肝特异性的基因编辑纳米药物及其制备方法和应用

1.本技术属于生物医药技术领域，尤其涉及肝特异性的基因编辑纳米药物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.crispr基因编辑系统是本世纪最为重要的生物发现之一。目前，crispr/cas9系统被广泛的应用于各种遗传和传染等疾病治疗的研究，如：心血管疾病、单基因白内障疾病、癌症、代谢紊乱、人类免疫缺陷病毒感染和阿尔茨海默氏症等。然而，在复杂的生物系统中，crispr/cas9基因编辑在时间维度和空间维度上仍然需要做到更加精确地控制。更具体地说，当使用crispr/cas9基因编辑时，应避免在非特定的时间和非靶向的位置对基因进行编辑从而造成对细胞分化或者组织发育的干扰。此外crispr/cas9基因编辑过程产生的脱靶效应或细胞毒性往往来源于cas9核酸蛋白酶的活性无法控制。因此，为了使基因毒性和脱靶效应最小化，使治疗效果最大化，必须在复杂的生物系统中实现对crispr/cas9活性的时空精准控制。构建时空可控性的crispr/cas9编辑系统是推动其临床应用的关键问题。
3.肝炎病毒，特别是乙肝病毒(hepatitis b virus,hbv)感染是一个全球性的公共卫生问题。在我国，慢性hbv感染者约7000万例，病毒性肝炎依然是传染病中报告病例数第一的乙类传染病，严重威胁我国人民的生命和健康。病毒性肝炎如果持续感染和进展，会导致肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌。科学家致力于hbv致病机理及相关抗病毒药物的研究，旨在提高临床治疗效果。目前，用于临床上抗乙型肝炎病毒的药物主要为干扰素(interferion,ifn)和以拉米夫定(lamivudine,lam)为代表的核苷类似物。尽管科学家们后期探寻了各种类型的治疗药物如：抑制hbv生命周期的核苷酸抑制剂和病毒核衣壳蛋白抑制剂等，但均无法治愈慢性乙型肝炎，其中的根本原因是现有的药物均不能彻底清除hbv复制的原始模板hbv cccdna。一旦停止服用药物后，患者体内残存的hbv cccdna又可复制表达产生大量的hbv病毒，从而增加了慢性hbv感染的治疗难度。
4.基因编辑治疗的医学手段，特别是crispr基因编辑技术的出现，为慢性hbv感染治疗中彻底清除hbv cccdna提供了新的思路和希望。相关研究表明，通过设计针对hbv cccdna的grna，crispr/cas9可特异性靶向和剪切hbv cccdna，从而有效的抑制hbv的复制。相关研究证明了，在hbv稳转细胞模型hep g2.2.15和hepg2.a64以及hbv感染的小鼠模型中，crisrp/cas9系统都可以成功降低乙肝标志物hbsag和hbv cccdna的含量从而抑制hbv病毒的复制和表达。尽管目前的研究已经证实crispr/cas9技术在hbv基因治疗方面具有良好的应用前景。然而，如何在体内调控crispr/cas9系统安全有效地精准递送和释放到肝细胞并对靶基因进行编辑，进而提高基因编辑系统的时空活性并降低其脱靶风险，是当前研究的一个热点和难点。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术提供了肝特异性的基因编辑纳米药物及其制备方法和应用，通
过整合肝脏的主动和被动靶向、肝特异性表达质粒等策略，协同实现基因编辑系统在肝脏部位的时间和空间特异性，用于编辑肝炎病毒的dna，从根本上清除肝炎病毒。
6.本技术第一方面提供了肝特异性的基因编辑纳米药物，包括：磁性纳米颗粒、肝靶向配体物和肝特异性基因编辑质粒；
7.所述肝靶向配体物包裹在所述磁性纳米颗粒上，形成带正电纳米颗粒；所述肝特异性基因编辑质粒通过静电作用与所述带正电纳米颗粒自组装，得到肝特异性的基因编辑纳米药物。
8.另一实施例中，所述磁性纳米颗粒选自不同尺寸疏水性超顺磁性纳米颗粒(i)，或者不同尺寸亲水性超顺磁性纳米颗粒(ii)中的一种或两种。具体的，所述磁性纳米颗粒选自粒径为2nm-100nm疏水性超顺磁性纳米颗粒或/和粒径为2nm-100nm亲水性超顺磁性纳米颗粒。
[0009][0010]
优选的，疏水性超顺磁性纳米颗粒(i)的尺寸范围是2nm-100nm。
[0011]
优选的，亲水性超顺磁性纳米颗粒(ii)的尺寸范围是2nm-100nm。
[0012]
优选的，疏水性磁性纳米颗粒(i)由油酸或者油胺等疏水性分子修饰而成。
[0013]
优选的，亲水性磁性纳米颗粒(ii)由氨基化、羧基化等亲水性分子修饰而成。
[0014]
另一实施例中，所述肝靶向配体物包括肝靶向配体和阳离子聚合物；
[0015]
所述肝靶向配体和所述阳离子聚合物通过化学键合得到肝靶向配体物。
[0016]
所述肝靶向配体选自半乳糖(gal)、n-乙酰氨基半乳糖、去唾液酸糖蛋白、hbv前s1肽、乳糖、乳糖基去甲斑蝥素、甘草次酸、大豆衍生大豆甾醇葡糖苷等可靶向肝实质细胞的分子中的一种或多种。
[0017]
所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、氟修饰聚乙烯亚胺(f-pei)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、聚赖氨酸、壳聚糖中的一种或多种。
[0018]
所述肝靶向配体物选自半乳糖-聚乙烯亚胺、半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺(gal-f-pei)、n-乙酰氨基半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺，去唾液酸糖蛋白-氟修饰聚乙烯亚胺、hbv前s1肽-氟修饰聚乙烯亚胺、乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺、乳糖基去甲斑蝥素-氟修饰聚乙烯亚胺、甘草次酸-聚乙烯亚胺、甘草次酸-氟修饰聚乙烯亚胺、大豆衍生大豆甾醇葡糖苷-氟修饰聚乙烯亚胺、半乳糖-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、n-乙酰氨基半乳糖-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、去唾液酸糖蛋白-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、hbv前s1肽-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、乳糖-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、乳糖基去甲斑蝥素-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、大豆衍生大豆甾醇葡糖苷-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、半乳糖-聚赖氨酸、n-乙酰氨基半乳糖-聚赖氨酸、去唾液酸糖蛋白-聚赖氨酸、hbv前s1肽-磷脂酰乙醇胺-聚赖氨酸、乳糖-聚赖氨酸、乳糖基去甲斑蝥素-磷脂酰乙醇胺-聚赖氨酸和大豆衍生大豆甾醇葡糖苷-聚赖氨酸中的一种或多种。
[0019]
另一实施例中，所述半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei的制备方法包括：
[0020]
步骤一、将不同分子量的支化聚乙烯亚胺(pei)与3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯反应，合成氟修饰聚乙烯亚胺(f-pei)。以氘代水为溶剂，通过1hnmr(500mhz,bruker)验证所合成的f-pei的特征峰。
[0021]
优选的，pei的分子量范围1.8kda-25kda。
[0022]
优选的，合成后的f-pei的氟化取代度为5％-100％。
[0023]
步骤二、将活化后的乳糖酸与所述氟修饰聚乙烯亚胺f-pei混合反应，制得半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei。
[0024]
另一实施例中，所述肝特异性基因编辑质粒包括肝特异性启动子和基因编辑系统；所述基因编辑系统对肝炎病毒基因组进行切割编辑，从而抑制所述肝炎病毒在肝细胞中的复制。
[0025]
具体的，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒；更具体的基因编辑靶点为hbv cccdna。
[0026]
所述肝特异性启动子为一种肝特异性启动子与肝特异性增强子组合的嵌合型启动子，选自载脂蛋白基因的增强子apoe.hcr与人类α1-抗胰蛋酶启动子组合的嵌合型启动子apoe.hcr.haat(addgene#64073)、人乙型肝炎病毒增强子ii(eii)与白蛋白基因启动子组合的嵌合型启动子eii-palb(gene id:111832673)，人乙型肝炎病毒增强子ii(eii)与血液结合素基因启动子组合的嵌合型启动子eii-phpx(gene id:3263)中的一种或多种；
[0027]
所述基因编辑系统选自crispr/cas9基因编辑系统、cas12基因编辑系统、cas13基因编辑系统、巨型核酸酶基因编辑系统、锌指核酸酶zfns基因编辑系统、转录激活样效应因子核酸酶talen基因编辑系统中的一种或多种。
[0028]
具体的，利用肝脏特异性启动子apoe.hcr.haat构建编辑hbv cccdna的肝脏特异性的crispr/cas9系统，提高基因编辑精准性，大大减少了crispr/cas9系统进入非肝脏组织进行基因编辑而产生的脱靶效应。同时本技术选用的crispr/cas9系统可含有一个或两个grna构建窗口，增加了对hbv cccdna基因编辑的灵活性。
[0029]
具体的，本技术以外磁场调控的器官聚集为一级靶向，以半乳糖配体导向的肝细胞特异性结合为二级靶向，以肝特异性启动子控制的细胞选择性基因编辑为三级靶向，制备逐级靶向纳米颗粒，构建清除hbv cccdna的时空可控型的crispr/cas9精确递送体系，在细胞水平和动物水平揭示其时空递送机制、评估其清除肝细胞中hbv的疗效和安全性。
[0030]
(1)利用外部磁场调控的空间富集作为被动靶向(一级靶向)，通过半乳糖配体导向的肝细胞特异性结合(二级靶向)和肝特异性启动控制的细胞选择性基因编辑(三级靶向)作为主动靶向，设计逐级靶向纳米颗粒。三级靶向的协同作用下，保证了crispr/cas9系统精准递送和特异性编辑。
[0031]
(2)利用肝脏特异性启动子apoe.hcr.haat构建编辑hbv cccdna的肝脏特异性的crispr/cas9系统，提高基因编辑精准性，大大减少了crispr/cas9系统进入非肝脏位置进行基因编辑而产生的脱靶效应。同时我们选用的crispr/cas9系统存在两个grna构建窗口，增加了对hbv cccdna基因编辑的灵活性。
[0032]
(3)通过磁性纳米粒核心的设计，整合载体的成像和递送功能，实现体内示踪和对hbv cccdna特异性基因编辑，从根源上抑制hbv的复制和传染。
[0033]
本技术第二方面提供了肝特异性的基因编辑纳米药物的制备方法，包括：
[0034]
步骤1、通过双溶剂法，将肝靶向配体物、油酸或者羧基官能团修饰的磁性纳米颗
粒和溶剂体系混合反应，除去所述溶剂体系后，纯化并浓缩，得到带正电纳米颗粒，其中，所述肝靶向配体物包裹在所述磁性纳米颗粒上。
[0035]
步骤2、将所述带正电磁性纳米颗粒与肝特异性基因编辑质粒按质量比0.5:1-6:1混合，自组装得到肝特异性的基因编辑纳米药物，其中，所述肝特异性基因编辑质粒负载在所述带正电纳米颗粒上形成一个杂化纳米团簇。
[0036]
本技术第三方面提供了所述的基因编辑纳米药物或所述制备方法制得的基因编辑纳米药物在治疗肝炎疾病药物中的应用。
[0037]
具体的：(1)通过crispr design tool，设计针对hbv cccdna复制和繁衍有高度相关的多个基因编码区的grna，包括逆转录酶基因编码区、病毒内衣壳结构蛋白hbeag和hbcag编码区、病毒外壳蛋白hbsag的编码区。将不同功能的grna逐一、或者多个同时构建到crispr/cas9质粒。得到靶向hbv cccdna的基因编辑crispr/cas9质粒。
[0038]
(2)通过高压尾静脉注射hbv质粒至c57bl/6小鼠，构建hbv感染的小鼠模型，并挑选乙肝病毒表面抗原水平表达一致的小鼠用于后续实验。
[0039]
(3)通过尾静脉注射带有肝特异性基因编辑质粒的磁性纳米药物至hbv感染小鼠体内。并在肝脏位置添加外磁场，诱导磁性纳米粒趋向肝脏位置，进行肝特异性的精准基因编辑。随后通过elisa，qpcr、wb、基因测序等实验验证上述纳米基因编辑系统对hbv cccdna的清除能力。
[0040]
如何构建时间和空间可控型的基因编辑系统，提高基因编辑系统的时空活性并降低其脱靶风险，是实现肝炎病毒特异性编辑和清除的关键难题之一。
[0041]
本技术的肝特异性的基因编辑纳米药物具有三级靶向作用，一级被动靶向：利用外部磁场通过磁性纳米颗粒，调控基因编辑纳米药物在肝脏空间富集；二级主动靶向：通过肝靶向配体物，介导肝细胞特异性结合；三级主动靶向：肝特异性基因编辑质粒的肝特异性启动，精准控制细胞选择性基因编辑。在这三级靶向的协同作用下，保证了肝特异性基因编辑质粒实现精准递送和特异性编辑(如图13)。
附图说明
[0042]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0043]
图1为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的结构示意图。
[0044]
图2为本技术实施例提供的油酸修饰的超顺磁性氧化铁颗粒的合成路线以及相应表征数据。
[0045]
图3为本技术实施例提供的油酸修饰的超顺磁性氧化铁颗粒表征的粒径数据。
[0046]
图4为本技术实施例提供的半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei的合成路线。
[0047]
图5为本技术实施例提供的氟修饰聚乙烯亚胺f-pei的核磁测定数据。
[0048]
图6为本技术实施例提供的含肝特异性apoe.hcr.haat启动子的crispr/cas9的表达质粒的合成路线图(a)，以及特异性验证相关数据(b,c,d)。
[0049]
图7为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物np2的电镜图。
[0050]
图8为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的磁转染水平数据。
[0051]
图9为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的细胞毒性数据。
[0052]
图10为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物在细胞水平水对hbvdna的编辑效果。
[0053]
图11为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物在组织水平的空间特异性表达的证明。
[0054]
图12为本技术提供的肝特异性的基因编辑纳米药物在动物水平对hbv感染小鼠的治疗效果验。
[0055]
图13为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的逐级靶向递送模式图。
具体实施方式
[0056]
本技术提供了肝特异性的基因编辑纳米药物及其制备方法和应用，用于解决现有技术中无法从根本上清除肝炎病毒的技术缺陷，并提高其精准性。
[0057]
下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0058]
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
[0059]
请参阅图1，图1为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的结构示意图，本技术的肝特异性的基因编辑纳米药物，包括：肝靶向配体物1、磁性纳米颗粒2和肝特异性基因编辑质粒4；肝靶向配体物1包裹在磁性纳米颗粒2的表面，形成带正电纳米颗粒3；肝特异性基因编辑质粒4通过静电相互作用与带正电纳米颗粒3自组装形成一个杂化纳米团簇，得到肝特异性的基因编辑纳米药物5。
[0060]
具体的，肝靶向配体物1可以为半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei，磁性纳米颗粒2为mnp，带正电纳米颗粒3为gal-f-pei@mnp，肝特异性基因编辑质粒4为质粒dna，肝特异性的基因编辑纳米药物5为gfmnp
pdna
。
[0061]
实施例1
[0062]
本技术实施例提供了油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)的制备，具体方法包括：
[0063]
将乙酰丙酮铁(2mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)、油酸(6mmol)、油胺(6mmol)、二苄醚(20ml)混合在一个三颈圆底烧瓶中。在脱氧环境下剧烈搅拌加热至200℃，并维持2h(使用n2鼓泡脱氧)，而后继续加热至300℃，回流1h。反应结束，将温度充分降低至室温。用40ml乙醇沉降产物，离心分离(6000rpm，10min)，最后分散在正己烷中备用，得到油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)。通过透射电镜对合成纳米颗粒进行形貌和元素表征，通过磁学系统对合成纳米粒的磁性能进行表征。利用纳米粒度分析仪对纳米粒径进行表征。
[0064]
实验结果显示，本实施例所制备得到mnp的粒径为4nm。
[0065]
实施例2
[0066]
本技术实施例提供了油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)的制备，具体方法包括：
[0067]
请参阅图2，图2a为本技术实施例提供的油酸修饰的超顺磁性氧化铁颗粒的合成路线。将乙酰丙酮铁(2mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)、油酸(6mmol)、油胺(6mmol)、二苯醚(20ml)混合在一个三颈圆底烧瓶中。在脱氧环境下剧烈搅拌下加热至200℃，并维持
30min(使用n2鼓泡脱氧)，而后继续加热至265℃，回流30min。反应结束，将温度充分降低至室温。用40ml乙醇沉降产物，离心分离(6000rpm，10min)，最后分散在正己烷中备用，得到油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)。通过透射电镜对合成纳米颗粒进行颗粒形貌和元素表征(图2b,c)，通过磁学系统对合成纳米粒的磁性能进行表征(图2d)。利用纳米粒度分析仪对纳米粒径进行表征。
[0068]
实验结果显示，本实施例所制备得到mnp的粒径为6nm(图3)。
[0069]
实施例3
[0070]
本技术实施例提供了油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)的制备，具体方法包括：
[0071]
将实施例2合成的6nm磁性纳米粒、乙酰丙酮铁(2mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)、油酸(2mmol)、油胺(2mmol)、二苄醚(20ml)混合在一个三颈圆底烧瓶中。在脱氧环境下剧烈搅拌下加热至100℃，并维持30min(使用n2鼓泡脱氧)，而后继续加热至200℃，回流1h，加热至300℃并维持30min。反应结束，将温度充分降低至室温。用40ml乙醇沉降产物，离心分离(6000rpm，10min)，最后分散在正己烷中备用，得到油酸修饰的磁性纳米颗粒(简称mnp)。通过透射电镜对合成纳米颗粒进行颗粒形貌和元素表征，通过磁学系统对合成纳米粒的磁性能进行表征。利用纳米粒度分析仪对纳米粒径进行表征。
[0072]
实验结果显示，本实施例所制备得到mnp的粒径为8nm。
[0073]
实施例4
[0074]
本技术实施例提供购买自江苏先丰纳米材料科技有限公司一些油酸修饰的疏水性磁性纳米颗粒：粒径为10nm的疏水性磁性纳米粒(货号：102672)，粒径为30nm的疏水性磁性纳米粒(货号：103180)；以及羧基化分子修饰的亲水性纳米颗粒：粒径为10nm的亲水性磁性纳米粒(货号：102940)。
[0075]
实施例5
[0076]
本技术实施例提供了半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei(25kda)的制备，具体方法包括：
[0077]
请参阅图4，图4为本技术实施例提供的半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei(25kda)的合成路线。
[0078]
步骤1：取支化pei(25kda，25mg)溶解于200μl ddh2o中，将其涡旋混匀。取3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯(33.5mg)溶解于20ml无水乙醇中，将其涡旋混匀。将支化pei(25kda)溶液与3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯乙醇溶液充分混匀，在室温(25℃)下剧烈搅拌48h。反应产物在无水乙醇中透析24h(mwco:3500)，在ddh2o中透析24h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到f-pei(25kda)。以氘代水为溶剂，通过1hnmr(500mhz,bruker)对合成的f-pei(25kda)进行结构表征(见图5)。
[0079]
步骤2：取乳糖酸(la，0.537g)溶解于1.5ml ddh2o。在la溶液中加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，10mg/ml)，在4℃搅拌活化20min。取步骤1的f-pei(25kda，1.72g)溶于10ml ddh2o，将其涡旋混匀。将活化后的la溶液加入f-pei(25kda)溶液，在室温(25℃)下剧烈搅拌72h合成gai-f-pei(25kda)，反应产物在ddh2o中透析72h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到gal-f-pei(25kda)。以氘代水为溶剂，通过1h nmr(500mhz,bruker)对合成的gal-f-pei(25kda)进行结构表征。
[0080]
本实施例成功制得半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺为gal-f-pei(25kda)。
[0081]
实施例6
[0082]
本技术实施例提供半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei(10kda)的制备，具体方法包括：
[0083]
步骤1：取支化pei(10kda，25mg)溶解于200μl ddh2o中，将其涡旋混匀。取3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯(33.5mg)溶解于20ml无水乙醇中，将其涡旋混匀。将支化pei(10kda)溶液与3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯乙醇溶液充分混匀，在室温(25℃)下剧烈搅拌48h。反应产物在无水乙醇中透析24h(mwco:3500)，在ddh2o中透析24h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到f-pei(10kda)。以氘代水为溶剂，通过1hnmr(500mhz,bruker)对合成的f-pei(10kda)进行结构表征
[0084]
步骤2：取乳糖酸(la，0.537g)溶解于1.5ml ddh2o。在la溶液中加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，10mg/ml)，在4℃搅拌活化20min。取步骤1的f-pei(10kda，1.72g)溶于10ml ddh2o，将其涡旋混匀。将活化后的la溶液加入f-pei(10kda)溶液，在室温(25℃)下剧烈搅拌72h合成gai-f-pei(10kda)，反应产物在ddh2o中透析72h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到gal-f-pei(10kda)。以氘代水为溶剂，通过1h nmr(500mhz,bruker)对合成的gal-f-pei(10kda)进行结构表征。
[0085]
本实施例成功制得半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺为gal-f-pei(10kda)。
[0086]
实施例7
[0087]
本技术实施例提供了半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺gal-f-pei(1.8kda)的制备，具体方法包括：
[0088]
步骤1：取支化pei(1.8kda，25mg)溶解于200μl ddh2o中，将其涡旋混匀。取3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯(33.5mg)溶解于20ml无水乙醇中，将其涡旋混匀。将支化pei(1.8kda)溶液与3-(1h,1h,5h-八氟戊氧基)-1,2-氧化丙烯乙醇溶液充分混匀，在室温(25℃)下剧烈搅拌48h。反应产物在无水乙醇中透析24h(mwco:3500)，在ddh2o中透析24h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到f-pei(1.8kda)。以氘代水为溶剂，通过1hnmr(500mhz,bruker)对合成的f-pei(1.8kda)进行结构表征
[0089]
步骤2：取乳糖酸(la，0.537g)溶解于1.5ml ddh2o。在la溶液中加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，10mg/ml)，在4℃搅拌活化20min。取步骤1的f-pei(1.8kda，1.72g)溶于10ml ddh2o，将其涡旋混匀。将活化后的la溶液加入f-pei(1.8kda)溶液，在室温(25℃)下剧烈搅拌72h合成gai-f-pei(1.8kda)，反应产物在ddh2o中透析72h(mwco:3500)，然后冷冻干燥得到gal-f-pei(1.8kda)。以氘代水为溶剂，通过1h nmr(500mhz,bruker)对合成的gal-f-pei(1.8kda)进行结构表征。
[0090]
本实施例成功制得半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺为gal-f-pei(1.8kda)。
[0091]
实施例8
[0092]
本技术实施例提供了肝特异性基因编辑质粒的制备，具体方法包括：
[0093]
本技术实施例采用的肝特异性基因编辑质粒为含有肝特异性apoe.hcr.haat启动子的crispr/cas9的表达质粒。合成路线请参阅图6a。为了便于验证后期构建的crispr/cas9质粒的特异性。从px458质粒(addgene#48138)上扩增绿色荧光蛋白序列egfp，通过基因工程技术连接到crispr/cas9质粒px333(addgene#64073)，得到可表达绿色荧光蛋白的crispr/cas9质粒px333-egfp(简称pxg333)。随后从质粒ptc-apoe-tet(addgene#64073)扩
增肝特异性启动子apoe.hcr.haat，通过酶切和酶连替换掉pxg333的原始启动子chickenβ-actin，从而构建得到可同时表达cas9和egfp的肝特异性crispr/cas9质粒，简称pag333。
[0094]
肝细胞中特异性表达的验证：分别将无肝特异性启动子的crispr/cas9质粒pxg333和有肝特异性启动子的crispr/cas9质粒pag333，通过lipofectamine
tm 3000转染试剂分别转染至hepg2肝癌细胞和hela、hek293t、hct116、4t1等非肝癌细中。取转染后24h、48h和72h的样品，用倒置荧光显微镜观察不同质粒在不同细胞中的egfp荧光表达强度。用流式细胞仪定量不同质粒转染不同细胞后egfp表达的阳性率，来评价所构建的肝特异性质粒pag333在肝细胞中表达蛋白的特异性。
[0095]
图6b为无肝特异性启动子的pxg333和有肝特异性启动子的pag333转染hepg2、hela和hek293t三株细胞，所测得的egfp表达量流式图。blank为用pbs替代质粒转染的结果，并计算上述两种质粒在肝细胞和非肝细胞中的egfp表达率(图6c)，同时用倒置荧光显微镜观察pxg333和pag333转染hepg2、hela和hek293t三株细胞所表达egfp的荧光强度(图6d)。上述结果表明，经过肝特异性启动子改造后，显著降低了crispr/cas9质粒在非肝细胞中的蛋白表达，提高了其在肝细胞中的特异性表达。
[0096]
实施例9
[0097]
本技术实施例中半乳糖-氟修饰聚乙烯亚胺(gal-f-pei)包被磁性纳米粒mnp形成带正电的纳米粒gal-f-pei@mnp的方法:
[0098]
图1为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的结构示意图。本技术实施例肝特异性的基因编辑纳米药物以mnp为内核，gal-f-pei复合在mnp的表面形成带正电亲水性纳米颗粒(简称gal-f-pei@mnp)。具体方法包括：
[0099]
通过双溶剂法制备gal-f-pei@mnp纳米粒。将实施例2制得的油酸修饰的疏水性6nmmnp和实施例5制得的gal-f-pei(25kda)，按质量比1:8溶解于2ml氯仿(thms)中，再加入3ml二甲基亚砜(dmso)配成5ml混合体系，室温下振荡30min，通过旋转蒸发仪除去氯仿，将剩余的液体在ddh2o中透析3天(mwco:3500)，通过100kda超滤管浓缩，得到gal-f-pei(25kda)@mnp纳米粒，避光保存于4℃冰箱。
[0100]
本实施例所述的gal-f-pei(25kda)@mnp纳米粒，经纳米粒度与电位仪测试，粒径和表面电位分别为30nm，10mv。
[0101]
实施例10
[0102]
通过双溶剂法制备gal-f-pei@mnp纳米粒。将实施例2制得的油酸修饰的疏水性6nmmnp和实施例6制得的gal-f-pei(10kda)，按质量比1:12溶解于2ml氯仿(thms)中，再加入3ml二甲基亚砜(dmso)配成5ml混合溶液，室温下振荡30min，通过旋转蒸发仪除去氯仿，将剩余的液体在ddh2o中透析3天(mwco:3500)，通过100kda超滤管浓缩，得到gal-f-pei(10kda)@mnp纳米粒，避光保存于4℃冰箱。
[0103]
本实施例所述的gal-f-pei(10kda)@mnp纳米粒，经纳米粒度与电位仪测试，粒径和表面电位分别为25nm，8mv。
[0104]
实施例11
[0105]
通过双溶剂法制备gal-f-pei@mnp纳米粒。将实施例2制得的油酸修饰的疏水性6nmmnp和实施例7制得的gal-f-pei(1.8kda)，按质量比1:16溶解于2ml氯仿(thms)中，再加入3ml二甲基亚砜(dmso)配成5ml混合溶液，室温下振荡30min，通过旋转蒸发仪除去氯仿，
将剩余的液体在ddh2o中透析3天(mwco:3500)，通过100kda超滤管浓缩，得到gal-f-pei(1.8kda)@mnp纳米粒，避光保存于4℃冰箱。
[0106]
本实施例所述的gal-f-pei(1.8kda)@mnp纳米粒，经纳米粒度与电位仪测试，粒径和表面电位分别为29nm，6mv。
[0107]
实施例12
[0108]
提供肝特异性的基因编辑纳米药物的制备，具体方法包括：
[0109]
图1为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的结构示意图。本技术实施例肝特异性的基因编辑纳米药物以mnp为内核，gal-f-pei包覆在mnp的表面形成带正电的亲水性纳米颗粒(简称gal-f-pei@mnp)，肝特异性基因编辑质粒通过静电作用与gal-f-pei@mnp自组装形成杂化的纳米团簇。具体方法包括：
[0110]
将实施例8制得的肝特异性crispr/cas9质粒pag333溶解于ddh2o液体中得到a液，将实施例9制得的gal-f-pei(25kda)@mnp溶解于ddh2o液体中得到b液。按pag333与gal-f-pei(25kda)@mnp质量比为1:1，1:2、1:3进行自组装复合，室温孵育30min，获得3种基因编辑纳米药物，分别命名为np1、np2和np3。图7为通过电镜拍摄所得的np2纳米粒。
[0111]
实施例13
[0112]
将实施例8制得的肝特异性crispr/cas9质粒pag333溶解于ddh2o液体中得到a液，将实施例10制得的gal-f-pei(10kda)@mnp溶解于ddh2o液体中得到b液。按pag333与gal-f-pei(10kda)@mnp质量比为1:1，1:2、1:3进行自组装复合，室温孵育30min，获得3种基因编辑纳米药物，分别命名为np4、np5和np6。
[0113]
实施例14
[0114]
本实施例证明合成的磁性纳米粒在磁场作用下促进了crispr/cas9质粒在细胞水平的转染能力。具体方法如下：
[0115]
将实施例12和实施例13中制备的肝特异性的基因编辑纳米药物np1、np2、np3、np4、np5、np6在有无磁场的作用下转染hela细胞，磁场作用6h后，移除磁场，更换新鲜培养液。继续培养48h后，用荧光显微镜对比有无磁场作用，质粒转染后细胞中egfp表达的水平(图8a)，用流式细胞仪测定这六种纳米粒的egfp阳性细胞数(图8b)。结果显示六种纳米粒在磁场作用下的转染效率显著高于没有磁场作用的实验组。特别是np2、np4、np5和np6纳米粒的磁转染效率分别可达到54.21％，51.23％，59.10％和57.91％。
[0116]
实施例15
[0117]
通过本实施例的实验，研究不同纳米药物的细胞毒性。将实施例12和实施例13中制备的肝特异性的基因编辑纳米药物np1、np2、np3、np4、np5、n6分别磁转染hepg2细胞和hek293t细胞。转染6h后，利用cck8试剂测定这六种纳米药物的细胞存活率(图9)。结果显示，转染效率较高的np2，np4、np5、n6四种纳米药物中，np2的细胞毒性最低。
[0118]
实施例16
[0119]
本实施例，在细胞水平验证本发明的肝特异性的基因编辑纳米药物对乙肝病毒的基因编辑治疗效果。具体方法如下：
[0120]
(1)根据hbv dna的基因组(图10a)，设计两个特异性靶向hbv dna的两个grna(sgx和sgpol)，并将其构建到肝特异性crispr/cas9质粒pag333上，得到可编辑hbv cccdna的质粒pag333/sgxp(图10b)。
[0121]
(2)利用商业脂质体lipofectamine
tm 3000，将1μg的pbb4.5-1.2
×
hbv质粒分别转染至用24孔板过夜培养，且细胞密度达到70％-90％的hepg2和huh7肝癌细胞中，构建乙肝病毒感染的肝细胞hepg2和huh7。
[0122]
(3)利用实施例12制备np2的方法，制备含pag333/sgxp的肝特异性的基因编辑纳米药物并命名gfmnp
pag333/sgxp
。在(2)操作完乙肝病毒感染肝细胞hepg2和huh7的步骤后，立即取0.5μl gfmnp
pag333/sgxp
(质粒pag333/sgxp含量1μg)均匀滴到(2)构建好的乙肝病毒感染的hepg2和huh7细胞中。随后在每个培养孔底部施加外部磁场，进行磁场诱导转染6h。磁转染结束后，更换培养液，继续培养。
[0123]
(4)培养48h后，提取细胞中的基因组，通过t7e1错配酶剪切(图10c，d)和基因测序分析(图10e,f,g,h)观察到，经过本实施例的肝特异性的基因编辑纳米药物(gfmnp
pag333/sgxp
)处理后，对乙肝病毒的hbvdna两个编辑位点的编辑效率，分别可达到24.3％和20.2％。
[0124]
(5)提取了处理后的细胞上清液，通过elisa法检测培养基中hbv分泌抗原hbsag、hbeag和病毒基因组hbv dna的浓度(图10i)。结果显示，经过处理后的实验组中，乙肝病毒基因组和分泌的乙肝抗原都显著降低。
[0125]
实施例17
[0126]
本实施例用以证明设计的肝特异性的基因编辑纳米药物在动物体内的空间靶向能力，以及对肝组织的特异性蛋白表达能力(图11a)。具体方法如下：
[0127]
将dir染料，以5％的质量浓度标记实施例12制备的复合物gal-f-pei@mnp@pag333(简写gfmnp
pag333
)，并取其200μl，通过尾静脉注射到c57bl/6小鼠体内。与此同时，将外磁场持续定位在肝脏位置2h、4h、6h(图11a)。在不同时间点解剖小鼠的内脏，通过荧光成像观察纳米颗粒在有无磁场的作用下，在体内的分布情况(图11b,c)。同时观察不同组织中crispr/cas9系统中的cas9蛋白表达水平(图11d,e)，证实其肝特异性的精准表达。
[0128]
通过荧光结果可观察到，在磁场的作用下，基因编辑纳米药物主要分布到肝脏位置，但还有少量分布到心、脾、肺、肾上(图11b,c)。通过western blot和qpcr进一步分析肝脏器官和非肝脏器官上cas9蛋白的表达情况，结果显示，在肝特异性启动子作用下，肝脏组织明显表达出cas9或者cas9mrna，而非肝脏组织并未检测到cas9或者cas9 mrna的表达情况。由此证明，本实施例的肝特异性的基因编辑纳米药物可实现动物体内的空间特异性。
[0129]
实施例18
[0130]
本实施例用于证明设计的肝特异性的基因编辑纳米药物可在动物水平对hbv感染的小鼠进行治疗。具体方法如下：
[0131]
(1)hbv感染的小鼠模型构建：将6μgpbb4.5-1.2
×
hbv质粒通过高压尾静脉注射至6-8周龄的c57bl/6小鼠，构建hbv感染的小鼠模型，并挑选乙肝病毒表面抗原表达水平一致的小鼠用于后续实验。
[0132]
(2)取200μl实施例16中验证过在细胞水平对hbv具有编辑能力的肝特异性基因编辑纳米药物gfmnp
pag333/sgxp
(含有6μg质粒pag333/sgxp)，经尾静脉注射至hbv感染的小鼠模型中。并在肝脏位置添加外磁场，诱导6h。随后每天进行眼眶取血，连续取7天，并用elisa检测血清中乙肝病毒表面抗原hbsag和hbeag抗原水平的动态变化。同时牺牲给药后第三天和第七天的小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，并用qpcr、t7e1错配酶剪切、基因测序等方法检测分析
肝脏内hbv dna的编辑情况(图12a,b)。通过免疫荧光图片判定感染hbv小鼠体内的hbsag抗原变化情况(图12c)。通过组织病理学分析(图12d)，检测肝功能指标谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)，肾功能指标urea和crea(图12e)，并监测治疗期间小鼠体重的变化(图12f)，判断本实施例的肝特异性基因编辑纳米药物在体内治疗时的机体安全性。
[0133]
结果显示：使用本实施例的肝特异性基因编辑纳米药物治疗7天后，hbv感染的模型小鼠的血清和肝组织中的乙肝病毒表面抗原(hbsag和hbeag)水平显著降低。同时，通过t7e1错配酶剪切和基因测序分析证实，基因编辑纳米药物对hbv dna的编辑效率可达到12.9％(图12a,b)。此外，肝组织上的hbsag免疫荧光分析也证实，经基因编辑纳米药物治疗7天后，乙肝病毒表面抗原hbsag(红色标记部分)显著降低(图12c)。安全性方面，经过治疗，没有发现明显的组织病变(图12d)，相应的肝功能指标和肾功能指标与对照组相比没有显著差异(图12e)，治疗期间小鼠的体重也保持相对稳定(图12f)。
[0134]
图13为本技术实施例提供的肝特异性的基因编辑纳米药物的逐级靶向递送示意图。如图13a所示，将肝特异性的基因编辑纳米药物通过静脉注入小鼠体内，在外部磁场作用下，基因编辑纳米药物可在肝脏富集。如图13b所示，在肝靶向配体物的作用下，基因编辑纳米药物可与肝细胞特异性结合，促进其细胞内递送。如图13c所示，在肝特异性基因编辑质粒的肝特异性启动子作用下，可对肝细胞进行精准的基因编辑。显然，本技术开发的肝特异性基因编辑纳米药物，在肝炎、肝癌、肝衰竭、肝纤维化等肝脏疾病治疗中具有巨大的应用前景。
[0135]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范。