dna marker图3为谷氨酰胺转氨酶的电泳分析：m：蛋白质marker；1：发酵上清液；2-6：纯化的目的tgase图4为ph对谷氨酰胺转氨酶酶活(a)和稳定性(b)的影响。
9.图5为温度对谷氨酰胺转氨酶酶活(a)和稳定性(b)的影响。
10.图6为凝胶的红外光谱（fi-ir）分析
具体实施方式
11.实施例一：tgase基因的获得提取streptomyces sp. tyq1024的基因组dna，进行全基因组序列测序。对得到基因组数据进行分析，获取谷氨酰胺转氨酶基因tgase。
12.实施例二：tgase基因的异源表达设计特异性引物扩增tgase基因，上游引物(5'-cgcggatcctcgccaccggcagtggcagtggca-3')，下游引物(5'
-ꢀ
ctagctagctcacggccagccctgtgtca-3')，通过pcr法获得tgase基因。对tgase基因和质粒pma lipa进行bamh和nhe酶切，并进行连接。然后，将连接产物转化至e. coli dh5α，提取重组质粒pma lipa-tg，转化至b. subtilis sck6。
13.实施例三：重组枯草芽孢杆菌工程菌培养条件将重组菌b. subtilis sck6/pma lipa-tg接种至含50
µ
g/ml卡那霉素的100 ml tb基础培养基中，37
°
c摇床振荡培养16h，以3%的接种量接种于含50
µ
g/ml kan的发酵培养基中（培养基成分：葡萄糖15 g/l，大豆蛋白胨20 g/l，尿素20 g/l，磷酸二氢钾2.31 g/l，磷酸氢二钾0.54 g/l，ph 6.5），37
°
c，220rpm摇床培养64h；离心，收集发酵上清液，并测定上清液中tgase活性。
14.实施例四：谷氨酰胺转氨酶活性测试取100 μl菌体培养上清液和1 ml底物溶液（37 o
c水浴恒温）混合，在37
ꢀ±ꢀ
1 o
c恒温水浴中精确反应10 min。反应结束后立即加入1 ml显色溶液终止反应，4000 r/min离心5 min去除沉淀。以水为对照于525 nm处测定od值，即为待测酶液吸收值。通过标准曲线计算得到具体酶活力单位。
15.实施例五：重组谷氨酰胺转氨酶的纯化添加50%饱和度的硫酸铵至发酵上清液，4oc 静置过夜，离心收集上清，弃沉淀去除部分杂蛋白。缓慢加入硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度达到80%，4oc静置过夜，离心收集沉淀，弃上清，进一步去除杂蛋白。然后，用适量的缓冲液(20 mm pb；ph 5.8)对沉淀进行充分溶解，离心收集上清，用sp阳离子交换柱对tgase进一步纯化，(20 mm pb；ph 5.8)平衡柱子后，用含1m nacl线性梯度洗脱目的蛋白，进行sds-page鉴定。
16.实施例六：谷氨酰胺转氨酶的酶学性质研究在ph 3~10的ph值范围内检测谷氨酰胺转氨酶酶活；将谷氨酰胺转氨酶置于不同ph缓冲液中，室温下保温30min，测定其ph稳定性；在10~70oc的不同温度下测定谷氨酰胺转氨酶酶活；将重组酶置于4~60oc 条件下，保温30min，测定其热稳定性。
17.实施例七：tgase交联明胶性能研究分别将tgase改性前后的明胶凝胶冷冻干燥，获得干燥的海绵。称取5-10 mg干凝胶，用
溴化钾研磨压片方法制成圆形片，固定在红外光谱仪的样品架上。在4000
〜
500 cm-1的光谱范围内进行红外扫描，获得改性前后凝胶的红外光谱图。
技术特征：
1.一种微生物谷氨酰胺转氨酶tgase的基因序列，其特征是由1233 个核苷酸组成，编码410个氨基酸，其中1-28位氨基酸为信号肽。2.将tgase基因连接入pma lipa载体，构建重组质粒pma lipa-tg并在bacillus subtilis sck6中实现高效表达，其特征是在明胶交联实验中展现出优异的蛋白交联特性。3.tgase的特征在于最适温度50
o
c，最适ph 8，在明胶等蛋白交联中具有很好的应用前景。
技术总结
本发明公开了一种链霉菌谷氨酰胺转氨酶基因的异源表达与表征及其在明胶交联中的应用，属于生物技术领域。本发明所述的谷氨酰胺转氨酶基因全长是通过挖掘Streptomyces sp.TYQ1024全基因数据而获得，其基因全长1233bp，编码410个氨基酸，并通过PCR体外扩增了该基因。本发明为首次实现链霉菌谷氨酰胺转氨酶基因在枯草芽孢杆菌SCK6中的异源表达、纯化和表征，并将重组谷氨酰胺转氨酶应用于明胶交联。该酶具有良好的酶学特性，且交联特性优异，在蛋白及明胶交联中拥有广阔的应用前景。在蛋白及明胶交联中拥有广阔的应用前景。在蛋白及明胶交联中拥有广阔的应用前景。
技术研发人员：田永强 王诗婷 李晓广
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2020.07.28
技术公布日：2022/2/6
再多了解一些
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