ELABELA在改善脂肪干细胞生存和迁移中的应用

elabela在改善脂肪干细胞生存和迁移中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及elabela在改善脂肪干细胞生存和迁移中的应用。


背景技术：

2.脂肪干细胞(adipose derived stem cells，adscs)因具有自我更新、多能性、增殖能力、丰富的来源、可用性和低免疫排斥性等优点而成为有前途的再生医学和细胞治疗替代品。有研究表明，adscs可以在梗塞的心肌环境中移植和存活，并对心血管系统的结构和功能产生积极影响。因此，adscs是心肌修复、心脏组织工程和细胞再生治疗中的首要选择。然而，adscs的生存能力较差，特别是在缺氧和缺血等不利环境下容易发生凋亡，致使宿主环境对细胞移植带来了许多独特的障碍。而adscs在受影响组织中的存活、保留和定位会影响到细胞治疗的疗效，而且这些问题在心肌梗塞后的心脏组织再生领域尤为明显。因此，提高adscs的活力和迁移能力，同时减少缺氧和缺血微环境下的细胞凋亡，是亟待解决的重要问题。
3.多肽类小分子激素elabela(ela)是一种32个氨基酸组成的多肽，序列为：qrpvnltmrrklrkhnclqrrcmplhsrvpfp。ela是g蛋白偶联受体apj(即血管紧张素受体at1相关的受体蛋白)的新型内源性肽类配体，在胚胎期和成年期的多种病理生理学过程中发挥重要作用。近期大量研究表明，ela可以通过促进血管生成、调节心脏及血管功能等保护心血管系统。但是未见ela多肽在改善adscs生存方面的用途。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了ela在改善adscs生存中的应用，本发明经研究发现，ela具有改善adscs细胞生存的能力，提高干细胞在治疗缺血性心脏疾病和血管损伤等疾病中的应用效果。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明提供了ela在制备改善adscs生存的药物中的应用。
7.优选地，所述改善adscs生存是指促进adscs的增殖。说明ela可进一步制备成促进adscs增殖的药物进行应用。
8.优选地，所述改善adscs生存是指提高adscs的细胞活力。说明ela可进一步制备成提高adscs细胞活力的药物进行应用。
9.优选地，所述改善adscs生存是指抑制脂肪干细胞的凋亡。说明ela可进一步制备成抑制adscs凋亡的药物进行应用。
10.优选地，所述改善adscs迁移是指促进adscs的迁移能力。说明ela可进一步制备成促进adscs迁移的药物进行应用。
11.本发明经研究发现，ela可通过促增殖、提高活力、抗凋亡改善adscs细胞的生存能力并提高adscs的迁移能力，有望作为一种有前途的干细胞处理方法，用于延长adscs的寿
命，提高干细胞在治疗缺血性心脏疾病和血管损伤等疾病中的应用效果。
12.本发明还提供了一种用于改善adscs生存的药物，所述药物包括ela。
13.优选地，所述药物还包括能与ela起协同增效作用的其他药物成分。
14.优选地，所述药物还包括药物上可接受的载体或赋形剂。
15.进一步地，所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。稀释剂包括但不限于淀粉、糊精、薦糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、磷酸氢钙等；润湿剂包括水、乙醇、异丙醇等；粘合剂包括但不限于淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇等；崩解剂包括但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、聚乙二醇等。
16.优选地，本发明的药物可配制成若干种剂型，所述药物包括片剂、囊剂、粒剂、滴丸剂、乳剂、液剂、贴剂、膏剂和注射剂。药物制剂可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.为提高adscs的活力和迁移能力，同时减少缺氧和缺血微环境下的细胞凋亡，本发明ela在改善adscs生存中的应用，经研究发现，缺血缺氧条件下ela可以促进adscs的存活和迁移，同时抑制adscs的凋亡。这些结果表明，ela可被作为一种有前途的干细胞处理方法，用于延长adscs的寿命，提高干细胞在治疗缺血性心脏疾病和血管损伤等疾病中的应用效果。本发明不仅开发了ela的新用途，而且为adscs的再生医学和细胞治疗应用找到了新的改良策略。
附图说明
19.图1为缺血缺氧条件下ela对adscs增殖的影响(a为od450，b为细胞存活率)；
20.图2为缺血缺氧条件下ela影响adscs凋亡的流式细胞学验证结果(a为流式检测结果，b为基于流式检测的凋亡细胞数统计结果)；
21.图3为缺血缺氧条件下ela影响adscs凋亡的蛋白验证结果(a为bcl-2、bax和β-actin蛋白的印迹图；b为bcl-2/bax的统计图；c为cleaved caspase-3和gapdh的印迹图；d为cleaved caspase-3/gapdh的统计图)；
22.图4为缺血缺氧条件下ela对adscs迁移的影响(a为结晶紫染色结果，b为迁移的细胞计数)。
具体实施方式
23.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
24.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
25.实施例1elabela(ela)在改善脂肪干细胞生存方面的作用验证
26.(1)ela(qrpvnltmrrklrkhnclqrrcmplhsrvpfp)，由上海吉尔生物公司合成。ela粉末的纯度为95.31％，储存在-20℃，使用前先用pbs溶解，并用0.22μm过滤器消毒。
27.(2)adscs的分离和培养
28.从雄性sd大鼠的腹股沟脂肪垫中分离出adscs。在无菌条件下，用含有1％双抗(青霉素/链霉素)的pbs缓冲液对脂肪组织洗涤3遍，以去除粘附的血细胞。然后将脂肪组织切碎，并将组织碎片与0.1％的i型胶原酶一起孵育，在37℃恒温水浴中振荡消化1h，再加入与0.1％i型胶原酶相同体积的含10％胎牛血清的低糖dmem培养基终止消化并离心，将漂浮的成熟脂肪细胞与颗粒状基质血管部分分离。最后将组织悬液用含有1％双抗的pbs缓冲液洗涤3次，通过200目的细胞网过滤后再离心获得adscs细胞。
29.将获得的adscs在含有10％胎牛血清(fbs)和1％双抗的低糖dmem培养基中，并置于常氧条件(20％o2，5％co2)下培养。培养2天后首先更换培养基以去除非贴壁细胞，然后每2天更换一次培养基，直到细胞密度达到约80％汇合，并按照1:2的比例传代adscs，直至第3代时将它们用于后续实验。
30.(3)adscs缺氧缺血模型的建立及治疗
31.根据不同的处理方式共设7组：(1)对照组：adscs在常氧条件(20％o2，5％co2)下培养作为阴性对照；(2)h/i组：adscs在低糖dmem培养基和缺氧条件(1％o2、94％n2和5％co2)下，在缺氧培养箱中培养24h；(3)ela组：adscs在含20μm ela的低糖dmem培养基中，在缺氧培养箱中培养24h；(4)siapj ela组：用sirna-apj转染adscs，然后用20μm ela处理(即接种于含20μm ela的低糖dmem培养基中)，在缺氧培养箱中培养24h；(5)siapjnc ela组：adscs转染sirna-apjnc，然后用20μm ela处理(即接种于含20μm ela的低糖dmem培养基中)，在缺氧培养箱中培养24h。
32.其中，通过小干扰rna(sirna)进行apj沉默，sirna-apj(序列：gcctcagctttgaccgata)和sirna的阴性对照由中国广州锐博公司合成。根据说明书的操作步骤，使用lipofectamine rnaimax试剂(thermo fisher，usa)将sirna-apj或sirna-apjnc转染adscs。在此期间，adscs在不含双抗的培养基中孵育6-8h。
33.(4)细胞活力测定：
34.使用细胞计数试剂盒8(cck-8)来确定细胞活力。各组经过规定处理后，将100μl细胞悬液(每孔4
×
103个细胞密度)接种于96孔板中培养24h，然后加入10μl cck-8试剂，37℃培养2小时。接下来，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。随后，通过每组中的平均光密度(od)计算细胞活力的百分比。细胞存活率＝(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)
×
100％。
35.(5)细胞迁移测定
36.使用孔径为8μm的transwell小室检测细胞的迁移，并将transwell小室置于24孔板中。将具有200μl低糖dmem的指定处理(步骤(2)的7个处理)的adscs(每孔1
×
105个细胞的密度)接种在上室中，并将含有10％fbs的600μl低糖dmem加入下室中。将24孔板置于37℃培养箱中培养12小时。将上室下表面的细胞用pbs轻轻冲洗3次，然后用4％多聚甲醛室温固定30min。最后，将上室放入0.1％结晶紫染料中对细胞进行染色，然后用棉签去除没有迁移到底层的细胞。每组随机拍摄五张照片，并计算细胞数。
37.(6)细胞凋亡测定
38.参照说明书，应用annexin v-fitc/pi凋亡检测试剂盒评估adscs的凋亡。首先，用
0.25％胰蛋白酶(不含edta)获取已处理(步骤(2)的7个处理)的adscs，并在1000rpm下离心5分钟。随后，将adscs用冷pbs洗涤3次，并重悬于100μl 1
×
bindingbuffer中。加入5μlannexinv-fitc轻轻混匀，4℃避光孵育15min，再加入5μlpi轻轻混匀，4℃避光孵育5min。之后再补足400μl 1
×
bindingbuffer混合到每组中。最后，在一小时内通过流式细胞仪检测细胞样品。
39.(7)蛋白质印迹
40.对上述7个处理组中已处理的adscs用pbs洗涤1遍，并用含有10ul/ml蛋白酶和10ul/ml磷酸酶抑制剂的ripa裂解液在冰上裂解30分钟。然后将各组混合液回收，12,000
×
g离心20min，收集各组上清液，并通过bca测定试剂盒检测蛋白质浓度。与sds上样缓冲液混合后，将收集的蛋白在100℃下加热10min，随后取相同质量的蛋白质样品通过12％sds-page分离，再转移到0.2μm pvdf膜中，将膜用封闭溶液(含5％脱脂牛奶的1
×
tbst)室温封闭1h，并与一抗在4℃下孵育过夜，所用的一抗包括apj、bcl-2、cleaved caspase-3,phospho-p44/42mapk(p-erk1/2),p44/42mapk(erk1/2),phospho-p38 mapk,p38mapk,phospho-sapk/jnk，sapk/jnk,phospho-p53,p53,β-actin和gapdh。次日再用1
×
tbst洗膜3次，每次10min，接着将膜与抗兔二抗或抗小鼠二抗一起室温孵育1h。最后用1
×
tbst洗涤膜3次，每次10min，并用曝光仪器检测化学发光试剂处理过的条带。
41.(8)实验结果
42.图1中，adscs细胞在缺氧条件以及sirna沉默apj后，其od450和细胞存活率显著下降，但在缺氧条件下往培养基中加入ela后，adscs细胞的od450和细胞存活率与正常培养相当，说明缺血缺氧条件下ela能促进adscs的增殖并提高细胞的活力。
43.图2中，adscs细胞在缺氧条件以及sirna沉默apj后，发生了大幅度的凋亡现象，但在缺氧条件下往培养基中加入ela后，细胞凋亡数明显减少，说明缺血缺氧条件下ela能减少adscs的凋亡。
44.图3中，bcl-2，bax，cleaved caspase-3(切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3)和gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)是重要的细胞凋亡相关蛋白，其中bcl-2和bax是凋亡调节基因bcl-2家族的两个重要成员,二者可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。adscs细胞在缺氧条件以及sirna沉默apj后，bcl-2/bax及cleaved caspase-3/gapdh的表达量显示升高，但在缺氧条件下往培养基中加入ela后，相应的表达量显著降低，进一步说明缺血缺氧条件下ela能减少adscs的凋亡。
45.图4中，adscs细胞在缺氧条件以及sirna沉默apj后，细胞迁移数显著降低，但在缺氧条件下往培养基中加入ela后，迁移数得到了显著的上升，说明缺血缺氧条件下ela能促进adscs的迁移
46.上述分析说明，ela可通过促增殖、提高活力、抗凋亡改善adscs细胞的生存能力并提高adscs的迁移能力，用于延长adscs的寿命，提高干细胞在治疗缺血性心脏疾病和血管损伤等疾病中的应用效果。
47.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。