用于治疗癌症的被遗传修饰的NK-92细胞和单克隆抗体的制作方法

用于治疗癌症的被遗传修饰的nk-92细胞和单克隆抗体
1.本技术是申请日为2016年3月25日、申请号为201680019087.4、发明名称为“用于治疗癌症的被遗传修饰的nk-92细胞和单克隆抗体”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2015年3月27日提交的美国临时申请no.62/139,258的优先权权益，其通过引用并入本文。


背景技术：

4.单克隆抗体(mabs)的抗癌治疗已经显著改善癌症患者的临床结果，特别是当与化学疗法组合时。然而，患者经常最终复发。自然杀伤细胞也可以用作细胞毒性效应细胞用于基于细胞的免疫治疗。
5.nk-92是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现，且然后离体永生化的细胞溶解性癌细胞系。nk-92细胞来源于nk细胞，但缺乏正常nk细胞展示的主要抑制性受体，同时保留大部分活化受体。然而，nk-92细胞不攻击正常细胞，也不在人类中引起不可接受的免疫排斥反应。nk-92细胞系的表征在wo 1998/49268和美国专利申请公布no.2002-0068044中公开了。nk-92细胞也被评估为治疗某些癌症的潜在治疗剂。
6.尽管nk-92细胞保留了与nk细胞相关的几乎所有活化受体和细胞溶解途径，但它们在其细胞表面上不表达cd16。cd16是fc受体，其识别并结合抗体的fc部分以激活nk细胞用于抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)。由于没有cd16受体，nk-92细胞不能通过adcc机制裂解靶细胞。
7.本发明通过向需要抗癌治疗的受试者同时或随后施用表达fc受体的nk-92细胞，增强一些分子抗体的细胞毒性作用，提供了上述问题的解决方案。


技术实现要素：

8.在一个方面，本发明包括向需要抗癌治疗的受试者共同施用对靶癌细胞具有细胞毒性作用的单克隆抗体和被工程化以表达fc受体的nk-92细胞。这种组合协同nk细胞的抗癌作用与治疗性抗体的抗癌作用。
9.因此，在一个实施方式中，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用对靶癌细胞具有细胞毒性作用的单克隆抗体和表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，fcr是cd16。在本发明的一个方面，nk-92细胞被遗传修饰以表达编码与seq id no:1具有至少90％序列同一性的多肽的fc受体(在第158位具有苯丙氨酸的fcγriii-a或cd16(f-158)；或与seq id no:2具有至少90％序列同一性的多肽的fc受体(在第158位具有缬氨酸的cd16(f158v)，更高亲和力形式)。在典型的实施方式中，cd16多肽在158位具有缬氨酸。
10.在另外的实施方式中，nk-92细胞被另外地修饰以表达细胞因子，例如il-2。在一些实施方式中，细胞因子靶向内质网。在具体实施方式中，细胞因子是靶向内质网的白细胞介素-2或其变体。在一些实施方式中，nk-92细胞被修饰以表达具有seq id no:7的序列的
多肽。
11.在其它实施方式中，nk-92细胞被进一步修饰以表达自杀基因。在一个方面，自杀基因是icas9。
12.本发明的组合物可用于治疗癌症，包括但不限于癌症如多发性骨髓瘤，白血病，淋巴瘤，转移性乳腺癌或胃癌。
13.被施用于患者的单克隆抗体可以是裸单克隆抗体，缀合单克隆抗体或双特异性单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是阿仑单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，替伊莫单抗(ibritumomab)，吉妥珠单抗(gemtuzumab)，本妥昔单抗(brentuximab)，阿曲坦单抗(adotranstuzumab)，blinatunomab，daratumumab或埃罗妥珠单抗(elotuzumab)。
14.在一些实施方式中，单克隆抗体和表达fcr的nk-92细胞被同时施用于受试者。在其它实施方式中，受试者被施用单克隆抗体，并随后在施用单克隆抗体后，例如在24小时内，或在24至72小时内，被施用表达fcr的nk-92细胞。
15.在一些方面，本发明涉及被遗传修饰以表达fcr(例如cd16)的nk-92细胞与细胞毒性单克隆抗体一起治疗癌症的用途。因此，在一些实施方式中，本发明提供被遗传修饰以表达cd16的nk-92细胞与细胞毒性单克隆抗体一起用于患有癌症的患者的用途。在一些实施方式中，fc受体是在cd16的成熟形式的第158位具有缬氨酸的cd16。在一些实施方式中，fc受体包含编码与seq id no:1或seq id no:2具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列或编码seq id no:1或seq id no:2的多核苷酸。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞被遗传修饰以表达细胞因子，例如白细胞介素-2或其变体。在一些实施方式中，白细胞介素-2靶向内质网。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞被修饰以表达如seq id no:7所示的白细胞介素-2序列。在一些实施方式中，fc受体和至少一种细胞因子由不同的载体编码。或者，fc受体和至少一种细胞因子由相同的载体编码。在一些实施方式中，fc受体包含在第158位具有v的cd16多肽，并且nk-92细胞被进一步遗传修饰以表达人白细胞介素-2，其中白细胞介素2靶向内质网。表达fcr的nk-92细胞还可以被进一步修饰以表达自杀基因，例如icas9。在一些实施方式中，癌症是白血病，非霍奇金淋巴瘤，转移性乳腺癌或胃癌。单克隆抗体可以是裸单克隆抗体，缀合单克隆抗体或双特异性单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是阿仑单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，替伊莫单抗，本妥昔单抗，吉妥珠单抗，阿曲坦单抗，blinatunomab，avelumamab，daratumumab或埃罗妥珠单抗。在一些实施方式中，单克隆抗体和表达fcr的nk-92细胞被同时施用于受试者。在一些实施方式中，受试者被施用单克隆抗体，并随后被用被遗传修饰的表达fcr的nk-92细胞治疗。在一些实施方式中，单克隆抗体被静脉内注射到受试者。在其他实施方式中，被遗传修饰的表达fcr的nk-92细胞被注射到骨髓中。
16.前述一般描述和以下详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供所要求保护的本发明的进一步解释。从本发明的以下详细描述，其他目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
17.在结合附图考虑时，参考下列公开内容，本发明的目的、特征和优点将更容易理解。
18.图1显示了表达il-2的修饰形式与errs(内质网保留信号)和cd16的质粒的示意图。
19.图2a和2b提供了说明性数据，其显示在约2周(图2a)和约4周(图2b)时，使用图1所示的质粒载体，在被修饰以表达cd16的nk-92细胞中的cd16表达。
20.图3提供了说明性数据，其显示被修饰的nk-92细胞中的cd16表达，所述nk-92细胞被冷冻储存，然后解冻培养。
21.图4提供了说明性数据，其显示与单克隆抗体组合使用的表达cd16的nk-92细胞的adcc活性。
具体实施方式
22.在一个方面，本公开涉及被修饰以表达fcr的nk-92细胞和单克隆抗体在有需要的受试者中治疗癌症的用途。恶性细胞能够发展出逃避先天免疫细胞(如树突状细胞和天然杀伤细胞)和适应性免疫细胞(如t细胞和b细胞)提供的免疫保护的机制。因此，迫切需要减少患有癌症或怀疑患有癌症的受试者的肿瘤复发的发生率。
23.nk-92细胞呈现出有吸引力的特征，即它们可以容易地在体外繁殖和扩增。然而，它们不表达igg fc受体fcγriii，因此这些细胞不能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)起作用。本发明是基于使nk-92细胞表达igg fc受体fcγriii的遗传转化将增强nk-肿瘤细胞相互作用，并允许nk细胞与通过adcc杀死靶细胞的单克隆抗体一起工作的情况。因此，当单克隆抗体和nk-92细胞被同时地或以紧密的时间关系施用于患有癌症或在其他方面需要癌症治疗的受试者时，可以增加nk-92细胞和单克隆抗体单独的细胞毒性作用。
24.因此，本发明提供了被遗传修饰以表达跨膜免疫球蛋白γfc区受体iii-a的高亲和力形式(其中在多肽的成熟形式的第158位存在缬氨酸的fcγriii-a或cd16)的nk-92细胞的用途。
25.在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞可以被进一步修饰以表达il-2。在这样的细胞中，il-2在细胞中的表达通常指向内质网。该特征防止全身性施用il-2的不期望的作用，例如影响心血管，胃肠道，呼吸系统和神经系统的毒性。在一些实施方式中，当表达fcr的nk-92细胞被进一步修饰以表达il-2时，也可将自杀基因插入到这些细胞中，以防止il-2的未经调节的内源性表达，其可以导致具有自主生长的突变体的潜在发展。在一些实施方式中，自杀基因是icas9。
26.将根据本发明产生的表达fcr的nk-92细胞与靶向癌细胞的单克隆抗体组合施用于患有或怀疑患有癌症的受试者以有效治疗癌性疾病。
27.施用表达fcr的nk-92细胞可以与施用单克隆抗体同时进行，或以顺序方式进行。在一些实施方式中，在已经用单克隆抗体治疗受试者后的24小时内，向受试者施用表达fcr的nk-92细胞。
28.术语
29.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
30.在本说明书和下面的权利要求书中，将提及应被定义为具有以下含义的多个术语：
31.本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不意在限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
32.包括范围在内的所有数字标示，例如ph，温度，时间，浓度，量，分子量是近似值，其在适合的地方通过0.1或1.0的增量而变化( )或(-)。应当理解，虽然并不总是明确说明，但是所有的数字标示之前都可以是术语“约”。还应当理解，虽然并不总是明确说明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且这些的等价物是本领域已知的。
[0033]“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括事件或情况发生的例子以及不发生的例子。
[0034]
术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所记载的要素，但不排除其他要素。用于限定组合物和方法时，“基本上由...组成”是指所规定的材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。“由
……
组成”应意味着排除超过痕量的其他成分和所记载的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方式都在本发明的范围内。
[0035]
如用于描述本发明的，“免疫疗法”是指与抗体(天然存在或被修饰的nk细胞或t细胞)(无论是单独还是组合使用)组合使用被修饰或未修饰的nk-92细胞，并且当与靶细胞接触时其能够诱导细胞毒性。
[0036]
如用于描述本发明的，“天然杀伤(nk)细胞”是在特异性抗原刺激不存在的情况下杀死靶细胞，并且根据mhc类没有限制的免疫系统的细胞。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。nk细胞的特征在于存在cd56和不存在cd3表面标志物。
[0037]
术语“内源性nk细胞”用于指源自供体(或患者)的nk细胞，与nk-92细胞系不同。内源性nk细胞通常是异种细胞群，其中nk细胞已被富集。内源性nk细胞可以用于患者的自体或同种异体治疗。
[0038]“nk-92细胞”是指最初从患有非霍奇金淋巴瘤的患者获得的永生nk细胞系nk-92。为了本发明的目的，除非另有说明，术语“nk-92”是指原始的nk-92细胞系以及已被修饰的nk-92细胞系(例如通过引入外源基因)。nk-92细胞及其示例性和非限制性修饰在美国专利号7,618,817；8,034,332；和8,313,943中描述，其全部内容通过引用并入本文。
[0039]“被修饰的nk-92细胞”是指进一步包含编码转基因(包括cd16)的载体的nk-92细胞。在一些实施方式中，被修饰的表达fcr的nk-92细胞可以被进一步修饰以表达细胞因子如il-2，和/或自杀基因。
[0040]
如本文所用，“未照射的nk-92细胞”是尚未被照射的nk-92细胞。照射使细胞不能生长和增殖。在一些实施方式中，设想用于施用的nk-92细胞将在治疗设施处或在治疗患者之前的某个其他点被照射，因为照射和输注之间的时间不应超过4小时，以保持最佳活性。或者，nk-92细胞可以通过另外的机制失活。
[0041]
如用于描述本发明的，nk-92细胞的“失活”使得它们不能生长。失活也可能与nk-92细胞的死亡有关。设想nk-92细胞在其已经有效地清除与治疗应用中的病理学相关的细胞的离体样品之后，或者在它们已经在哺乳动物体内驻留足以有效地杀死体内驻留的许多或所有靶细胞的时间段之后被失活。作为非限制性实例，可以通过施用nk-92细胞对其敏感的失活剂诱导失活。
[0042]
如用于描述本发明的，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞例如nk细胞的活性时，旨在是同义的。通常，细胞毒性活性涉及通过各种生物、生物化学或生物物理机制中的任一种杀死靶细胞。细胞溶解更具体地涉及效应物裂解靶细胞的质膜，从而破坏其物理完整性的活性。这导致杀死靶细胞。不希望被理论束缚，据信nk细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。
[0043]
关于细胞/细胞群体的术语“杀死”旨在包括将导致该细胞/细胞群体死亡的任何类型的操作。
[0044]
术语“fc受体”是指通过结合到称为fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能的某些细胞(例如天然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。对fcr根据其识别的抗体类型进行分类。例如，fc-γ受体(fcγr)结合igg类抗体。fcγriii-a(也称为cd16)是结合igg抗体并激活adcc的低亲和性fc受体。通常在nk细胞上发现fcγriii-a。编码cd16的天然形式的代表性多核苷酸序列显示在seq id no:5中。
[0045]
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式：脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针，引物，est或sage标签)，外显子，内含子，信使rna(mrna)，转移rna，核糖体rna，核酶，cdna，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的dna，任何序列的分离的rna，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构以修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子二者。除非另有说明或要求，否则作为多核苷酸的本发明的任何实施方式都包括双链形式和已知或预期构成双链形式的两种互补单链形式的任一种。
[0046]
多核苷酸由四种核苷酸碱基(腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)；和当多核苷酸是rna时针对胸腺嘧啶的尿嘧啶(u))的特定序列组成：。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。
[0047]
如本文所用，“同一性百分比”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。同一性百分比可以通过比较可以为比较目的而比对的每个序列中的位置而测定。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。如本文所用，短语“同源”或“变体”核苷酸序列，或“同源”或“变体”氨基酸序列是指特征为在核苷酸水平或氨基酸水平具有至少规定百分比的同一性的序列。同源核苷酸序列包括编码本文所述的核苷酸序列的天然存在的等位基因变体和突变的那些序列，同源核苷酸序列包括编码除人以外的哺乳动物物种的蛋白质的核苷酸序列。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸取代和其多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些实施方式中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列具有至少60％或更大，例如至少70％，或至少80％，或至少85％或更大。在一些实施方式中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一些实施方式中，同源氨基酸序列具有不超过15个，不超过10个，不超过5个或不超过3个保守氨基酸取代。同一性百分比可以通过例
如使用默认设置的gap程序(wisconsin sequence analysis package，unix第8版，genetics computer group，university research park，madison wis.)测定，其使用smith和waterman算法adv.appl.math.，1981，2482-489)。
[0048]
术语“表达”是指基因产物的产生。当涉及表达时，术语“瞬时(transient)”是指多核苷酸不被引入到细胞的基因组中。
[0049]
术语“细胞因子”或“细胞因子”是指影响免疫系统细胞的一般类别的生物分子。用于实施本发明的示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白细胞介素(il)，特别是il-2，il-12，il-15，il-18和il-21。在优选的实施方式中，细胞因子是il-2。
[0050]
如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子，使得当被放置在允许的细胞内时，可以例如通过转化过程复制载体的非染色体核酸。载体可以在一种细胞类型例如细菌中复制，但是在另外的细胞例如哺乳动物细胞中复制能力有限。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸dna；与阳离子脂质复合的dna，单独或与阳离子聚合物组合；阴离子和阳离子脂质体；dna-蛋白复合物和包含与阳离子聚合物(如异源聚赖氨酸、限定长度的寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的dna的颗粒，在一些情况下被包含在脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-dna的三元复合物。
[0051]
如本文所用，术语“靶向(targeted)”旨在包括但不限于将蛋白质或多肽引导到在细胞中或其外部的适当目的地。靶向通常通过信号肽或靶向肽(其是多肽链中的氨基酸残基段)而实现。这些信号肽可位于多肽序列内的任何位置，但通常位于n端。多肽也可以被工程化成在c端具有信号肽。信号肽可以引导多肽到胞外部分，质膜，高尔基体，内体，内质网和其它细胞区室的位置。例如，在其c端具有特定氨基酸序列的多肽(例如kdel)被保留在er腔中或者被运输回er腔。
[0052]
术语“自杀基因”是允许细胞的阴性选择的基因。使用自杀基因作为安全系统，允许通过引入选择剂使表达该基因的细胞被杀死。在重组基因导致致使不受控制的细胞生长的突变的情况下，这是期望的。已经鉴定了许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因，胞嘧啶脱氨酶基因，水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因，硝基还原酶基因，大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌deo基因(还参见，例如，yazawa k，fisher w e，brunicardi f c：current progress in suicide gene therapy for cancer.world j.surg.2002，7月；26(7)：783-9)。在一个实施方式中，自杀基因是可诱导性半胱天冬酶9(icas9)(di stasi，(2011)“inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy”，n engl j med 365：1673-1683。还参见morgan，“live and let die:a new suicide gene therapy moves to the clinic”molecular therapy(2012)；20：11-13)。tk基因可以是野生型或突变tk基因(例如，tk30，tk75，sr39tk)。使用更昔洛韦可以杀死表达tk蛋白的细胞。
[0053]
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从在培养物中生长的细胞的单个克隆产生且能够无限增殖的纯的靶特异性抗体。根据本发明可以使用的单克隆抗体包括附着于癌细胞并阻断抗原的裸抗体。在一个实施方式中，裸单克隆抗体是阿伦单抗，其结合到淋巴细胞中的cd52抗原。还包括在根据本发明可以使用的单克隆抗体中的是缀合单克隆抗体，例如加标签的、标记的或加载的抗体。具体地，抗体可以被加标签或加载药物或毒素，或被放射性标记。这样的抗体的实例包括但不限于靶向cd20抗原的替伊莫单抗，靶向cd30抗原的brentuximab和靶向her2蛋白的曲妥珠单抗。根据本发明可以使用的其它单克隆抗体是双
特异性单克隆抗体，例如靶向淋巴瘤细胞中的cd19和t细胞中的cd3的blinatunomab。
[0054]
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指体外或原位可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
[0055]
术语“治疗”或“治疗”涵盖在受试者例如人中治疗如本文所述的疾病或紊乱，并且包括：(i)抑制疾病或紊乱，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或紊乱，即导致紊乱消退；(iii)减缓紊乱进展；和/或(iv)抑制、减轻或减缓疾病或紊乱的一种或多种症状的进展。术语向受试者“施用”或“施用”单克隆抗体或天然杀伤细胞包括引入或递送抗体或细胞以执行预期功能的任何途径。施用可以通过适合于递送细胞或单克隆抗体的任何途径进行。因此，递送途径可以包括静脉内，肌肉内，腹膜内或皮下递送。在一些实施方式中，单克隆抗体和/或nk-92细胞被直接施用于肿瘤，例如通过注射到肿瘤中。施用包括自我管理和通过另外的人施用。
[0056]
nk-92细胞
[0057]
nk-92细胞系是被发现在白细胞介素2(il-2)存在的情况下增殖的唯一细胞系。gong等，leukemia 8：652-658(1994)。这些细胞对各种癌症具有高细胞溶解活性。nk-92细胞系是具有广泛的抗肿瘤细胞毒性、扩增后具有可预测的收率的同质癌性nk细胞群。i期临床试验已证实其安全性。
[0058]
发现nk-92细胞系展示cd56
bright
，cd2，cd7，cd11a，cd28，cd45和cd54表面标志物。此外，它不展示cd1，cd3，cd4，cd5，cd8，cd10，cd14，cd16，cd19，cd20，cd23和cd34标志物。nk-92细胞在培养物中的生长取决于重组白介素2(ril-2)的存在，剂量低至1iu/ml足以维持增殖。il-7和il-12不支持长期生长，所测试的其他细胞因子(包括il-1α，il-6，肿瘤坏死因子α，干扰素α和干扰素γ)也不支持。nk-92即使在1:1的低效应物:靶(e:t)比率下也具有高细胞毒性。gong等，同上。nk-92细胞被保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，名称为crl-2407。
[0059]
迄今为止，关于内源性nk细胞的研究已经表明，il-2(1000iu/ml)对于运输过程中的nk细胞激活至关重要，但是细胞不需要被保持在37℃和5％二氧化碳下。koepsell等，transfusion 53：398-403(2013)。
[0060]
自杀基因
[0061]
术语“自杀基因”是允许细胞的阴性选择的基因。使用自杀基因作为安全系统，允许通过引入选择剂使表达该基因的细胞被杀死。在重组基因导致致使不受控制的细胞生长的突变的情况下，这是期望的。已经鉴定了许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因，胞嘧啶脱氨酶基因，水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因，硝基还原酶基因，大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌deo基因(还参见，例如，yazawa k，fisher w e，brunicardi f c：current progress in suicide gene therapy for cancer.world j.surg.2002，7月；26(7)：783-9)。如本文所用，自杀基因在nk-92细胞中是有活性的。通常，自杀基因编码对细胞没有不良影响，但在特定化合物存在的情况下将杀死细胞的蛋白质。因此，自杀基因通常是系统的一部分。
[0062]
在一个实施方式中，自杀基因是胸苷激酶(tk)基因。tk基因可以是野生型或突变tk基因(例如，tk30，tk75，sr39tk)。使用更昔洛韦可以杀死表达tk蛋白的细胞。
[0063]
在另一个实施方式中，自杀基因是在5-氟胞嘧啶存在的情况下对细胞具有毒性的胞嘧啶脱氨酶。garcia-sanchez等，“cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1million-fold when they contaminate hematopoietic cells:a potential purging method for autologous transplantation”blood 1998年7月15日；92(2)：672-82。
[0064]
在另一个实施方式中，自杀基因是在异环磷酰胺或环磷酰胺存在的情况下是具有毒性的细胞色素p450。参见，例如，touati等，“a suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response”curr gene ther.2014；14(3)：236-46。
[0065]
在另一个实施方式中，自杀基因是icas9。di stasi，(2011)“inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy”，n engl j med 365：1673-1683。还参见，morgan，“live and let die:a new suicide gene therapy moves to the clinic”molecular”molecular therapy(2012)；20：11-13。在小分子ap1903存在的情况下，icas9蛋白诱导凋亡。ap1903是生物学惰性的小分子，其已经在临床研究中表现出被良好耐受，并且已经在过继细胞治疗的情况下使用。
[0066]
fc受体
[0067]
fc受体结合到抗体的fc部分。多种fc受体是已知，并且根据其优选配体，亲和力，表达和结合到抗体后的效果而不同。
[0068]
表1.说明性的fc受体
[0069]
[0070]
[0071][0072]
在一些实施方式中，nk-92细胞被修饰以在细胞表面上表达fc受体蛋白。
[0073]
在一些实施方式中，fc受体是cd16。为了本公开的目的，cd16的特定氨基酸残基参考seq id no:2或相对于seq id no:2在一个位置上不同的seq id no:1命名。因此，当cd16多肽和seq id no:2最大程度地比对时，根据本发明的cd16多肽的“第158位”氨基酸残基是对应于seq id no:2(或seq id no:1)的第158位氨基酸残基。在一些实施方式中，nk-92细胞被修饰以表达在蛋白质的成熟形式的第158位具有苯丙氨酸的人cd16，例如seq id no:1。在典型的实施方式中，nk-92细胞被修饰以表达在蛋白质的成熟形式的第158位具有缬氨酸的人cd16的高亲和力形式，例如seq id no:2。成熟蛋白质的第158位对应于包含天然信号肽的cd16序列的第176位。在一些实施方式中，cd16多肽由编码seq id no:3或seq id no:4的前体(即具有天然信号肽)多肽序列的多核苷酸编码。
[0074]
在一些实施方式中，编码cd16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)天然存在的cd16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述全长天然存在的cd16在全长cd16的第176位(其对应于成熟cd16蛋白的第158位)具有苯丙氨酸。在一些实施方式中，编码cd16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)天然存在的cd16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述全长天然存在的cd16在第176位(其对应于成熟cd16蛋白的第158位)具有缬氨酸。在一些实施方式中，编码cd16的多核苷酸与seq id no:5具有至少70％的同一性，并且包含编码在编码全长(包含信号肽)cd16多肽的第176位的多核苷酸位置处的缬氨酸的密码子。在一些实施方式中，编码cd16的多核苷酸与seq id no:5具有至少90％的同一性，并且包含编码全长cd16的第176位的缬氨酸的密码子。在一些实施方式中，编码cd16的多核苷酸包含seq id no:5，但具有编码全长cd16的第176位的缬氨酸的密码子。
[0075]
在一些实施方式中，cd16多核苷酸编码与seq id no:1或seq id no:2具有至少70％，80％，90％或95％同一性的多肽。在一些实施方式中，多核苷酸编码与seq id no:2具有至少70％同一性或至少80％同一性，并且如参考seq id no:2确定的，包含第158位的缬氨酸的多肽。在一些实施方式中，多核苷酸编码与seq id no:2具有至少90％同一性，并且如参考seq id no:2确定的，包含第158位的缬氨酸的多肽。在一些实施方式中，多核苷酸编码与seq id no:2具有至少95％同一性，并且如参考seq id no:2确定的，包含第2位的缬氨酸的多肽。在一些实施方式中，多核苷酸编码seq id no:2。在一些实施方式中，cd16多核苷酸编码具有或不具有信号序列，或全长cd16的任何其它片段，或包含与另外的蛋白质的氨
基酸序列融合的cd16的至少部分序列的嵌合受体的cd16的细胞外结构域。在其他实施方式中，可以将表位标签肽(如flag，myc，多组氨酸或v5)加入到成熟多肽的氨基末端结构域中，以通过使用抗表位标签肽单克隆或多克隆抗体辅助细胞表面检测。
[0076]
在一些实施方式中，尽管具有多于700至800个多核苷酸的cd16变体在本公开的范围内，但同源cd16多核苷酸的长度可以为约150至约700，约750，或约800个多核苷酸。
[0077]
同源多核苷酸序列包含编码多肽序列的那些，所述多肽序列编码cd16的变体。同源多核苷酸序列还包括与seq id no:5相关的天然存在的等位基因变异。用编码具有seq id no:1或seq id no:2所示氨基酸序列，其天然存在的变体，或与seq id no:1或seq id no:2至少70％相同，或至少80％，90％或95％相同的序列的多肽的任何多核苷酸转染nk-92细胞是在本公开的范围内。在一些实施方式中，同源多核苷酸序列编码seq id no:1或seq id no:2中的保守氨基酸取代。在一些实施方式中，使用与天然多核苷酸序列不同，但编码相同多肽的简并同源cd16多核苷酸序列转染nk-92细胞。
[0078]
在其他实例中，使用具有改变cd16氨基酸序列的多态性的cdna序列，例如在cd16基因中显示遗传多态性的个体中的等位基因变化，修饰nk-92细胞。在其他实例中，使用来自具有不同于seq id no:5的序列的多核苷酸序列的其他物种的cd16基因修饰nk-92细胞。
[0079]
在实例中，使用本领域已知的方法制备变体多肽，例如寡核苷酸介导的(定点诱变)诱变，丙氨酸扫描和pcr诱变。可以在克隆的dna上进行定点诱变(carter，1986；zoller和smith，1987)，盒式诱变，限制性选择诱变(wells等，1985)或其他已知技术以产生cd16变体(ausubel，2002；sambrook和russell，2001)。
[0080]
在一些实施方式中，使编码cd16的多核苷酸突变以改变编码cd16的氨基酸序列而不改变cd16的功能。例如，可以在seq id no:1或seq id no:2中在“非必需”氨基酸残基处进行导致氨基酸取代的多核苷酸取代。
[0081]
seq id no:no：1或seq id no:2中的保守取代，借此一种类别的氨基酸被同一类别的另一氨基酸取代，落入所公开的cd16变体的范围内，只要该取代不实质上改变多肽活性。保守取代是本领域技术人员熟知的。影响(1)多肽骨架的结构，例如β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶点的侧链的体积的非保守取代可以修饰cd16多肽的功能或免疫学身份。非保守取代需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。取代可以被引入到保守取代位点或更优选被引入到非保守位点。
[0082]
在一些实施方式中，cd16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与seq id no:1或seq id no:2具有至少70％氨基酸序列同一性，或至少80％，或至少90％同一性。在一些实施方式中，cd16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与seq id no:1或seq id no:2具有至少70％氨基酸序列同一性，或至少80％，或至少90％同一性。在一些实施方式中，如参考seq id no:2确定的，cd16多肽变体在第158位具有缬氨酸。
[0083]
在一些实施方式中，编码cd16多肽的核酸可编码cd16融合蛋白。cd16融合多肽包括与非cd16多肽融合的cd16的任何部分或整个cd16。使用重组方法方便地产生融合多肽。例如，编码cd16多肽的多核苷酸(例如seq id no:1或seq id no:2)与编码非cd16的多核苷酸(例如编码异源蛋白质的信号肽的多核苷酸序列)框内(in-frame)融合。在一些实施方式中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与cd16的c端融合或被内部地设置在cd16中。通常，可以更换至多约30％的cd16细胞质结构域。这样的修饰可以增强表达或增强细胞毒性
(例如adcc响应性)。在其它实例中，嵌合蛋白(例如来自其它淋巴细胞激活受体(包括但不限于ig-a，ig-b，cd3-e，cd3-d，dap-12和dap-10)的结构域)替代cd16细胞质结构域的部分。
[0084]
融合基因可以通过常规技术合成，包括使用锚引物的自动化dna合成仪和pcr扩增，所述锚引物造成两个连续基因片段之间的互补突出端，其随后可以被退火并重新扩增以产生嵌合基因序列(ausubel，2002)。许多载体是可商购的，其促进将cd16框内亚克隆到融合部分。
[0085]
细胞因子
[0086]
nk-92细胞的细胞毒性取决于细胞因子(例如白细胞介素-2(il-2))的存在。使用外源性添加的、在商业规模培养中保持和扩增nk-92细胞所需要的il-2的成本是显著的。向人受试者以足以继续激活nk92细胞的量施用il-2将引起不良副作用。
[0087]
在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞被进一步修饰以表达至少一种细胞因子和自杀基因。在具体实施方式中，至少一种细胞因子是il-2，il-12，il-15，il-18，il-21或其变体。在优选的实施方式中，细胞因子是il-2。在某些实施方式中，il-2是靶向内质网的变体，并且自杀基因是icas9。
[0088]
在一个实施方式中，il-2与将il-2引导至内质网的信号序列一起表达。在一些实施方式中，编码il-2的多核苷酸编码具有seq id no:7序列的多肽。不受理论束缚，但是将il-2引导到内质网允许il-2以足以进行自分泌激活的水平表达，但不细胞外地释放il-2。参见konstantinidis等，“targeting il-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to nk-92 cells”exp hematol.2005年2月；33(2)：159-64。可以例如通过自杀基因的存在防止连续激活表达fcr的nk-92细胞。
[0089]
免疫治疗
[0090]
抗体可以用于靶向被感染或表达癌症相关标志物的细胞。许多抗体已经被批准用于单独治疗癌症。
[0091]
表2.说明性的治疗性单克隆抗体
[0092]
[0093]
[0094][0095]
抗体可以通过多种机制治疗癌症。当免疫细胞如nk细胞通过fc受体如cd16与结合到靶细胞的抗体结合时，发生抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)。
[0096]
因此，在一些实施方式中，表达cd16的nk-92细胞与针对特定癌症相关蛋白引导的抗体一起被施用于患者。
[0097]
施用表达fcr的nk-92细胞可以与施用单克隆抗体同时进行，或以顺序方式进行。使nk-92细胞表达fcr的遗传修饰能够使细胞识别被ab包被的靶细胞并触发nk细胞介导的adcc，从而导致快速nk细胞激活。在一些实施方式中，在已经用单克隆抗体治疗受试者之后，向受试者施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用单克隆抗体的24小时内，或在18小时内，或在12小时内，或在8小时内或在6，5，4，3，2或1小时内施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用抗体后24至72小时施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用抗体的1，2，3或4天或更长时间内施用表达fcr的nk-92细胞。
[0098]
在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞和单克隆抗体被静脉内施用。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞被直接输注到骨髓中。
[0099]
在本发明的一个方面，将表达fcr的nk-92细胞与治疗性单克隆抗体(例如阿仑单抗)组合施用于患有白血病的患者。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞与阿仑单抗被同时施用。在一些实施方式中，在已经用阿仑单抗治疗受试者后施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用阿伦单抗的24小时内，或在18小时内，或在12小时内，或在8小时内或在6，5，4，3，2或1小时内施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用阿仑单抗后24至72小时或更长时间施用表达fcr的nk-92细胞。
[0100]
在另一方面，将表达fcr的nk-92细胞与曲妥珠单抗组合施用于患有癌症(如乳腺癌或胃癌)的患者。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞与曲妥珠单抗被同时施用。在一些实施方式中，在曲妥珠单抗之后施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用
曲妥珠单抗的24小时内，或在18小时内，或在12小时内，或在8小时内或在6，5，4，3，2或1小时内施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用曲妥珠单抗后24至72小时或更长时间施用表达fcr的nk-92细胞。
[0101]
在另外的方面，将表达fcr的nk-92细胞与brentuximab组合施用于患有霍奇金淋巴瘤的患者。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞与brentuximab被同时施用。在一些实施方式中，在brentuximab之后施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用brentuximab的24小时内，或在18小时内，或在12小时内，或在8小时内或在6，5，4，3，2或1小时内施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用brentuximab后24至72小时或更长时间施用表达fcr的nk-92细胞。
[0102]
在另外的方面，将表达fcr的nk-92细胞与daratumumab组合施用于患有多发性骨髓瘤的患者。在一些实施方式中，表达fcr的nk-92细胞与daratumumab被同时施用。在一些实施方式中，在daratumumab之后施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用daratumumab的24小时内，或在18小时内，或在12小时内，或在8小时内或在6，5，4，3，2或1小时内施用表达fcr的nk-92细胞。在一些实施方式中，在施用daratumumab后24至72小时或更长时间施用表达fcr的nk-92细胞。
[0103]
转基因表达
[0104]
可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如cd16和il-2)工程化到表达质粒中。转基因可以被工程化到相同或不同的表达质粒中。在优选的实施方式中，转基因在相同质粒上表达。
[0105]
可以使用本领域已知的任何瞬时转染方法将转基因引入nk-92细胞，包括例如电穿孔，脂质转染，核转染或“基因枪”。
[0106]
可以使用任何数量的载体表达cd16和il-2。在一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，载体是质粒载体。可以使用的其他病毒载体包括腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体，痘病毒载体等。
[0107]
可以通过绝对数量的细胞向这样的个体施用nk-92细胞，例如，所述个体可以被施用约1000个细胞/注射到至多约100亿个细胞/注射，例如约，至少约，或最多约1
×
108，1
×
107，5
×
107，1
×
106，5
×
106，1
×
105，5
×
105，1
×
104，5
×
104，1
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103，5
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103(等等)个nk-92细胞/注射，或数字中的任何两个之间的任何范围，包括端点。在其它实施方式中，可以通过相对数量的细胞向这样的个体施用nk-92细胞，例如，所述个体可以被施用约1000个细胞到至多约100亿个细胞/千克个体，例如约，至少约，或最多约1
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108，1
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107，5
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107，1
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106，5
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106，1
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105，5
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105，1
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104，5
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104，1
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103，5
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103(等等)个nk-92细胞/千克个体，或数字中的任何两个之间的任何范围，包括端点。在一些实施方式中，向患者施用约10亿至约30亿个nk-92细胞。在其他实施方式中，可以基于体表面积的m2计算总剂量，包括11
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10
11
，1
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10
10
，1
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109，1
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108，1
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107/m2。一般人为1.6-1.8m2。
[0108]
如下所述的nk-92细胞，单克隆抗体和/或其它抗癌剂可以被施用于患有癌症或感染病毒的患者一次，或者可以被施用多次，例如治疗过程中每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或23小时一次，或每1，2，3，4，5，6或7天一次，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多周一次，或数字中的任何两个之间的任何范围，包括端点。
[0109]
实施例
[0110]
以下实施例仅用于说明目的，而不应被解释为所要求保护的本发明的限制。本领域技术人员可以使用各种替代技术和程序，其类似地允许本领域技术人员成功实施预期发明。
[0111]
实施例1：cd16重组逆转录病毒制备
[0112]
根据标准方法，使用bamhi和noti限制性位点，将编码跨膜免疫球蛋白γfc区受体iii-a(fcγriii-a或cd16)[苯丙氨酸-158(f158))，完整序列：swissprot p08637(seq id no:3)]的低亲和力成熟形式(seq id no:1)的cd16 cdna x52645.1或编码cd16受体的更高亲和力成熟形式[缬氨酸-158(f158v)(seq id no:2))，完整序列：swissprot var_008801(seq id no:4)]的多态性变体亚克隆到双顺反子逆转录病毒表达载体pbmn-ires-egfp(得自g.nolan，stanford university，stanford，calif.)。
[0113]
将重组载体与10μl的plus
tm
试剂(invitrogen；carlsbad，calif.)混合；用预加温的无血清(invitrogen；mem，最小必需培养基)稀释至100μl；通过将8μl lipofectamine
tm
(invitrogen)加入到100μl预加温的无血清中而进一步稀释；并在室温下温育15分钟。然后通过加入预加温的无血清使该混合物达到的总体积为1ml。使phoenix-amphotropic包装细胞(得自g.nolan，stanford university，stanford，calif.；(kinsella和nolan，1996))在6孔板中生长至70-80％汇合，并用6ml预加温的无血清培养基(invitrogen)洗涤。除去培养基后，向每个孔中加入1ml重组载体在lipofectamine
tm
plus
tm
试剂中的溶液，并将细胞在37℃，7％co2/平衡空气气氛下孵育至少3小时。将含有10％胎牛血清(fbs)的4ml预加温rpmi培养基加入到每个孔中，并将细胞在37℃，7％co2/平衡空气气氛下孵育过夜。然后除去培养基；用6ml预加温的无血清洗涤细胞；加入2ml无血清并将细胞在37℃，7％co2/平衡空气气氛下再孵育48小时。
[0114]
将含病毒的上清液收集到15ml塑料离心管中；以1300rpm离心5分钟以除去细胞和细胞碎片；并将上清液转移到另一个15ml塑料离心管中。使用前立即将20μl plus
tm
试剂加入病毒悬浮液中；将混合物在室温下温育15分钟；向混合物中加入8μl lipofectamine
tm
；并将混合物在室温下再温育15分钟。
[0115]
实施例2：将il-2基因和tk自杀基因克隆到cd16重组逆转录病毒中
[0116]
使用胸苷激酶(tk)基因和产生er-驻留性il-2的kdel标记的构建体(konstantinidis等，2005experimental hematology 33：159-64)制备重组逆转录病毒，其包含用于表达il-2并将相应的cdna连接到cd16 pbmn-ires-egfp载体中的基因(miah和campbell2010methods mol.biol.612：199-208)。然后将pbmn-ires-egfp载体在lipofectamine
tm
plus存在下转染到phoenix-amphotropic包装细胞系中。
[0117]
实施例3：将tk，cd16和il-2逆转录病毒转导到nk-92细胞中
[0118]
通过1300rpm离心5分钟收集在补充有12.5％fbs，12.5％胎马血清(fhs)和500iu rhil-2/ml(chiron；emeryville，calif.)的a-mem(sigma；st.louis，mo.)中培养的nk-92细胞。并将细胞沉淀重悬于10ml无血清培养基中。将含有5
×
104个细胞的细胞悬浮液的等分试样以1300rpm沉降5分钟；将细胞沉淀重悬于实施例1中所述的2ml逆转录
病毒悬浮液中，并将细胞接种到12孔培养板中。将板在1800rpm下离心30分钟，并在37℃，7％co2/平衡空气气氛下温育3小时。第二次重复这个离心和孵育循环。将细胞用8ml的α-mem稀释，转移到t-25烧瓶中，并在37℃，7％co2/平衡空气下孵育直至细胞汇合。收集转导的细胞，重悬于无血清培养基中，并使用荧光激活细胞分选仪(facs)基于其egfp表达水平分选，egfp与针对cd16的替代标志物共同表达。cd16的细胞表面表达通过用抗cd16抗体对转导的细胞进行免疫染色而证实。il-2的细胞表面表达通过用纯化的大鼠抗人il-2抗体进行免疫染色而测定，并且il-2细胞内定位通过用兔抗钙网蛋白er-marker进行免疫染色而证实。在使用前，分析转导的细胞(命名为nk-92-tk-cd16-il2)的cd16细胞表面表达和il-2细胞内表达。通过测试对gangcylovir的敏感性，分析细胞的tk表达。
[0119]
实施例4：在外源性il-2存在或不存在的情况下，nk-92-tk-cd16-il-2和未修饰的nk-92细胞的生长
[0120]
nk-92-tk-cd16-il-2和未修饰的nk-92细胞首先在外源性il-2(1,200iu/ml)存在的情况下培养4至5周，然后被转移到无il-2培养基，并在外源性il-2不存在的情况下培养。然后评估这些细胞的增殖。
[0121]
通过流式细胞术测量cd16和il-2的表面表达。nk-92-tk-cd16-il-2和未修饰的nk-92细胞在不存在外源性il-2的情况下孵育24小时后进行的流式细胞分析显示在nk-92-tk-cd16-il-2和未修饰的nk-92细胞中具有相似的细胞毒性作用，与未修饰的nk-92细胞相比，nk-92-tk-cd16-il-2细胞呈现增加的cd16表面表达和低得多的il-2表面表达。
[0122]
这些结果通过确定nk-92-tk-cd16-il-2细胞是否支持旁观者未修饰的nk-92细胞的生长的实验得以证实，其中未修饰的nk-92细胞与nk-92-tk-cd16-il-2混合且在外源性il-2不存在的情况下共培养。这些实验表明，nk-92-tk-cd16-il-2不支持未修饰的nk-92细胞的生长，因为il-2最小释放到培养基中。事实上，未修饰的nk-92细胞在在外源性il-2不存在的情况下孵育48小时后停止增殖。相比之下，nk-92-tk-cd16-il-2细胞的增殖在72小时孵育后仍然可见。
[0123]
总之，这些结果表明，当这些细胞被保持在不含外源性il-2的环境中时，er-il-2刺激nk-92-tk-cd16-il-2细胞的生长。
[0124]
实施例5：nk-92-tk-cd16-il-2细胞的全身性毒性和扩增被自杀基因有效地消除
[0125]
il-2的内源性表达可能导致具有自主生长的杀伤细胞突变体的潜在发展。因此，评估nk-92-tk-cd16-il-2细胞，nk-92-tk-cd16-il-2细胞和非修饰的nk-92细胞的体内扩增。scid小鼠被亚致死照射(250rad)并分成两组。15-20天后，当肿瘤可触及(直径0.5-0.8cm)时，将nk-92-tk-cd16-il-2细胞静脉内注射到第一组经照射的小鼠中，将未修饰的nk-92细胞静脉内注射到第二组小鼠中。没有向小鼠施用外源性细胞因子。用荧光激活细胞分选仪(facs)检测egfp表达，用于监测定位和扩增。两组小鼠在注射后24小时都显示出靶向定位和扩增。24小时后，对照小鼠组中的未修饰的nk-92细胞停止扩增，而nk-92-tk-cd16-il-2细胞继续显著扩增。注射后48小时，对照小鼠中未修饰的nk细胞的凋亡和小鼠测试组中nk-92-tk-cd16-il-2细胞的指数扩增都是可见的。在对照小鼠中，肿瘤快速达到直径等于或大于1.2cm的大小，并将小鼠安乐死。
[0126]
将来自具有较小肿瘤或完全肿瘤消退的测试组的小鼠隔离成两组以评估自杀基因的功能。每隔一天用两剂或三剂更昔洛韦(50μg)腹膜内治疗第一组中的小鼠。用安慰剂
治疗第二组的小鼠。将更昔洛韦施用于小鼠导致nk-92-tk-cd16-il-2细胞在24小时至72小时内显著降低，细胞恢复到预扩增水平。在用安慰剂治疗的小鼠中，nk-92-tk-cd16-il-2细胞的扩增随时间继续增加。
[0127]
这些结果表明，tk基因的存在确保nk-92-tk-cd16-il-2保持对更昔洛韦敏感，并阻止nk-92-tk-cd16-il-2细胞指数扩增。被引入到nk92细胞染色体中的在相同逆转录病毒载体上的tk和il-2的组合提供了增强的生物学安全性。因为细胞依赖于il-2，所以对于保留tk-cd16-il-2序列有着很强的选择。因此，细胞对更昔洛韦敏感。那些失去tk基因并且变得对更昔洛韦有抗性的细胞也会失去它们生长所必需的il-2基因。
[0128]
实施例6：nk-92-tk-cd16-il-2对不同白血病细胞系的细胞毒性活性
[0129]
nk-92-tk-cd16-il-2效应细胞通过悬浮在α-mem(不含il-2)中洗涤，并以1300rpm沉降5分钟。将细胞沉淀悬浮在α-mem中，计数细胞，并以1
×
105/ml(效应物与靶细胞的比率(e:t)＝1:1)，5
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105/ml(e:t＝5：1)，1
×
106/ml(e:t＝10:1)，2
×
106/ml(e:t＝20:1)或适合于进行的测定的细胞浓度制备等分试样。
[0130]
测定nk-92-tk-cd16-il-2效应细胞对k562，daudi，tf-1，aml-193和sr-91细胞的细胞毒性活性(gong等(1994))。k562(红白血病)和daudi(burkitt)淋巴瘤细胞系获自atcc。它们在补充有10％胎牛血清(fcs)的rpmi 1640培养基中保持连续悬浮培养。tf-1是需要存在含有2ng/ml人gm-csf的培养基的骨髓单核细胞系(kitamura等，j.cell physiol.140：323-334(1989))。aml-193是在10％5637条件培养基存在的情况下保持的骨髓细胞系(lange等，blood 70：192-199(1987))。tf-1和aml-193细胞均获自不列颠哥伦比亚省温哥华市不列颠哥伦比亚大学特里福克斯实验室d.hogge博士。sr-91是由gong等(1994)从急性淋巴细胞白血病(all)患者(klingemann等，leuk.lymphoma，12，463-470(1994))建立的具有早期祖细胞特征的细胞系。它对nk和活化nk(a-nk)细胞的细胞毒性均有抗性。sr-91也保存在rpmi 1640/10％fcs中，该细胞系可以通过用细胞因子治疗而使得对nk-92杀灭敏感。
[0131]
在标准的4小时51cr释放试验中一式三份地测量nk-92-tk-cd16-il-2效应细胞对这些靶细胞的细胞毒性活性。简言之，用100μl 51cr(比活度为1mci/ml)标记1
×
106个nk-92-tk-cd16-il-2细胞，并在37℃孵育1小时。使用台盼蓝染料排斥法计数效应细胞，并将其与靶细胞混合以获得10:1，3:1，1:1和0.3:1的效应物:靶比率。cellgro培养基用作阴性对照，而对于阳性对照，将细胞与1％triton x一起孵育。在v底部形状的96孔板中于37℃孵育4小时后，从各个孔吸取70μl上清液，并使用packard cobra auto-gamma 5000系列计数系统(meriden，ct，usa)计数。自发释放的百分比由以下公式计算：％特异性51cr释放＝(样品释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)
×
100。
[0132]
nk-92-tk-cd16-il-2细胞对k562和daudi细胞的细胞毒性活性明显高于未修饰的nk细胞-92的细胞毒性活性。nk-92-tk-cd16-il-2细胞对tf-1细胞和aml-193细胞的细胞溶解活性不太有效，但仍高于未修饰的nk-92细胞的细胞溶解活性。sr-91细胞对nk-92-tk-cd16-il-2细胞和未修饰的nk-92细胞的细胞毒性作用均具有抗性。这种对sr-91细胞的细胞毒性活性的缺乏与sr-91细胞中缺乏介导与nk-92细胞初始结合所必需的粘附分子一致。
[0133]
实施例7：nk-92-tk-cd16-il-2细胞对人原代白血病细胞的细胞溶解
[0134]
在患有新诊断的或复发性的白血病的患者的常规诊断性血液研究过程中或骨髓
(bm)抽吸物中，在知情同意的情况下，获得样品。富集母细胞(blast-enriched)的单核细胞通过ficoll hypaque(pharmacia，piscataway，n.j.)密度梯度分离而分离，并在rpmi 1640培养基中洗涤。将nk-92-tk-cd16-il-2细胞和未修饰的nk-92细胞培养并保持在补充有12.5％fcs和12.5％马血清的α-mem培养基中。然后使用标准的4小时铬释放试验，比较nk-92-tk-cd16-il-2细胞和未修饰的nk-92细胞对白血病样品的细胞毒性活性。
[0135]
nk-92-tk-cd16-il-2细胞对白血病靶标的细胞溶解活性明显高于未修饰的nk-92细胞。本发明的nk-92-tk-cd16-il-2细胞在裂解患者来源的肿瘤细胞方面令人惊奇地且显著地更有效，并且在比未修饰的nk-92细胞更短的时间内发挥其作用。
[0136]
实施例8：nk-92-tk-cd16-il-2细胞在人白血病异种移植scid小鼠模型中的抗白血病作用
[0137]
为了研究nk-92-tk-cd16-il-2细胞的体内杀肿瘤能力，将来自t谱系急性淋巴细胞性白血病(all)患者、急性骨髓性白血病(aml)患者和前b-all患者的白血病细胞通过s.c.接种在scid小鼠中过继生长和扩增。在这些实验中使用从小鼠中的白血病结节回收的白血病细胞(第一次传代)。对每个组中的scid小鼠i.p.接种在0.2ml pbs中来自第一次传代的5
×
106个白血病细胞，并在24小时后通过lp.注射施用0.4ml pbs中的2
×
107个nk-92-tk-cd16-il-2细胞。在具有和不具有外源性il-2的情况下，动物接受1剂或一系列5剂nk-92-tk-cd16-il-2细胞，其在第1，3，5，7和9天施用。
[0138]
所有人类白血病在scid小鼠中侵袭性地生长。来源于t-all患者、aml患者和前b-all患者的白血病细胞在体外对nk-92-tk-cd16-il-2细胞和未修饰的nk-92细胞高度敏感。
[0139]
与用未修饰的nk-92细胞治疗相比，用nk-92-tk-cd16-il-2细胞治疗显著延长小鼠寿命并延长存活。接受5剂nk-92-tk-cd16-il-2细胞注射的多只动物在接种后6个月存活，没有任何白血病发展迹象。用nk-92治疗的小鼠显示初步改善，但在6个月时在少数小鼠中观察到白血病细胞。
[0140]
这些结果表明，使用nk-92-cd16-il-2细胞体内治疗白血病肿瘤非常有效，并且导致寿命延长和健康改善。
[0141]
实施例9：adcc介导的细胞裂解
[0142]
作为高度选择性和有效的抗肿瘤剂的多种抗体的活性至少部分地依赖于天然杀伤细胞与抗体的fc(恒定)部分的结合，使得肿瘤细胞的裂解通过抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)机制发生。尽管nk-92细胞几乎保留了与nk细胞相关的几乎所有激活受体和细胞溶解通路，但它们不表达cd16受体，因此不可以通过adcc机制裂解靶细胞。如果细胞对有效抗体具有足够的结合亲和力，则将cd16表达转基因地插入到nk-92细胞中允许nk-92细胞通过adcc机制起作用。
[0143]
在被施用于患有白血病的受试者的表达fcr的nk-92细胞中，在已经用阿伦单抗治疗所述受试者后24至72小时，评价结合不同抗体的效果。将表达fcr的nk-92细胞和结合靶癌细胞的抗体的细胞毒性作用与未修饰的nk-92细胞的细胞毒性作用进行比较。根据表2选择和分析抗体和相应的靶癌细胞。
[0144]
所选择的靶细胞用na[
51
cr]铬酸盐标记。将
51
[cr]标记的靶细胞的等分试样与选定的抗体在0.01μg和5μg/ml之间的多种浓度下在室温下进一步孵育15分钟，用α-mem洗涤，并在使用前调节至1
×
105个细胞/ml浓度。将细胞浓度为1
×
105个细胞/ml(e:t＝1：1)，5
×
105个细胞/ml(e:t＝5:1)的100μl选定类型的靶细胞和100μl效应细胞，1)，1
×
106个细胞/ml(e:t＝10:1)，2
×
106个细胞/ml(e:t＝20:1)或适合于进行的测定的100μl选定类型的靶细胞和100μl效应细胞加入到96孔v底部板的每个孔中。在每个e:t比率下制备三至六个重复孔以进行评估。将至少6个孔分配给每个自发裂解对照(效应细胞用100μl的α-mem替代)和总释放控制(效应细胞用100μl在α-mem中的2％triton x-100洗涤剂替代)。将每个e:t比率的另外三个孔分配给“非adcc”对照，其中靶细胞不暴露于抗体。将另外6个或更多个孔分配给使用不表达cd16的未修饰的nk-92效应细胞作为程序控制和内标。然后将板在500rpm离心3分钟，并在37℃，7％co2/平衡空气气氛下孵育4小时。在孵育期结束时，将板在1500rpm下离心8分钟，并从每个孔中收集100ml上清液以在γ计数器中计数，作为由于细胞毒性而导致的
51
[cr]释放的量度。然后计算特异性裂解的百分数。
[0145]
用表达不同表面水平的cd16的表达fcr的nk-92细胞重复这些试验。
[0146]
在选定抗体存在的情况下，表达fcr的nk-92细胞显示出对靶癌细胞的高细胞毒性活性。未修饰的nk-92细胞显示出对靶癌细胞的较低细胞毒活性。这些结果证实，表达fcr的nk-92细胞具有通过adcc机制起作用的能力，并因此在抗体存在的情况下提供对肿瘤细胞的增强的治疗作用。
[0147]
实施例10：表达fcr的nk-92细胞和吉妥珠单抗在人白血病异种移植scid小鼠模型中的组合抗白血病效应
[0148]
为了研究表达fcr的nk-92细胞的体内杀肿瘤能力，将来自急性骨髓性白血病(aml)患者的白血病细胞通过s.c.接种在scid小鼠中过继生长并扩增。在这些实验中使用从小鼠中的白血病结节回收的白血病细胞(第一次传代)。对每组中的scid小鼠i.p.接种在0.2ml pbs中来自第一次传代的5
×
106个白血病细胞，并在24小时后通过lp.注射施用在0.4ml pbs和吉妥珠单抗中的2
×
107个fcr表达的nk-92细胞。在具有或不具有吉妥珠单抗的情况下，动物接受1剂或一系列5剂表达fcr的nk-92细胞，其在第1，3，5，7和9天施用。在具有或不具有吉妥珠单抗的情况下，对照动物用未修饰的nk-92细胞治疗。
[0149]
人白血病在scid小鼠中侵袭性地生长。用表达fcr的nk-92细胞与吉妥珠单抗联合治疗的小鼠显示肿瘤消退，并且抗肿瘤作用比在不具有吉妥珠单抗的情况下仅使用表达fcr的nk-92细胞治疗的小鼠更高，而且比用nk-92治疗的小鼠更高。
[0150]
这些结果表明，用表达fcr的nk-92细胞与单克隆抗体(例如吉妥珠单抗)组合体内治疗白血病肿瘤非常有效，并且导致寿命延长和健康改善。
[0151]
实施例11：表达cd16和内质网靶向性il-2的质粒表达载体的构建
[0152]
使用geneart(life technologies)的gene string程序从头设计质粒骨架。其最小结构包括cole1细菌复制起点，氨苄青霉素抗性盒和由位于多克隆位点(mcs)侧翼的ef1α启动子和sv40聚腺苷酸化位点组成的哺乳动物表达盒。
[0153]
哺乳动物表达盒的侧翼是bamhi位点，其不仅允许质粒的线性化，而且还允许去除所有非真核生物序列。
[0154]
所表达的转基因是人cd16 158v序列，随后是ires序列本身，随后是eril-2序列(il-2kdel)，使得il-2靶向内质网。通过geneart对cd16和eril-2序列二者进行密码子优化，以使在人中的表达最大化。可以使用ecori和noti切除转基因。所得mrna是在ef1α启动子控制下的双顺反子转录物，eril-2在ires序列的控制下独立地从cd16翻译。图1中提供了
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[0178]
seq id no:7：il-2-er
[0179]
met tyr arg met gln leu leu ser cys ile ala leu ser leu ala leu val thr asn ser ala pro thr ser ser ser thr lys lys thr gln leu gln leu glu his leu leu leu asp leu gln met ile leu asn gly ile asn asn tyr lys asn pro lys leu thr arg met leu thr phe lys phe tyr met pro lys lys ala thr glu leu lys his leu gln cys leu glu glu glu leu lys pro leu glu glu val leu asn leu ala gln ser lys asn phe his leu arg pro arg asp leu ile ser asn ile asn val ile val leu glu leu lys gly ser glu thr thr phe met cys glu tyr ala asp glu thr ala thr ile val glu phe leu asn arg trp ile thr phe cys gln ser ile ile ser thr leu thr gly ser glu lys asp glu leu