管中，保存液中脂肪间充质干细胞密度为1
×
107个/ml；
28.(3)将步骤(2)的保存液程序降温至-80℃，程序降温过程为：以1℃/min降温至-20℃，再以15℃/min降温至-80℃保存。
29.实施例2
30.一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，添加剂在低糖dmem培养基中的质量浓度为：甘露醇1mg/ml、丝素蛋白7μg/ml、多库酯钠5μg/ml、谷胱甘肽1μg/ml、甘油0.5mg/ml、槲皮素10ng/ml。
31.上述脂肪间充质干细胞保存用添加剂的应用，包括以下步骤：
32.(1)向培养基中加入添加剂，混合均匀得到保存液，备用；
33.(2)将待保存的脂肪间充质干细胞用步骤(1)的保存液重悬，分装在2ml的冻存管中，保存液中脂肪间充质干细胞密度为2
×
107个/ml；
34.(3)将步骤(2)的保存液程序降温至-80℃，程序降温过程为：以2℃/min降温至-20℃，再以18℃/min降温至-80℃保存。
35.实施例3
36.一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，添加剂在低糖dmem培养基中的质量浓度为：甘露醇5mg/ml、丝素蛋白12μg/ml、多库酯钠10μg/ml、谷胱甘肽5μg/ml、甘油1mg/ml、槲皮素15ng/ml。
37.上述脂肪间充质干细胞保存用添加剂的应用，包括以下步骤：
38.(1)向培养基中加入添加剂，混合均匀得到保存液，备用；
39.(2)将待保存的脂肪间充质干细胞用步骤(1)的保存液重悬，分装在2ml的冻存管中，保存液中脂肪间充质干细胞密度为3
×
107个/ml；
40.(3)将步骤(2)的保存液程序降温至-80℃，程序降温过程为：以3℃/min降温至-20℃，再以20℃/min降温至-80℃保存。
41.对比例1
42.对比例1提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于省去丝素蛋白，其余均和实施例1相同。
43.对比例2
44.对比例2提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于省去多库酯钠，其余均和实施例1相同。
45.对比例3
46.对比例3提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于省去丝素蛋白、多库酯钠，其余均和实施例1相同。
47.对比例4
48.对比例4提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于将丝素蛋白替换为聚乳酸，其余均和实施例1相同。
49.对比例5
50.对比例5提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于省去丝素蛋白，将多库酯钠的用量调整为18μg/ml，其余均和实施例1相同。
51.对比例6
52.对比例6提供一种脂肪间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别在于省去多库酯钠，将丝素蛋白的用量调整为18μg/ml，其余均和实施例1相同。
53.在实施例1，对比例1至6中的脂肪间充质干细胞保存前以及保存1个月、3个月取样，在37℃的水浴中快速复苏，采用0.4％的台盼蓝染色，统计各组脂肪间充质干细胞活率，
每组数据均取三管的平均值，结果如表1所示。
54.表1
[0055][0056]
由表1可以看出，实施例1，对比例1至6中的脂肪间充质干细胞在保存前细胞存活率相差不大，随着保存时间的延长，细胞存活率的下降趋势不同。
[0057]
实施例1中的脂肪间充质干细胞在保存3个月后细胞存活率为90.73
±
1.21％。对比例1和对比例2中分别省去了丝素蛋白和多库酯钠，对比例3同时省去丝素蛋白、多库酯钠，在细胞保存3个月后细胞存活率下降至83.25
±
2.21％、81.12
±
2.05％和73.25
±
2.59％，低于实施例1。对比例4中将丝素蛋白替换为聚乳酸，对比例5和对比例6中在省去丝素蛋白、多库酯钠中的一种后，增加剩余成分的用量，在保存3个月后细胞存活率仍不及实施例1。由此可知本发明添加剂中的丝素蛋白和多库酯钠协同作用，有助于提高脂肪间充质干细胞的存活率。
[0058]
取实施例1，对比例1至6中保存3个月的脂肪间充质干细胞在37℃水浴中快速复苏，离去去除保存液，加入培养基(dmem/f12，10％fbs)重悬细胞，调整细胞密度为1
×
104个/ml，在96孔板中进行培养，将未经保存的脂肪间充质干细胞作为对比例7，在同等条件下进行培养，培养条件为37℃，5％co2的培养箱，24h后每天取样吸弃培养液，加入cck-8溶液，在培养箱中避光静置4h，在490nm波长处测量吸光度值(a)，每组数据均取三孔的平均值，连续检测8天，绘制细胞的生长曲线，结果如图1所示。
[0059]
由图1可以看出，实施例1中细胞增殖能力和对比例7中未经保存的脂肪间充质干细胞相差不大。对比例1至6中调整了添加剂的组成，脂肪间充质干细胞的增殖能力有不同程度的下降，增殖速度不及实施例1中保存的细胞。说明采用本发明的添加剂，在-80℃下保存3个月后脂肪间充质干细胞的增殖活性基本不受影响，调整添加剂的组成后细胞增殖活性受到不同程度的影响。
[0060]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。