基于血清中单个外泌体转录因子TAZ水平的标志物在制备治疗肺癌诊断中的应用

基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物在制备治疗肺癌诊断中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，涉及一种从血液中检测外泌体蛋白水平作为肺癌诊断的标志物，具体涉及单个外泌体中转录因子taz的含量。


背景技术：

2.肺癌是目前中国乃至世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌在发病的时候一般比较隐匿，早期症状并不明显，容易被患者忽视；同时，肺癌的发展比较快，大约30％的患者在就诊时就已经发生了远处转移。在出现明显症状的患者中，75％都已经发生转移或是局部晚期，50-60％的患者在治疗过程中出现远处转移。除此以外，肺癌的疗效也一直没有明显提高，五年生存率仅仅为18％，究其根本，还是因为不能早期诊断造成的。目前对于肺癌诊断手段有ct等影像学检查以及组织活检等方法，影像学类检查在肿瘤早期病灶小的时候漏检概率很大，而组织活检由于其侵入式的特征会对患者造成痛苦，一般在影像学初步诊断后操作，存在滞后性，对患者的治疗也是不利的。
3.液体活检技术的出现，解决了上述的问题，也提前了癌症的诊断时间。作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液对癌症等疾病做出诊断。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比高，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段，具有极高的临床应用价值和市场前景。
4.外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm大小的双层膜结构的囊泡，包裹有细胞特异的蛋白、核酸和脂质等生物大分子。几乎所有的细胞都能分泌外泌体，包括肿瘤细胞，而且外泌体分布在人体的各种体液中。由于肿瘤细胞分泌的外泌体内容物可以反映其来源肿瘤的特征，因此血清外泌体可以作为肿瘤疾病的生物标志物，是液体活检的一个重要的研发方向。
5.目前已有的关于肺癌患者血清外泌体中的标志物大体可以分为以下几个类别，有rna类：包括exosome diagnostics公司的产品exodx lung(alk)检测试剂盒，mirna类(专利申请号：pct/cn2018/090043)，circrna类(申请号：201810112800.0)等，以及蛋白类：caveolin-1(申请号：201910293336.4)，lbp(申请号：201810318885.8)，gcc2(申请号：201880072074.2)，ahsg或/和ecm-1(申请号：201810561202.1)等，各有其优劣。
6.目前rna类标志物种类繁多(rna、mirna、circrna等)，一般需要多种标志物联合使用才能达到理想的灵敏度和诊断效能，目前还未有一种标志物能单独用于临床疾病诊断。蛋白类标志物较少，大多是肺癌的阳性标志物，且存在灵敏性和特异性较差的问题，更重要的是，不同患者血清中含有外泌体的量因人而异，并且提取外泌体的过程中会造成不同程度的外泌体的量损失，仅仅用等量血清中外泌体蛋白的含量比较正常人和患者是不够准确的。
7.众所周知，yap和taz蛋白是hippo信号通路的核心分子。hippo通路是20年前首次在果蝇体内发现的一种保守的信号通路，由一系列激酶，转录共激活因子以及dna结合蛋白
构成的。当通路被激活时，pmst1/2和plats1/2进一步磷酸化yap/taz，将yap/taz停留在胞质内，抑制其入核。抑制hippo通路时，未磷酸化的yap/taz入核，促进多种与细胞增殖、存活和迁移相关的下游基因转录，最终引发各种组织的肿瘤发生。因此，yap和taz的过度激活在癌症中普遍存在，yap和taz位点的基因扩增和表观遗传调节也同样普遍，yap和taz介导的转录活性对肿瘤的发生发展具有重要意义，主要影响肿瘤的增殖、存活和干性。目前，现有技术以及文献中还未有关于恶性肿瘤中外泌体taz蛋白的报道。


技术实现要素：

8.针对现有技术中肺癌血清外泌体标志物，甚至扩大到别的疾病范围，没有关注到受试者血清外泌体数量的个体差异以及提取外泌体的过程中，造成不同样本中不同程度外泌体的损失，取等量血清中外泌体rna或蛋白的量做为标志物来区分健康人和患者，因此会造成损失一部分灵敏度和特异性。目前还未有文献以及相关技术发现肺癌外泌体中含有taz，也更未有发现外泌体taz可以作为肺癌诊断阴性标志物的报道，故本发明的首要目的是寻找新的肺癌血清外泌体标志物，着重研究血清中等量外泌体包含蛋白的量，即用等量外泌体中的taz蛋白水平区分正常人和肺癌患者，发现相比于正常人，肺癌患者血清中单个外泌体中的taz蛋白的含量显著减少，可作为肺癌的阴性标志物使用。
9.本发明的第二个目的是提供上述单个外泌体转录因子taz水平的检测方法。
10.为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
11.一种基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物在制备治疗肺癌诊断中的应用。
12.优选地，血清中单个外泌体转录因子taz水平在肺癌患者血清中显著降低，即taz蛋白含量显著减少，关键点在于taz蛋白在细胞中是促癌分子，然而被分泌到外泌体中变成肺癌的阴性标志物，这是因为细胞更倾向于留taz在细胞内发挥促癌作用而非分泌到体外，即外泌体中，故肺癌患者血清中单个外泌体中的taz蛋白的含量显著减少。
13.具体地，基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物可以单独作为肺癌诊断阴性标志物应用。另外，单个外泌体转录因子taz还可以和其他除了外泌体转录因子以外的taz阳性标志物或阴性标志物在血清中联合使用，从而使得基于taz蛋白标志物的同时加上其他阳性标志物作为组合标志物成为可能。其中，其他阳性标志物或阴性标志物包括现有的以及未发现的除taz蛋白以外的肺癌标志物，其他阳性标志物包括但不限于mir-21、mir-205、mir-126和mir-486-5p中的一种以上。
14.为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
15.一种基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物的检测方法，其包括如下步骤：
16.(1)、将受试者(肺癌患者和健康人)的血液收集在真空采血管中，常温放置15
±
0.1min，等凝血之后离心，吸取上清液，即为血清，血清再离心，去除液面上的脂肪等杂质；
17.(2)、将步骤(1)离心后的上清液进行超速离心，取沉淀物用磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬，再次超速离心，得到的沉淀即为外泌体；
18.(3)、富集后的外泌体用30μl pbs重悬后，取1μl用pbs稀释一万倍，并进行外泌体浓度检测；
19.(4)、得到肺癌患者和健康人样本的外泌体浓度后，取等量外泌体(2
×
10
8-3
×
108个左右)，加入loading buffer裂解，使得蛋白变性，将不同大小的蛋白分离开，用taz蛋白的抗体孵育使其显色，比较等量外泌体中taz蛋白水平的高低，用imagej软件量化显色深浅，所得的值除以外泌体数量得到单个外泌体中taz的蛋白水平。
20.优选地，步骤(1)中，凝血之后的离心的转速为3000
±
10rpm，时间为10
±
0.1min；吸取上清液后离心的转速为(3000
±
10)
×
g，时间为15
±
0.1min。
21.优选地，步骤(2)中，外泌体的提取方法选自extrapeg法、sbi exoquick法、磁珠法、尺寸排阻色谱法、超滤法、微流控法和超速离心法中的一种以上。
22.优选地，步骤(2)中，超速离心的转速均为(100000
±
100)
×
g，时间均为70
±
0.1min。
23.优选地，步骤(3)中，外泌体浓度检测的方法选自纳米流式分析仪、动态光散射、流式细胞分选、外泌体蛋白定量和纳米颗粒跟踪分析中的一种以上。
24.优选地，步骤(4)中，taz蛋白的表达水平的测量方法选自蛋白芯片分析法、免疫测量法、配体结合分析法、基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱分析、表面增强激光解吸-电离飞行时间质谱分析、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色法、补体固定法、二维电泳分析、液相色谱-质谱、液相色谱-质谱/质谱、西方墨点法、酶联免疫吸附法和western blot法中的一种以上。
25.优选地，步骤(4)中，裂解的温度为95
±
1℃，时间为5
±
0.1min。
26.本发明原创性地发现转录因子taz可以被肺癌细胞选择性地分泌到外泌体中，并且相比于健康对照组，肺癌患者分选较少的taz进入外泌体，即肺癌患者血清中单个外泌体中的taz蛋白含量显著减少。若不严格限定等量外泌体，而是基于等量血清检测，则单个外泌体taz含量的差异有可能会因为患者血清外泌体数量的个体差异而被覆盖掉，从而导致灵敏度降低。故本发明欲保护单个外泌体中蛋白含量作为标志物，不同于现有技术中等量血清提取外泌体后检测蛋白含量，因此，本发明中加入检测外泌体数量这一步骤，关键点在于保证外泌体数量一致的情况下，从而检测蛋白含量。
27.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
28.本发明的肺癌血清外泌体标志物是基于单个外泌体中转录因子taz蛋白的水平，首先精准定量外泌体的数量，基于等量外泌体的分析能提高该标志物的可靠性；其次，外泌体taz蛋白水平在肺癌血清患者中降低，故其作为阴性标志物可以单独使用，或与其他阳性标志物或阴性标志物在血清中联合使用，从而提高疾病检测的准确度。
附图说明
29.图1为本发明的实施例中外泌体的电镜图。
30.图2为本发明的实施例中纳米粒子追踪分析系统(nta)对外泌体的浓度和粒径分析的检测结果图(横坐标size为粒径，纵坐标concentration为浓度)。
31.图3为本发明的实施例中western blot技术对外泌体蛋白marker的鉴定图。
32.图4为本发明的实施例中western blot技术检测健康人和肺癌患者血清等量外泌体中taz水平图。
33.图5为本发明的实施例中比较健康人和肺癌患者血清中单个外泌体的taz含量的
统计图，纵坐标为imagej软件统计的western blot图的条带灰度值除以nta测出的外泌体数量。
34.图6为本发明的实施例中评价以血清中单个外泌体taz的含量作为肺癌阴性标志物的受试者工作特征(roc)曲线图。
具体实施方式
35.本发明的基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物可以在制备治疗肺癌诊断中得以应用，且单个外泌体转录因子taz水平在肺癌患者血清中降低，taz(transcriptional coactivator with pdz-binding motif)为hippo信号通路中的带有pdz结合基序的转录共激活因子，基因名为wwtr1(ww domain-containing transcription regulator protein 1)。
36.另外，基于血清中单个外泌体转录因子taz水平的标志物还可以单独作为肺癌诊断阴性标志物应用，或者可以和其他除了外泌体转录因子以外的taz阳性标志物或阴性标志物在血清中联合使用，下调的肺癌阴性标志物包括但不限于mir-152、let-7a或mir-148a，其他上调的阳性标志物包括但不限于mir-21、mir-205、mir-126或mir-486-5p。
37.本发明的单个外泌体转录因子taz水平的标志物的检测方法包括如下步骤：
38.(1)、将受试者(肺癌患者和健康人)的血液收集在真空采血管中，常温放置15
±
0.1min，等凝血之后离心，吸取上清液，即为血清，血清再离心，去除液面上的脂肪等杂质；
39.(2)、将步骤(1)离心后的上清液进行超速离心，取沉淀物用磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬，再次超速离心，得到的沉淀即为外泌体；
40.(3)、富集后的外泌体用30μl pbs重悬后，取1μl用pbs稀释一万倍，用纳米粒子追踪分析系统(nta)进行外泌体浓度检测；
41.(4)、得到肺癌患者和健康人样本的外泌体浓度后，取等量外泌体(2
×
10
8-3
×
108个左右)，加入loading buffer裂解，使得蛋白变性，用western blot技术将不同大小的蛋白分离开，用taz蛋白的抗体孵育使其显色，比较等量外泌体中taz蛋白水平的高低，用imagej软件量化显色深浅，所得的值除以外泌体数量得到单个外泌体中taz的蛋白水平。
42.在步骤(1)中，凝血之后的离心的转速可以为3000
±
10rpm，优选为3000rpm；时间可以为10
±
0.1min，优选为10min；吸取上清液后离心的转速可以为(3000
±
10)
×
g，优选为3000
×
g；时间可以为15
±
0.1min，优选为15min。
43.在步骤(2)中，超速离心的转速均可以为(100000
±
100)
×
g，优选为100000
×
g；时间均可以为70
±
0.1min，优选为70min。
44.在步骤(2)中，血清外泌体提取方法上，除了本发明使用的超速离心法外，可替代方案还有其他外泌体提取方法，包括但不限于extrapeg法、sbiexoquick法、磁珠法、尺寸排阻色谱法、超滤法和微流控法等。
45.在步骤(3)中，外泌体浓度检测方法上，除了本发明使用的纳米粒子追踪分析系统(nta)外，可替代方案还有其他能检测外泌体等100纳米左右颗粒浓度的仪器，包括但不限于纳米流式分析仪、动态光散射、流式细胞分选和外泌体蛋白定量等。
46.在步骤(4)中，外泌体蛋白taz的检测方法上，除了本发明使用的western blot技术，可替代方案还有其他能检测蛋白含量的方法，包括但不限于蛋白芯片分析法、免疫测量
法、配体结合分析法、基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱分析、表面增强激光解吸-电离飞行时间质谱分析、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织染色法、补体固定法、二维电泳分析、液相色谱-质谱、液相色谱-质谱/质谱、西方墨点法和酶联免疫吸附法等。
47.在步骤(4)中，裂解的温度可以为95
±
1℃，优选为95℃；时间可以为5
±
0.1min，优选为5min。
48.以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
49.实施例：
50.实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
51.实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
52.实施例中血清可以是从由血液、血清、血浆中选择的一种或多种，并且优选是血液，但不限于此。
53.实施例中的纳米颗粒追踪系统(nta)为德国particle metrix公司的zetaview，然而外泌体数量的检测方法的非限制性实例包括：纳米流式分析仪、动态光散射、流式细胞分选和外泌体蛋白定量等。
54.实施例中的超速离心机来自美国backman公司，然而血清外泌体提取方法的非限制性实例包括：extrapeg法、sbi exoquick法、磁珠法、尺寸排阻色谱法、超滤法和微流控法等。
55.实施例中taz蛋白的表达水平的测量方法或比较分析方法的非限制性实例包括：蛋白芯片分析法、免疫测量法、配体结合分析法、基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱分析、表面增强激光解吸-电离飞行时间质谱分析、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织染色法、补体固定法、二维电泳分析、液相色谱-质谱、液相色谱-质谱/质谱、西方墨点法和酶联免疫吸附法等。
56.本实施例中单个外泌体转录因子taz水平的标志物的检测方法包括如下步骤：
57.(1)、将受试者(肺癌患者和健康人)的血液收集在真空采血管中，常温放置15min，等凝血之后，以3000rpm的转速离心10min，吸取上清液，即为血清，血清再以3000
×
g的转速离心15min，去除液面上的脂肪等杂质。
58.(2)、用超速离心法从处理后的血清中提取外泌体，即将血清以100000
×
g用超速离心机离心70min，取沉淀，用pbs重悬，再次以100000
×
g离心70min，得到的沉淀即为外泌体。
59.(3)、如图1所示，透射电镜(tem)形态分析得出，外泌体呈现经典的杯状结构，直径小于200nm。如图2所示，大部分颗粒直径都小于200nm，符合外泌体的粒径分布。如图3所示，对富集的外泌体进行蛋白marker，从而显示提取的外泌体样本中有外泌体蛋白marker(alix、tsg101、cd63、cd9、yap)以及目的蛋白taz。
60.(4)、富集后的外泌体用30μl pbs重悬后，取1μl用pbs稀释一万倍，用纳米粒子追踪分析系统(nta)进行外泌体浓度检测。
61.(5)、得到肺癌患者和健康人样本的外泌体浓度后，取等量外泌体(2
×
108个左右)，加入loading buffer裂解，热机95℃煮5min使蛋白变性，用western blot技术将不同大小的蛋白分离开，用taz蛋白的抗体孵育使其显色，比较等量外泌体中taz蛋白水平的高
低(如图4所示)，由于不同样品提取出的外泌体数量不同，为了保证能检测出taz，上样的外泌体要尽可能多，所以浓度高的样品上样量多，浓度少的上样量少。图4中同时显示nta测得的外泌体数量：健康人血清中等量外泌体taz的含量高于肺癌患者。
62.(6)、用imagej软件量化显色深浅，所得的值除以外泌体数量得到单个外泌体中taz的蛋白水平，用graphpad软件进行统计分析，所有数据按照平均值加标准差的方式给出，数据使用unpaired t test分析方法进行评估，p值小于0.05认为是统计学显著的，如图5所示，结果显示健康人血清中单个外泌体taz的含量显著高于肺癌患者，统计性差异p值小于0.01。如图6所示，结果显示曲线下面积(auc)为0.8958，证明此肺癌阴性标志物在肺癌诊断中具有很好的诊断效能，诊断阈值为0.002001时，灵敏度和特异性为91.67％。
63.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。