柳叶水甘草碱在制备延长寿命的产品中的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及柳叶水甘草碱在制备延长寿命的产品中的应用。


背景技术：

2.衰老是发生在分子、细胞和整个机体的一个复杂进行性不可逆的过程，是遗传因子和环境因素间不断相互作用、相互影响的综合性结果，最终导致个体生理功能相应减弱、适应能力和抵抗力下降。我国65岁以上老年人口约2.8亿，是心血管疾病、肿瘤、老年痴呆、白内障、黄斑变性等高发人群。因此研发新的延缓衰老的药物并阐明其作用机制为延缓衰老和治疗衰老相关疾病提供新的依据和方向。
3.在过去的近40年的时间里，衰老机理的研究得到了极大的发展进步。特别是在模式生物中的研究成果，极大的拓宽了人类对调控生物体衰老和长寿的分子机制的认识。经过多年的细致研究，现代科学认为衰老过程和其他生物学过程一样，是受经典信号通路和转录因子调控的，这些信号通路通过环境或者生理学信号来调控衰老过程，比如胰岛素-胰岛素样生长因子1信号通路(insulin/igf-1signalling)、饮食限制信号通路、活性氧簇(ros)信号、生殖系统信号通路、表观遗传相关通路和环境因素相关信号通路等。
4.热休克转录因子1(heatshockfactor1,hsf1)和下游热休克蛋白家族通过调控蛋白质的有序折叠、运输和降解，从而保护细胞免受应激刺激导致的细胞凋亡和衰老，这个保护性应激反应称为热休克反应。在老年组织和衰老细胞中，热休克反应能力降低。hsf1和下游热休克蛋白已作为抗衰老靶点用于老年痴呆和心血管疾病防治研究。这些热休克蛋白可通过重塑衰老过程中积累的受损蛋白质来维持蛋白质内稳态，延缓动物衰老。在线虫中过表达热休克反应的中枢调控蛋白hsf-1可以有效地增强线虫对热压力环境的抵抗，减缓线虫衰老并延长线虫的寿命；在果蝇中过表达线粒体hsp22可以促进长寿；一种共伴侣(chip)的突变体小鼠表现出更快的老化过程，而在长寿的突变体小鼠中，某些hsp基因被上调。
5.综上所述，hsf1可以作为抗衰老药物的作用靶点。目前虽然已经有报道靶向hsf1信号通路的药物，但还处在临床前研究阶段。因此，研发合适的调控hsf1介导的热休克反应通路的药物并阐明其作用机制是防治老年疾病的当务之急。
6.秀丽隐杆线虫(caenorhabditis.elegans)是一种经典的研究寿命与衰老的模式生物，具有以下优点：1)成虫约1mm长并喂食大肠杆菌，易于在实验室培养；2)生活周期短，大概3天一个生殖周期，整个生命只有几周，大大缩短了研究时间；3)线虫通体是透明的，能够准确的成像，便于观察检测；4)遗传背景清楚，并且是第一个获得全基因组序列的生物，与哺乳动物有40％的同源性，利于反向遗传学研究；5)具有很少的细胞数，有明显的细胞分化及功能特异的组织分类，能完成多种生物行为；6)世系之间具有稳定性，对线虫做同步化处理，能严格控制实验条件，提高可比性。除此之外，线虫在少于1年的条件下，可以饥饿后恢复；可以永久在-80度和液氮液中保存；大概一周的时间就可以通过基因改造得到新的株系；大概2个月的时间就可以敲除任何基因得到需要的新的基因；线虫还可以通过诱变得到
大量的非致死突变体。基于以上的优点，本发明选择秀丽隐杆线虫为模型研究能对动物寿命有影响的药物。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种可延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的产品。
8.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
9.本发明一方面提供了一种用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的组合物，所述的组合物包含柳叶水甘草碱。
10.在本发明的说明书和权利要求书中，词语"包括"、"包含"和"含有"意指"包括但不限于"，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
11.如本文所述，本文提供的组合物可用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病，是指任何抗衰老治疗。抗衰老治疗包括(但不限于)导致预防、改善或减轻衰老影响，减少或延缓生物学年龄增加、延缓衰老的治疗；治疗、预防、改善或减轻虚弱或与衰老相关的疾病和病症或衰退的影响、减缓这种衰退、病症或疾病的进展、健康期或寿命的延长、恢复活力、增加压力或恢复力、提高手术、放射疗法、疾病和/或任何其他压力后恢复率或其他增强、更年期综合症的预防和/或治疗、恢复生殖功能、消除或减少衰老细胞的扩散、降低与至少一种或至少两种年龄相关疾病或病症有关的所有或多种死亡风险或死亡风险的全因或多种原因或延迟此类风险增加、降低发病风险。将至少一种衰老的生物标记物调节为更年轻状态或减慢其转变为“老年”状态的治疗也被视为抗衰老治疗，包括但不限于可见衰老的迹象，如皱纹、灰色头发等的衰老的生物标记物。在一些实施方案中，年龄相关疾病或紊乱选自：动脉粥样硬化、心血管疾病、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、神经退行性变(包括但不限于阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和其他随年龄进行性痴呆；帕金森氏病；以及肌萎缩性侧索硬化症[als])、中风、萎缩性胃炎、骨关节炎、nash、躯干前驱症、慢性阻塞性肺疾病、冠状动脉疾病、多巴胺失调综合征、代谢综合征、劳累性尿失禁、桥本甲状腺炎、心力衰竭、老年抑郁、免疫衰老(包括但不限于与年龄相关的对疫苗的免疫反应下降、与年龄相关的免疫疗法反应下降)、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肌肉减少症、肌肉减少性肥胖、老年骨质疏松症、尿失禁等。癌症幸存者、接受化学疗法和放射疗法的患者以及其他可比的压力以及艾滋病毒患者可能会加速衰老，针对这种加速衰老或其后果的治疗也被视为抗衰老治疗以及对其的预防措施。
[0012]
在一些实施方案中，所述的组合物还可包括药学上可接受的缓冲液、赋形剂或载体。
[0013]
术语“药学上可接受的”在本文中被限定为指在合理医学判断的范围内适合用于与受试者的组织相接触而无过度毒性、刺激过敏反应和其他问题并发症，并且与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0014]
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。进一步，受试者是人类受试者。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用。因此，术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖患有衰老相关疾病的个体。“受试者”还包括寿命与衰老的模式生物
‑‑
秀丽隐杆线虫。
[0015]
在某些实施方案中，所述的缓冲液包括trizma、bicine、tricine、mops、mopso、
mobs、tris、hepes、hepbs、mes、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、aces、ada、酒石酸盐、amp、ampd、ampso、bes、cabs、卡可酸盐(cacodylate)、ches、dipso、epps、乙醇胺、甘氨酸、heppso、咪唑、咪唑乳酸、pipes、ssc、sspe、popso、taps、tabs、tapso和tes。
[0016]
在某些实施方案中，所述的载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，药物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
[0017]
在某些实施方案中，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。
[0018]
在一些实施方案中，所述的衰老相关疾病包括脉粥样硬化、心血管疾病、恶病质、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、神经退行性变、中风、萎缩性胃炎、骨关节炎、nash、躯干前驱症、慢性阻塞性肺疾病、冠状动脉疾病、多巴胺失调综合征、代谢综合征、劳累性尿失禁、桥本甲状腺炎、心力衰竭、老年抑郁症、免疫衰老、心肌梗死、急性冠脉综合征、肌肉减少症、肌肉减少性肥胖、老年骨质疏松症、尿失禁。
[0019]
本发明另一方面提供了如下任一项所述的应用：
[0020]
(1)前面所述的组合物在制备用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的产品中的应用；
[0021]
(2)前面所述的组合物在制备hsf1磷酸化试剂中的应用；
[0022]
(3)前面所述的组合物在制备提高hsp70和hsp27的表达水平的试剂中的应用；
[0023]
(4)前面所述的组合物在制备提高氧化应激相关基因的表达水平的试剂中的应用。
[0024]
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mrna或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mrna)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成rna但不翻译成蛋白质的基因(例如mirna)。
[0025]
在一些实施方案中，所述的hsf1磷酸化为hsf1的s326位点磷酸化；
[0026]
在一些实施方案中，所述的氧化应激相关基因为线虫的氧化应激相关基因，优选的，所述的氧化应激相关基因包括hsp12.6、hsp16.2、hsp17、hsp25、hsp70。
[0027]
在一些实施方案中，所述的产品包括药物、固体饮料、液体饮料、乳制品、调味粉
料、营养品。
[0028]
在某些实施方案中，所述的药物的剂型包括溶液、混悬液、乳剂、浸膏、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊。
[0029]
本发明所述的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括(但不限于)：静脉内、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、小泡内、肌肉内、气管内、皮下的、通过皮肤、通过胸膜、局部的、吸入、通过粘膜、皮肤、肠胃、关节内、心室内、直肠、阴道、颅骨内、尿道内、肝内、瘤内，在某些情况下，可以系统地给药，在某些情况下可以局部地给药。
[0030]
进一步，本发明所述的药物的剂量不受限制，只要获得期望的延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定，本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0031]
在一些实施方案中，所述的衰老相关疾病包括脉粥样硬化、心血管疾病、恶病质、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、神经退行性变、中风、萎缩性胃炎、骨关节炎、nash、躯干前驱症、慢性阻塞性肺疾病、冠状动脉疾病、多巴胺失调综合征、代谢综合征、劳累性尿失禁、桥本甲状腺炎、心力衰竭、老年抑郁症、免疫衰老、心肌梗死、急性冠脉综合征、肌肉减少症、肌肉减少性肥胖、老年骨质疏松症、尿失禁。
[0032]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0033]
本发明首次发现柳叶水甘草碱对寿命的影响，可用于制备延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的产品，具有良好的实际应用价值。
附图说明
[0034]
图1是筛选hsf1激活剂的实验结果，其中，图a是hela/hspa1a-/-/gfp单克隆细胞株的质粒构建示意图，图b是流式细胞分选hela/hspa1a-/-/gfp单克隆细胞株结果图，图c是western blot检测热休克、17aag或mg132处理后单克隆细胞株的gfp蛋白水平结果图，图d是qrt-pcr检测热休克、17aag或mg132处理后单克隆细胞株的gfp mrna水平结果图，图e是流式细胞仪检测gfp荧光强度结果图，图f是流式细胞仪检测gfp荧光强度统计图，图g是western blot检测经柳叶水甘草碱处理后hela细胞的hsp70表达水平结果图；
[0035]
图2是证明柳叶水甘草碱激活hsf1进而上调hsp27和hsp70的表达的实验结果图，其中，图a是通过核质分离实验证明柳叶水甘草碱可以促进hsf1进核的实验结果图，图b是western blot检测经柳叶水甘草碱处理后细胞的hsf1 s326位点磷酸化水平、hsp7和hsp27蛋白表达水平结果图。
[0036]
图3是柳叶水甘草碱的结构式；
[0037]
图4是检测低浓度的柳叶水甘草碱对线虫寿命的影响的实验结果图，其中，图a是0.1μm/l柳叶水甘草碱从线虫l4时期开始持续刺激线虫的结果图，图b是1μm/l柳叶水甘草碱从线虫l4时期开始持续刺激线虫的结果图，图c是0.1μm/l柳叶水甘草碱从线虫day1时期开始持续刺激线虫的结果图，图d是1μm/l柳叶水甘草碱从线虫day1时期开始持续刺激线虫的结果图，图e是0.1μm/l柳叶水甘草碱从线虫day7时期开始持续刺激线虫的结果图，图f是1μm/l柳叶水甘草碱从线虫day7时期开始持续刺激线虫的结果图；
[0038]
图5是以hsf-1突变体线虫hsf-1(sy441)为模型检测柳叶水甘草碱对线虫寿命的
影响的实验结果图，其中，图a是0.1μm/l柳叶水甘草碱处理hsf-1突变体线虫的结果图，图b是1μm/l柳叶水甘草碱处理hsf-1突变体线虫的结果图；
[0039]
图6是实时定量pcr检测经柳叶水甘草碱处理后野生型线虫的氧化应激相关基因表达水平结果图；
[0040]
图7是柳叶水甘草碱延长寿命的机制示意图。
具体实施方式
[0041]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0042]
实验材料
[0043]
试剂和材料：氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钙、胆固醇、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、羧苄青霉素、5-氟脱氧尿苷(floxuridine,fudr)(sigma)、柳叶水甘草碱(mce)；cdna反转录试剂盒(thermo scientific)、qrt-pcr试剂盒(vazyme)、6cm培养皿；叔丁基过氧化氢(t-bhp，sigma)；dmem-f12培养基、过氧化氢、β-半乳糖苷酶染色试剂盒、β-action、hsf1、p-hsf1(s326)、hsp70、hsp27抗体(cst)；
[0044]
实验菌株和虫株：尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(e.coli)op50；野生型n2虫株；hsf-1突变体虫株hsf-1(sy441)；
[0045]
哺乳动物细胞系：hela细胞、视网膜色素上皮细胞arpe-19；
[0046]
实验仪器：解剖显微镜(江南nsz608t)、生化培养箱(武汉瑞华)、ti-sβ倒置荧光显微镜(日本尼康)、q3定量pcr仪(abi)、流式细胞仪、摇床、超净台、sds－page电泳所需玻璃板和电泳槽等。
[0047]
实施例1柳叶水甘草碱是新的hsf1激活剂
[0048]
1)hela/hspa1a-/-/gfp重组单克隆细胞系的构建：
[0049]
本发明首先利用crispr/cas9基因编辑技术构建了px333-hspa1a-grna表达质粒及hspa1a-/-/gfp重组片段质粒；然后通过转染、加压、富集阳性细胞；最后通过高速流式细胞分选系统分选出gfp荧光表达阳性的单细胞；并且通过基因组测序和qrt-pcr验证得到两株在基因组hspa1a的启动子前成功插入gfp基因的阳性细胞克隆，分别命名为3#和4#细胞(图1a、b)。
[0050]
并运用western blot和qrt-pcr技术证明该细胞系在热休克(43℃，1h)处理、hsp90的特异抑制剂17aag(0.2μm/l)或蛋白酶体抑制剂mg132(5μm/l)处理后，gfp蛋白表达量和mrna水平较对照组显著增加(图1c、d)。这些结果表明，本发明成功获得单克隆细胞株hela/hspa1a-/-/gfp，并且该细胞株gfp的荧光强度可以表征hsf1的活性和hsp70的表达水平。
[0051]
2)筛选出新的hsf1激活剂柳叶水甘草碱：
[0052]
以hela/hspa1a-/-/gfp细胞系为筛选模型，用实验室现有的约400个中药单体刺激细胞，通过流式细胞仪检测gfp荧光强度，发现了柳叶水甘草碱可以明显增强gfp的荧光强度(图1e、f，图中tab表示柳叶水甘草碱)，并且western blot实验证明了柳叶水甘草碱确实能够上调hela细胞hsp70的表达(图1g)。
[0053]
实施例2柳叶水甘草碱激活hsf1进而上调hsp27和hsp70的表达
[0054]
1)核质分离实验：以hela和hela hsf-1_
/
_细胞为模型，15μm的柳叶水甘草碱处理细胞6h，然后通过核质分离实验证明柳叶水甘草碱可以促进hsf1进核(图2a)。
[0055]
2)以hela细胞为模型，用dmso、10μm的柳叶水甘草碱处理细胞24h，结果表明，柳叶水甘草碱通过磷酸化hsf1 s326位点，激活hsf1，进而上调hsp70和hsp27的表达来延缓衰老(图2b)。
[0056]
实施例3低浓度的柳叶水甘草碱对线虫寿命的影响
[0057]
1)ngm(nematode growth media,ngm)培养基配制：
[0058]
在实验室，线虫培养在加有细菌的培养基(ngm)琼脂上，这种琼脂被无菌地倒进培养皿中。其准备方法为：1)将3g nacl、17g琼脂、2.5g蛋白胨，加入到2l的锥形瓶中，然后加入975ml的水，用锡箔纸封口，高压灭菌30分钟；
[0059]
2)待灭菌锅压力表降到零后拿出，在55度水浴冷却15分钟，使其温度降低到55度左右；3)加入lml l m mgso4、lml l m cacl2、1ml 5mg/ml胆固醇溶液和25ml l m k2po4缓冲液，用振荡器震荡均匀；4)使用无菌程序，将ngm培养液用蠕动泵分发到培养皿中，填满培养皿的2/3；5)在使用前将板子在室温下放置2-3天，以便检测污染物，并使多余的水分蒸发。在室温下储存在密闭容器中的板子可以使用几个星期。多余的板子可以放到4度储存。
[0060]
2)线虫食物的准备：
[0061]
在实验室条件下，线虫以大肠杆菌op50为食物。利用发酵剂培养，将单个菌落分离在较丰富的培养基(如lb琼脂)的条纹板上(lb琼脂：10克细菌用胰蛋白胨、5克细菌用酵母、5克nacl、15克琼脂，加水至1升，ph值7.5)。然后挑取单菌落，无菌环境下接种到lb液体培养基中(lb液体培养基：10克细菌用胰蛋白胨、5克细菌用酵母、5克nacl，加水至1升，用1m naoh调ph值至7.0)。37度恒温摇床中过夜。新鲜的op50浓缩3倍，加入羧苄青霉素使op50失活，4℃放置一天后备用。
[0062]
3)线虫的同步化：
[0063]
线虫同步化是实验精确性的必要因素。少量线虫的同步化有一个简便的方法：挑选20-25只day1的线虫放到加有菌的ngm板子上，使其产卵2个小时左右，然后挑出成虫杀死，就可以获得大约200只卵，待其发育后就可得到同步化的线虫。
[0064]
4)加有柳叶水甘草碱药物的平板准备：
[0065]
把250μl的柳叶水甘草碱(终浓度分别为0.1μm、1μm)平铺在加有op50的平板中央，缓慢晃动，使其均匀平铺，放置一夜，第二天备用。
[0066]
5)寿命检测实验：
[0067]
待线虫发育到l4晚期和day1时期，将线虫分到7个准备好的加有dmso(对照)和柳叶水甘草碱的平板中，每板16只线虫。前7天每天将线虫转入新的带有新鲜食物和药物的平板中，然后在第10天、第13天、第15天将线虫转入新的带有新鲜食物和药物的平板中。同时，检测线虫的生存情况并且记录下实验数据。用铂丝轻轻碰触线虫的头部或尾部，完全不会运动或收缩的线虫视为死亡。所以在实验中，将l4晚期的线虫定位成虫期的开始，记录为第0天，成年线虫的第一天作为实验记录的第一天。爬出培养皿、爆裂或有幼虫在体内孵化的线虫都计算为非正常死亡。寿命检测实验数据收集完成后，本发明使用graphpad prism7(graphpad software,inc)和ibm spss statistics 22(ibm,inc)对得到的寿命观测数据
进行统计学分析。通过log-rank(kaplan-meier)来计算p值。
[0068]
结果表明，低浓度的柳叶水甘草碱从线虫不同时期开始持续刺激均可以延长线虫寿命。如图4。a-b：柳叶水甘草碱从线虫l4时期开始持续刺激线虫，0.1μm/l(a)、1μm/l(b)的柳叶水甘草碱分别可以延长线虫寿命10.1％和10.3％；c-d：柳叶水甘草碱从线虫day1时期开始持续刺激线虫，0.1μm/l(c)、1μm/l(d)的柳叶水甘草碱分别可以延长线虫寿命16.4％和16.3％；e-f：柳叶水甘草碱从线虫day7时期开始持续刺激线虫，0.1μm/l(e)、1μm/l(f)的柳叶水甘草碱分别可以延长线虫寿命12.5％和7.9％。其中，(a)和(b)、(c)和(d)、(e)和(f)分别共享同一条wt；dmso，在同一时期完成，每组实验有两次重复。
[0069]
实施例4 hsf1因子在柳叶水甘草碱延长寿命中的作用
[0070]
当生物体暴露于热等蛋白质抑制应激源时，热休克反应(hsr)参与管理蛋白质损伤和恢复蛋白质平衡。hsr由一系列热休克因子(hsfs)控制，其中hsf1对蛋白质毒性应激和热休克蛋白(hsp)的调控至关重要。热休克蛋白(hsp)家族主要起分子伴侣的作用，与许多物种的寿命和衰老有关。这些热休克蛋白可通过重塑衰老过程中积累的受损蛋白质来维持蛋白质内稳态，延缓动物衰老。在线虫中过表达热休克反应的中枢调控蛋白hsf-1可以有效地增强线虫对热压力环境的抵抗，减缓线虫衰老并延长线虫的寿命；在果蝇中过表达线粒体hsp22可以促进长寿；一种共伴侣(chip)的突变体小鼠表现出更快的老化过程，而在长寿的突变体小鼠中，某些hsp基因被上调。
[0071]
本发明以hsf-1突变体线虫hsf-1(sy441)为模型，以实施例2的方法进行实验，结果表明，与对照组(dmso)相比，柳叶水甘草碱处理组并不能延长hsf-1(sy441)线虫寿命(图5a-b)。
[0072]
实施例5柳叶水甘草碱对热休克蛋白基因表达的影响
[0073]
在线虫中，和氧化应激相关的基因主要包括hsp12.6、hsp16.2、hsp17、hsp25、hsp70等。所需要的引物如表1所示。
[0074]
表1氧化应激相关的基因的引物
[0075]
[0076][0077]
实验步骤如下：
[0078]
1)首先把20-25条day1的成虫挑到一块有菌的平板上，产卵2个小时，挑出成虫杀死，得到同步化的线虫。挑200只day1时期的线虫放到加有1μm柳叶水甘草碱(dmso为对照)浓度的涂有灭活的e.coli op50的ngm培养基中，20℃培养12h；
[0079]
2)将培养好的线虫转移到1.5ml ep管中，用m9缓冲液冲洗三到五遍；
[0080]
3)使用tri试剂(life technologies)从200只成虫中提取全基因组rna；
[0081]
4)使用高容量cdna反转录试剂盒(thermo scientific)，以提取的全基因组rna为模板，进行反转录pcr；
[0082]
5)以反转录pcr得到的cdna为模板，使用cybr green试剂(vazyme)在实时定量pcr检测系统(abi)上进行实时定量pcr分析；
[0083]
6)实验数据处理中，本发明选用act-1(actin)作为内参照，使用δδct分析方法对实时定量pcr的结果进行处理分析。所有的实时定量pcr检测实验均重复了三次。使用anova检测方法对试验结果进行统计学检验。
[0084]
结果表明，柳叶水甘草碱能使野生型线虫n2的hsp12.6、hsp16.2、hsp17、hsp25、hsp70等氧化应激相关基因表达水平明显上调，分别是对照组的1.4倍、3倍、2倍、1.2倍和2.5倍，具有统计学意义，见图6。
[0085]
以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。
[0086]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0087]
此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。