一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用与流程

一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体pc-liy1、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种弧菌噬菌体pc-liy1、弧菌噬菌体 pc-liy1所制备的生物抗菌剂及其应用。


背景技术：

2.弧菌是一种需氧兼性厌氧的革兰氏阴性菌，在海洋环境中最常见的细菌类群 之一，广泛存在于近岸海域的海水和海洋生物体中。近年来，随着人类对海产品 需求量和消费量的不断增加，我国水产养殖业蓬勃发展，集约化水产养殖程度越 来越高，养殖密度的扩大使养殖动物的发病率不断升高。海水养殖动物常见的且 危害性最大的细菌性疾病主要是因弧菌引起的弧菌病。弧菌病可导致虾、鱼类、 贝类及甲壳类的大量死亡。霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌和哈维氏弧菌等 都是常见的条件致病菌。霍乱弧菌所引起的霍乱烈性肠道传染病具有发病急、传 播速度快、传染范围广等特点，一旦感染，给水产养殖业带来巨大经济损失。霍 乱弧菌也是人类食用海鲜产品而食物中毒的主要元凶，严重影响许多国家的健康 和安全。溶藻弧菌是一种食源性致病菌，可危害鱼类、虾类等多种水生动物，对 人也有致病性。副溶血性弧菌是一种嗜盐菌，通常存在于水产品中，进食含有该 菌的食物可致食物中毒。
3.当前对于海水养殖环境中弧菌的控制，及由弧菌引起的水产养殖动物疾病的 防治主要以抗生素和消毒剂为主，抗生素的不合理使用导致细菌出现耐药性，这 些耐药菌株的产生对人类健康形成潜在危险，此外，抗生素在环境中残留也会破 坏生态环境。抗生素和消毒剂能够抑制或杀死有益微生物，破坏水生动物体内外 微生态平衡，降低自身免疫力。因此，寻求一套有效的抑制致病性弧菌的方法迫 在眉睫。
4.弧菌噬菌体广泛存在于海水中，是天然的生物抑菌剂，具有研发周期短、研 发成本低、增殖能力强等优势。近年来，噬菌体疗法已在医学、制药、水产养殖、 食品加工等领域被广泛关注。在水产养殖上，弧菌噬菌体对控制弧菌的研究取得 一定进展。因为噬菌体的高度专一性，大多数只能感染一种宿主菌，而实际养殖 环境中弧菌种类多种多样，目前高专一性的噬菌体无法养殖环境多样性和复杂性 的需求，文献中也未见有高效裂解多种致病弧菌噬菌体的报道。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种可以高效裂解多种弧菌的噬菌体pc-liy1，及其在水产养 殖环境中抑制弧菌的应用。
6.本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种具有高效跨种裂解能力的弧 菌噬菌体pc-liy1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为cgmcc no.23369，保藏时间为2021年12月13日。
7.进一步的，所述弧菌噬菌体pc-liy1在2216e平板上形态为圆形透亮直径约 1～
2mm的噬菌斑。透射电镜显示弧菌噬菌体pc-liy1头部呈长二十面体，头部 长度为100～110nm，宽度为75～85nm，尾部长度为95～100nm，在2216e平板上 形态为圆形透亮直径为1～2mm的噬菌斑，可观察到收缩性尾鞘，尾部末端可见 尾丝，属于肌尾噬菌体科(myoviridae)。
8.所述弧菌噬菌体pc-liy1的潜伏期约为30min，裂解期在30～100min，裂解 量为70pfu/cfu。
9.进一步的，所述弧菌噬菌体耐受45～70℃温度。
10.进一步的，所述弧菌噬菌体适宜生存的ph值为4～10。
11.进一步的，所述弧菌噬菌体对氯仿不敏感。
12.进一步的，所述弧菌噬菌体能够裂解多种致病性弧菌。
13.进一步的，所述弧菌噬菌体pc1-liy1为线性双链dna，基因组大小为 246,348bp，gc％含量为42.6％。
14.本发明提供了一种弧菌噬菌体pc-liy1在制备抑制生物抗菌剂中的用途。
15.进一步的，所述的生物抗菌剂可以同时抑制多种致病性弧菌。
16.进一步的，所述的致病性弧菌为霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、拟态 弧菌、新喀里多尼亚弧菌、希瓦氏弧菌。
17.进一步的，所述的弧菌噬菌体对酵母菌、芽孢菌、乳杆菌及肠杆菌都不敏感。
18.本发明提供了一种生物抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述的弧菌噬菌体 pc-liy1生产生物抗菌剂的步骤如下：
19.1)将宿主菌溶藻弧菌va5接种到种子培养基中，然后将溶藻弧菌va5与 所述弧菌噬菌体pc-liy1混合接种到种子培养基中，37℃摇床振荡培养，制备宿 主菌溶藻弧菌va5和所述弧菌噬菌体pc-liy1的种子液；
20.2)在发酵罐中加入所述弧菌噬菌体pc-liy1的发酵培养基并灭菌，将接种 宿主菌接种弧菌噬菌体pc-liy1，进行发酵得到发酵混合液；
21.3)将所述的发酵混合液经离心膜过滤去除宿主菌va5，得到弧菌噬菌体 pc-liy1液体制剂。
22.进一步的，所述步骤(2)中温度设定为35～40℃，通气条件下发酵时间为 10～12h。
23.进一步的，所述制备方法步骤(2)中噬菌体的感染复数为0.1，搅拌桨转速 为40～80r/min，所述弧菌噬菌体pc-liy1的最佳感染复数为0.1，搅拌桨转速为 40～80r/min。
24.进一步的，所述制备方法中的发酵培养基为每升海水中含5.0～10.0g蛋白胨 和1.0～4.0g酵母浸粉。
25.本发明提供了一种噬菌体pc-liy1及其生物抑菌剂能够有效控制水体、养殖 环境、其他环境的弧菌的用途。
26.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
27.1)本发明分离得到一株新的弧菌噬菌体pc-liy1，该噬菌体可以高效裂解致病 性弧菌，且具有高效的跨种裂解能力，除可以裂解实验室分离到的3株霍乱弧菌 外还可以裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，对部分希瓦氏弧菌和新喀里多 尼亚弧菌也有裂解能力。对溶藻弧菌和副溶血弧菌的裂解率分别为82％和71％， 而对大肠杆菌、酵母菌、乳杆菌
及芽孢杆菌不敏感。
28.2)该噬菌体可耐受45-70℃，ph值在4～10范围内可以保持109pfu/ml的高裂 解活性。
29.3)该噬菌体是天然的生物净化因子分离于自然环境中，在对虾水产养殖过程可 以有效控制弧菌生长，可应用于水产养殖弧菌病害的防控。将噬菌体制成生物抗 菌剂后，泼洒在水产养殖虾池中，可以在至少24h内稳定控制弧菌增长。
附图说明
30.图1为弧菌噬菌体pc-liy1在2216e琼脂平板上的噬菌斑形态。
31.图2为弧菌噬菌体pc-liy1在透射电镜下的形态。
32.图3为弧菌噬菌体pc-liy1在不同温度处理30min和60min的效价变化。
33.图4为弧菌噬菌体pc-liy1在不同ph下的效价变化。
34.图5为弧菌噬菌体pc-liy1的一步生长曲线。
35.图6为弧菌噬菌体pc-liy1对水产养殖虾池中弧菌抑制效果，每毫升水体中 含有的弧菌量计，即cfu/ml。其中a：日照虾池，b:海阳虾池。
具体实施方式
36.以下通过附图和具体实施例对本发明做进一步解释和说明。
37.以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；使用的原料和 试剂等，如无特殊说明均为市售产品。
38.实施例1：弧菌噬菌体pc-liy1的分离纯化
39.样品采集自广西省南宁市各水产农贸市场海鲜水样。
40.取100ml水样，加入100ml的2
×
lb液体培养基和1.5ml对数生长期的 霍乱弧菌vc1(本课题组保藏)，37℃摇床180r/min培养12h，以富集噬菌体。 富集液经过10000r/min、15min离心除菌，取上清液过0.22μm无菌滤膜。然后 用pbs缓冲液梯度稀释与霍乱弧菌vc1混合制备双层琼脂板。放于37℃培养箱 培养6h观察有无噬菌斑。挑取单个噬菌斑进行多次双层平板法对噬菌体进行分 离纯化。直至噬菌体在平板上形成形态、大小一样的噬菌斑，如图1所示。
41.采用磷钨酸负染色法对噬菌体进行染色。取20μl噬菌体悬液(效价10
9 pfu/ml)滴于复膜铜网上，吸附10min后取出铜网，空气中自然干燥2～3min； 然后用2％的磷钨酸溶液进行染色，2min后吸干水分，空气中干燥5min，用透 射电镜观察噬菌体的微观形态。如图2所示，噬菌体pc-liy1头部呈长二十面体， 头部长度约为110nm，宽度约为80nm，尾部长度约为100nm。在头部与尾连接 处还有一个颈圈结构，可观察到收缩性尾鞘，尾部末端可见尾丝，属于肌尾噬菌 体科(myoviridae)。
42.实施例2：弧菌噬菌体pc-liy1的全基因组特征
43.提取弧菌噬菌体pc1-liy1的dna，以此为模板，对噬菌体全基因组进行测 序，弧菌噬菌体pc1-liy1为线性双链dna，基因组大小为246,348bp，gc％含 量为42.6％。经全基因组和蛋白质组学分析，该序列无毒力因子和抗生素耐药性 基因。通过ncbi blastn进行基因组相似性比对结果如表1所示。该噬菌体与 广谱噬菌体kvp40相似度最大为98％，覆盖率
为97％。
44.表1弧菌噬菌体pc1-liy1基因组同源性比对
45.菌株类型覆盖率相似度序列号光谱噬菌体kvp4097％98％ay283928弧菌噬菌体v0996％98％mt135026弧菌噬菌体v0796％98％mt135025弧菌噬菌体vh1_201995％98％mn794232
46.将该弧菌噬菌体pc-liy1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；肌尾噬菌体pc-liy1的保藏编号为cgmcc no.23369，保藏时间为2021年 12月13日。
47.实施例3：弧菌噬菌体pc-liy1的生物特性实验
48.(1)宿主范围检测
49.采用点滴法测定噬菌体对弧菌、酵母菌、芽孢菌、乳杆菌、肠杆菌的裂解性。 将培养至对数生长期的待测菌制成双层平板，将5μl噬菌体液(109pfu/ml)滴 于凝固的双层平板表面，于37℃培养箱中培养8h，观察是否有噬菌斑产生。
50.通过点滴法测定噬菌体对从山东青岛、山东日照、山东烟台、广西南宁、江 苏南通、江苏如东、浙江宁波等地的病虾样和水样分离到的弧菌及实验室保存的 大肠杆菌及各种革兰氏阳性菌的裂解性。
51.噬菌体pc-liy1宿主范围结果如表2-表4所示，除可以裂解分离到的3株霍 乱弧菌外还可以裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌和5株拟态弧菌中，对部分希瓦氏弧 菌和新喀里多尼亚弧菌也有裂解能力。对溶藻弧菌和副溶血弧菌的裂解率分别达 到82％和71％，表明该噬菌体具有高效的跨种裂解能力。而对大肠杆菌、酵母 菌、乳杆菌及芽孢杆菌不敏感。
52.表2.弧菌噬菌体pc-liy1对副溶血性弧菌的裂解谱
53.[0054][0055]
注： ，透亮的噬菌斑； ，噬菌斑轻微模糊； ，模糊的噬菌斑；
–
，无噬菌斑
[0056]
表3.弧菌噬菌体pc-liy1对溶藻弧菌的裂解谱
[0057]
[0058]
[0059][0060]
注： ，透亮的噬菌斑； ，噬菌斑轻微模糊； ，模糊的噬菌斑；
–
，无噬菌斑
[0061]
表4.弧菌噬菌体pc-liy1对其他菌的裂解谱
[0062][0063]
注： ，透亮的噬菌斑； ，噬菌斑轻微模糊； ，模糊的噬菌斑；
–
，无噬菌斑
[0064]
(2)温度稳定性实验
[0065]
取7.6
×
109pfu/ml噬菌体500μl，分别于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴30min和60min。冷却至室温后采用双层平板法测定噬菌体效价，做三 组平行实验。
[0066]
结果如图3所示，该噬菌体在45℃～55℃处理60min，效价在109pfu/ml， 与未处理前相比没有明显降低。在60℃时，噬菌体效价开始降低，温度达到65℃ 及以上噬菌体效价降低到106pfu/ml，当70℃处理30min时噬菌体效价为 104pfu/ml，60min时噬菌体完全失活。总体分析，噬菌体pc-liy1的热稳定性 良好，能够耐受45～70℃，55℃以下不丧失其活性。
[0067]
(3)ph稳定性实验
[0068]
分别取100μl噬菌体液与0.9ml ph为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、 9.0、10.0、11.0、12.0的2216e液体培养基(hcl、naoh调节ph)混合，室温 测定3h、24h、48h时的噬菌体效价。结果如图4所示，该噬菌体在ph为4～10 的条件下，保持较高效价，其裂解活性稳定且良好，在ph值大于10或小于4 时，效价下降明显。
[0069]
(4)感染复数实验
[0070]
感染时噬菌体与指示菌细胞的数量比值称为感染复数(multiplicity ofinfection，moi)，即每个细胞感染噬菌体的数目。将3
×
10
10
pfu/ml噬菌体液 梯度稀释，与100μl菌活为3
×
108cfu/ml的对数期宿主菌溶藻弧菌va5按 moi为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10比例混合，加入5ml的液体培养基中， 37℃摇床180r/min培养至菌液澄清且可见细菌碎片。取出后分别测定各管中噬 菌体效价，效价最高所对应的moi即为最适感染复数。将moi为0.0001、0.001、 0.01、0.1、1、10的噬菌体与宿主菌培养至菌液澄清可见细菌碎片后测定噬菌体 效价，结果如表1所示。当moi＝1时，噬菌体效价最高达6
×
10
10
pfu/ml，因 此，弧菌噬菌体pc-liy1的最适感染复数为1(如表5所示)。
[0071]
表5.弧菌噬菌体pc-liy1感染复数结果
[0072][0073]
(5)氯仿敏感性实验
[0074]
取200μl chcl3与4ml效价为7.6
×
109pfu/ml的噬菌体增殖液混合，在37℃ 摇床中180r/min培养30min。10000r/min离心5min，取上清液100μl，10倍梯 度稀释，采用双层平板法测效价。将不加氯仿处理的设为对照组。检验噬菌体对 氯仿是否敏感。噬菌体经氯仿处理30min后与对照组相比，效价由7.6
×
10
9 pfu/ml降到3.5
×
109pfu/ml，效价仍保持在同一数量级，该噬菌体对氯仿不敏 感，该噬菌体外壳中无脂类物质。
[0075]
实施例3：弧菌噬菌体pc-liy1的生长特性实验
[0076]
取1ml对数期宿主菌va5(108cfu/ml)与109pfu/ml的噬菌体液按最适 感染复数(moi＝1)混合，37℃培养箱中孵育20min，使噬菌体吸附细菌。10000 r/min离心3min，弃上清液，沉淀用2216e液体培养基洗涤2次除去游离噬菌体。 用1ml培养基重悬，然后加入至50ml培养基中，37℃摇床180r/min振荡培养。 每隔10min取样一次，连续取样至180min，测定噬菌体效价并绘制一步生长曲 线，以取样时间为横坐标，以噬菌体效价的对数为纵坐标。
[0077]
计算裂解量，裂解量＝裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。
[0078]
如图5所示，在0～30min噬菌体效价没有明显变化处于潜伏期，在30～ 100min，噬菌体效价急剧增加，这段时间为噬菌体的爆发期，爆发时间持续70min， 之后曲线趋于平
稳，进入平稳期。根据裂解量公式计算得出裂解量为70pfu/cfu。
[0079]
实施例4：弧菌噬菌体pc-liy1生物抗菌剂的液体深层发酵
[0080]
将宿主菌溶藻弧菌va5按2％接种到种子培养基中，然后将溶藻弧菌va5 与所述弧菌噬菌体pc-liy1混合接种到另一种子培养基中，37℃摇床180r/min 振荡培养4h，制备宿主菌va5和弧菌噬菌体pc-liy1的种子液；
[0081]
在200l发酵罐中加入60l所述弧菌噬菌体pc-liy1的发酵培养基并灭菌 40min，按1％接种量接种宿主菌va5，然后接种弧菌噬菌体pc-liy1(感染复数 为0.1)，发酵温度设定为35～40℃，搅拌桨转速为40r/min～80r/min，进行发酵 10h～12h得到发酵混合液；
[0082]
将所述的发酵混合液经离心膜过滤去除宿主菌va5，得到弧菌噬菌体 pc-liy1液体制剂。
[0083]
双层平板法测得噬菌体效价为2.0
×
109pfu/ml～2.5
×
109pfu/ml。
[0084]
实施例5：弧菌噬菌体pc-liy1对水产养殖虾池弧菌的抑制作用
[0085]
在50立方米的农场经营的虾池中检测该噬菌体对弧菌的抑制作用。实验前 48h，从相同深度的每个虾池中取10ml水，测定虾池水的弧菌浓度，每隔24h 测一次，以确定各虾池弧菌含量。然后将500ml效价为109pfu/ml的该噬菌体 分散在1号虾池中，将养殖户经常使用的抑菌物质(碘伏、碘酊消毒剂)加入2 号虾池中。同时，3号虾池为阴性对照组，无任何抗菌物质加入。加入噬菌体和 消毒剂后，在不同时间间隔测定各虾池水样的弧菌数。为得到准确的结果，分别 在日照和海阳两地进行此试验。
[0086]
结果如图6.a，观察了处理后0～24h各组虾池水中的弧菌数量变化情况。泼 洒12h后，噬菌体处理组虾池水的总弧菌数下降到初始值的85.7％，24h后，噬 菌体处理组的弧菌数量减少到8.5
×
102cfu/ml，降为初始值的60.7％。而碘伏 消毒剂组虾池水的弧菌浓度从初始的1.8
×
103cfu/ml持续缓慢增加到2.6
×ꢀ
103cfu/ml，较初始值增加了44.5％。阴性对照组虾池水的弧菌浓度从初始的2.4
ꢀ×
103cfu/ml增加到1.5
×
104cfu/ml。图6.b，为海阳养殖场的试验结果。在0～ 56h噬菌体组虾池水的弧菌浓度始终维持在1
×
103cfu/ml水平，弧菌数量未上 升。碘酊消毒剂处理组的弧菌浓度在0～8h从最初的1.5
×
103cfu/ml降为5.2
ꢀ×
102cfu/ml，但8h后弧菌急剧增加，到56h弧菌浓度达到2.6
×
103cfu/ml， 较初始值增加了73％。阴性对照组弧菌数持续增加。
[0087]
上述结果表明，弧菌噬菌体pc-liy1对虾池水中弧菌的控制效果显著。该噬 菌体能稳定控制弧菌生长至少24h。与碘伏和碘酊消毒剂单独应用相比，该噬菌 体的实际控弧菌应用更有效。