深静脉血栓SNP位点的检测引物、检测试剂盒的制作方法

深静脉血栓snp位点的检测引物、检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种深静脉血栓snp位点的检测引物、检测试剂盒。


背景技术：

2.深静脉血栓形成（dvt）是血液在深静脉内不正常凝结引起的静脉回流障碍性疾病，常发生于下肢。研究表明factor v基因、factor ii基因以及mthfr基因的相关snp位点与静脉血栓栓塞有密切关系，检测dvt可以通过检测上述基因的相关snp位点实现，但现有的技术只有采用荧光定量pcr平台检测mthfr基因的相关snp位点，而同时检测factor v基因、factor ii基因以及mthfr基因的相关snp位点的检测方法鲜有报道。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提出一种深静脉血栓snp位点的检测引物、检测试剂盒，旨在提出一种同时检测factor v基因、factor ii基因以及mthfr基因与深静脉血栓相关的snp位点的检测引物。
4.为实现上述目的，本发明提出一种深静脉血栓snp位点的检测引物，包括：第一引物组，包括第一正向引物、第二正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示；第二引物组，包括第三正向引物、第四正向引物和第二反向引物，所述第三正向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述第四正向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如seq id no:6所示；第三引物组，包括第五正向引物、第六正向引物和第三反向引物，所述第五正向引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第六正向引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三反向引物的核苷酸序列如seq id no:9所示；第四引物组，包括第七正向引物、第八正向引物和第四反向引物，所述第七正向引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述第八正向引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四反向引物的核苷酸序列如seq id no:12所示；第五引物组，包括第九正向引物、第十正向引物和第五反向引物，所述第九正向引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述第十正向引物的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第五反向引物的核苷酸序列如seq id no:15所示；以及，第六引物组，包括第十一正向引物、第十二正向引物和第六反向引物，所述第十一正向引物的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述第十二正向引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六反向引物的核苷酸序列如seq id no:18所示；其中，所述第一正向引物、所述第二正向引物、所述第三正向引物、所述第四正向引物、所述第五正向引物、所述第六正向引物、所述第七正向引物、所述第八正向引物、所述
第九正向引物、所述第十正向引物、所述第十一正向引物以及所述第十二正向引物的5’端均标记有荧光基团，所述第一正向引物、所述第二正向引物、所述第七正向引物以及所述第八正向引物的核苷酸序列中，h为碱基a、碱基t或碱基c，所述第三正向引物、所述第四正向引物、所述第五正向引物以及所述第六正向引物的核苷酸序列中，d为碱基g、碱基a或碱基t，所述第十正向引物、所述第十一正向引物以及所述第十二正向引物的核苷酸序列中，b为碱基g、碱基t或碱基c。
5.可选地，所述第一正向引物、所述第五正向引物、所述第七正向引物、所述第九正向引物以及所述第十一正向引物的5’端均标记有fam荧光基团。
6.可选地，所述第二正向引物、所述第六正向引物、所述第八正向引物、所述第十正向引物以及所述第十二正向引物的5’端均标记有joe荧光基团。
7.可选地，所述第三正向引物的5’端标记有tmr荧光基团。
8.可选地，所述第四正向引物的5’端标记有rox荧光基团。
9.可选地，所述第一正向引物、所述第二正向引物、所述第七正向引物以及所述第八正向引物的核苷酸序列中，h为碱基a。
10.可选地，所述第三正向引物、所述第四正向引物、所述第五正向引物以及所述第六正向引物的核苷酸序列中，d为碱基t。
11.可选地，所述第十正向引物、所述第十一正向引物以及所述第十二正向引物的核苷酸序列中，b为碱基g。
12.本发明还提出一种深静脉血栓snp位点的检测试剂盒，包括如上所述的深静脉血栓snp位点的检测引物。
13.可选地，还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntp以及水。
14.本发明提供的深静脉血栓snp位点的检测引物中，通过各引物组的核苷酸序列的设计，使得第一引物组能够对factor v基因r506q突变（rs6025）的snp位点进行特异性引物扩增，第二引物组能够对factor v基因h1299r突变（rs1800595）的snp位点进行特异性引物扩增，第三引物组能够对factor v基因y1702c突变（rs118203907）的snp位点进行特异性引物扩增，第四引物组能够对factor ii基因g20210a突变（rs1799963）的snp位点进行特异性引物扩增，第五引物组能够对mthfr基因c677t突变（rs1801133）的snp位点进行特异性引物扩增，第六引物组能够对mthfr基因a1298c突变（rs1801131）的snp位点进行特异性引物扩增，并且，各引物组进行引物扩增得到的产物长度各不相同，而通过各正向引物标记的荧光基团，引物扩增后的产物具有荧光，产物长度与荧光搭配，有助于产物在电泳仪上的基因分型，从而准确检测出与深静脉血栓发生相关的6个snp位点的基因型；尤其针对rs1800595，rs1800595的同源序列较多，对其引物扩增后的产物时有误判，通过核苷酸序列和荧光基团的设计能够有效避免误判的现象；此外，各正向引物的3’端倒数第三个碱基设计成了h、d或b等简并碱基，其能够作为错配位点，有助于增加引物扩增时的特异性。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以
根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为本发明实施例2中判别各snp位点类型的结果判读示意图；图2为本发明实施例2中dna样本a扩增产物出峰位置及其所带的荧光标记示意图；图3为本发明实施例2中dna样本b扩增产物出峰位置及其所带的荧光标记示意图；图4为本发明实施例2中dna样本c扩增产物出峰位置及其所带的荧光标记示意图。
17.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
19.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.研究表明factor v（凝血因子v）基因、factor ii（凝血因子ii）基因以及mthfr（亚甲基四氢叶酸还原酶）基因的相关snp（single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性）位点与静脉血栓栓塞有密切关系。
21.对于factor v基因而言，与静脉血栓栓塞相关的突变包括fv leiden突变、fv hr2突变以及fv y1702c突变，fv leiden突变是factor v基因的1691位g到a的点突变，造成506位氨基酸从精氨酸到谷氨酰胺的改变（fv r506q，即rs6025）。在fv leiden纯合或杂合突变个体中，血栓形成倾向非常明显，有血栓家族史的个体携带fv leiden的频率高达40%-60%。fv hr2突变是factor v基因上b结构域13号外显子上发生的a4070g突变，这将导致his1299arg突变的发生（rs1800595）。在已经携带有leiden突变的人群中，如果同时存在hr2突变，其静脉血栓患病率将增加14倍。fv y1702c突变，在fv基因a3结构域上，若发生5279 a/g突变，将会导致在氨基酸水平上的y1702c的转变（rs118203907）。有文献报道，这一突变将导致fv的功能丧失，从而增加罹患深静脉血栓的风险。
22.factor ii基因3’端非转录区20210位鸟嘌呤突变为腺嘌呤(g-a)，此突变可增高血浆凝血酶原的水平，同时也可增高静脉血栓发生的风险。
23.mthfr基因发生纯合突变，主要是c677t及a1298c纯合突变，是导致高同型半胱氨酸血症的常见原因。高同型半胱氨酸血症造成内皮结构损伤、功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶系统的平衡，影响脂质代谢，使机体处于高凝状态，容易形成血栓。
24.鉴于此，本发明提出一种深静脉血栓snp位点的检测引物，包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组以及第六引物组，所述第一引物组包括第一
正向引物、第二正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述第二引物组包括第三正向引物、第四正向引物和第二反向引物，所述第三正向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述第四正向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如seq id no:6所示，所述第三引物组包括第五正向引物、第六正向引物和第三反向引物，所述第五正向引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第六正向引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三反向引物的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述第四引物组包括第七正向引物、第八正向引物和第四反向引物，所述第七正向引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述第八正向引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四反向引物的核苷酸序列如seq id no:12所示，所述第五引物组包括第九正向引物、第十正向引物和第五反向引物，所述第九正向引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述第十正向引物的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第五反向引物的核苷酸序列如seq id no:15所示，所述第六引物组包括第十一正向引物、第十二正向引物和第六反向引物，所述第十一正向引物的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述第十二正向引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六反向引物的核苷酸序列如seq id no:18所示；其中，所述第一正向引物、所述第二正向引物、所述第三正向引物、所述第四正向引物、所述第五正向引物、所述第六正向引物、所述第七正向引物、所述第八正向引物、所述第九正向引物、所述第十正向引物、所述第十一正向引物以及所述第十二正向引物的5’端均标记有荧光基团，所述第一正向引物、所述第二正向引物、所述第七正向引物以及所述第八正向引物的核苷酸序列中，h为碱基a、碱基t或碱基c，所述第三正向引物、所述第四正向引物、所述第五正向引物以及所述第六正向引物的核苷酸序列中，d为碱基g、碱基a或碱基t，所述第十正向引物、所述第十一正向引物以及所述第十二正向引物的核苷酸序列中，b为碱基g、碱基t或碱基c。
25.本发明提供的深静脉血栓snp位点的检测引物中，通过各引物组的核苷酸序列的设计，使得第一引物组能够对factor v基因r506q突变（rs6025）的snp位点进行特异性引物扩增，第二引物组能够对factor v基因h1299r突变（rs1800595）的snp位点进行特异性引物扩增，第三引物组能够对factor v基因y1702c突变（rs118203907）的snp位点进行特异性引物扩增，第四引物组能够对factor ii基因g20210a突变（rs1799963）的snp位点进行特异性引物扩增，第五引物组能够对mthfr基因c677t突变（rs1801133）的snp位点进行特异性引物扩增，第六引物组能够对mthfr基因a1298c突变（rs1801131）的snp位点进行特异性引物扩增，并且，各引物组进行引物扩增得到的产物长度各不相同，而通过各正向引物标记的荧光基团，引物扩增后的产物具有荧光，产物长度与荧光搭配，有助于产物在电泳仪上的基因分型，从而准确检测出与深静脉血栓发生相关的6个snp位点的基因型；尤其针对rs1800595，rs1800595的同源序列较多，对其引物扩增后的产物时有误判，通过核苷酸序列和荧光基团的设计能够有效避免误判的现象；此外，各正向引物的3’端倒数第三个碱基设计成了h、d或b等简并碱基，其能够作为错配位点，有助于增加引物扩增时的特异性。
26.需要说明的是，各引物组进行引物扩增得到的产物长度分别为：第一引物组产物长度= 102bp，第二引物组产物长度=436bp，第三引物组产物长度= 202bp，第四引物组产物长度=59bp，第五引物组产物长度=290bp，第六引物组产物长度=350bp。
reaction聚合酶链式反应）缓冲液、dna聚合酶、dntp（deoxy-ribonucleoside triphosphate脱氧核糖核苷三磷酸）以及水。利用本检测试剂盒，不仅可准确检测深静脉血栓发生相关的6个snp位点的基因型，且操作简单，性能可靠，灵敏度高，分辨率高。
45.其中，对于dna聚合酶，可选taq 酶，优选天根taq 酶；对于水，优选双蒸水。如此，使得本检测试剂盒的性能更可靠。
46.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
47.实施例1 深静脉血栓snp位点的检测试剂盒的配方深静脉血栓snp位点的检测试剂盒的配方（单人份）见表1，其中，第一正向引物（f1-c1）：fam-agcagatccctggacagacg；第二正向引物（f1-t1）：joe-agcagatccctggacagaca；第一反向引物（r1）：caggagacctaacatgttctagccag；第三正向引物（f2-t1）：tmr-cccatttctccagacctcagtca；第四正向引物（f2-c1）：rox-cccatttctccagacctcagtcg；第二反向引物（r2）：agaatatctgatcaaggtctggaggagg；第五正向引物（f3-t1）：fam-cctgtcgggcttgggctta；第六正向引物（f3-c1）：joe-cctgtcgggcttgggcttg；第三反向引物（r3）：gagtccctggttatgataaatgcagactg；第七正向引物（f4-g1）：fam-gttcccaataaaagtgactctcaacg；第八正向引物（f4-a1）：joe-gttcccaataaaagtgactctcaaca；第四反向引物（r4）：ctgcccatgaatagcactgggag；第九正向引物（f5-c1）：fam-ggagaaggtgtctgcgggggc；第十正向引物（f5-t1）：joe-ggagaaggtgtctgcgggggt；第五反向引物（r5）：gtggccaagcaacgctgtg；第十一正向引物（f6-a1）：fam-gggaggagctgaccagtgagga；第十二正向引物（f6-c1）：joe-gggaggagctgaccagtgaggc；第六反向引物（r6）：tgggagagacggtgagctgg。
48.表1 深静脉血栓snp位点的检测试剂盒的配方（单人份）实施例2 深静脉血栓snp位点的检测（1）分装：取实施例1静脉血栓snp位点的检测试剂盒（单人份）作为反应液加入到pcr管，条或板中。
49.（2）加样：向所述反应液中加入待测dna样本2ul(浓度10ng-500ng/ul)，离心后放入pcr仪。
50.（3）扩增反应：设置pcr仪程序如下：94℃，3分钟；循环开始{94℃，30秒钟；60℃，1
分钟；72℃，1分钟}循环结束，此循环进行35次；72℃，5分钟；8℃，保持。
51.（4）产物处理：向96孔板中分装已经加入有liz500分子量内标的高度去离子甲酰胺（hidi）9ul，再加入1ul的（3）扩增反应后的产物，进行热变性，然后放入4℃冰箱冷却待用。
52.（5）测序仪操作：在abi3130、3500或3700测序仪上对（4）产物处理后的产物进行片段分析，详细设置及操作过程参见对应测序仪的用户操作手册。
53.（6）结果分析：用genemarker等片段分析软件来对结果进行分析，根据产物长度（对应出峰位置）及其所带的荧光标记的不同来判别各snp位点类型，结果判读示意图见图1，结果判读方式见表2。
54.表2 结果判读方法（7）结果判读示例。
55.1）针对dna样本a，经步骤（1）-（6）得到产物出峰位置及其所带的荧光标记如图2所示，由图2判读出各snp位点的基因型见表3。
56.表3 dna样本a的各snp位点的基因型2）针对dna样本b，经步骤（1）-（6）得到产物出峰位置及其所带的荧光标记如图3所示，由图3判读出各snp位点的基因型见表4。
57.表4 dna样本b的各snp位点的基因型
3）针对dna样本c，经步骤（1）-（6）得到产物出峰位置及其所带的荧光标记如图4所示，由图4判读出各snp位点的基因型见表5。
58.表5 dna样本c的各snp位点的基因型以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。