一种帕罗韦德起始物料及其对映异构体手性纯度的HPLC检测方法与流程

一种帕罗韦德起始物料及其对映异构体手性纯度的hplc检测方法
技术领域
1.本发明属于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，hplc）方法，尤其是一种用hplc检测帕罗韦德起始物料与其对映异构体分离的方法。


背景技术：

2.帕罗韦德临床用于治疗新型冠状病毒肺炎（covid-19），在其制备过程中的一种起始物料结构式为，其分子式为c9h
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no2.hcl，化学名称为methyl(1r,2s,5s)-6,6-dimethyl-3-azabicyclo[3.1.0]hexane-2-carboxylate-hydrochloride，该起始物料的分子中含三个手性碳原子，在通过定向合成目标化合物帕罗韦德的过程中需要控制该起始物料与其对映异构体的含量。
[0003]
该起始物料的合成是定向合成目标化合物帕罗韦德的过程中非常关键的一步，且其手性纯度是控制该起始物料质量的一项重要指标，因此，实现该起始物料及其对映异构体的分离对帕罗韦德药物的合成过程中的质量控制有重要意义。
[0004]
截止目前为止，市场上已有分离该异构体的方法，但是该方法在重现的过程中，发现方法耐用性极差，完全无法重现；或者涉及的gc手性色谱柱非国内现货，到货期长达6个月之久，严重影响效率。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种分离帕罗韦德起始物料与其对映异构体的hplc检测方法，用于测定帕罗韦德起始物料的手性纯度ee%值。
[0006]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种帕罗韦德起始物料及其对映异构体手性纯度的hplc检测方法，检测条件为色谱柱：daicel chiralcel od-h，4.6*250mm，5μm手性柱，柱温为20℃；流动相：异丙醇：正己烷=15：85(v/v)，分离度最佳，流速为1.0 ml/min；洗脱程序：15%异丙醇等度洗脱10～15min；检测波长：210nm；包括以下步骤（1），取帕罗韦德起始物料适量，用异丙醇溶解样品，配制成每1ml异丙醇含帕罗韦德起始物料约3mg的样品溶液；（2），取步骤（1）的样品溶液按照进样体积5μl注入液相色谱仪，完成帕罗韦德起始物料及其对映异构体的分离，进行检测记录色谱图，从而检测手性纯度ee%值。
[0007]
进一步，所述的色谱柱为涂敷型多糖衍生物手性柱。
[0008]
更进一步，色谱柱是固定相表面涂敷了纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的球形硅胶的色谱柱。
[0009]
进一步，所述的等度洗脱比例选用异丙醇：。
[0010]
进一步，所述的液相色谱仪为thermo ultimate 3000，dad检测器。
[0011]
本发明的有益效果是：本发明采用daicel chiralcel od-h，4.6*250mm，5μm手性柱，不仅提高了色谱峰的对称性，而且能有效分离帕罗韦德起始物料及其对映异构体；柱温选择20℃，缩短了分析时间。
[0012]
本发明选择异丙醇溶解样品，能有效避免样品溶液在高比例的非极性流动相正己烷中析出的可能性。
[0013]
本发明进样体积5μl，该体积可根据样品浓度大小适当调整，流速选择1.0ml/min，有效的节省了分析时间及试剂的消耗。
[0014]
本发明方法能简单、快速、准确的测定帕罗韦德起始物料的手性纯度ee%值，解决了帕罗韦德起始物料及其对映异构体的分离问题，从而保证了帕罗韦德起始物料化学纯度ee%值的准确可靠性。
附图说明
[0015]
图1为本发明对比例1的chiralcel ig洗脱hplc图；图2为本发明对比例2的chiralcel od-h洗脱hplc图；图3为本发明对比例3的chiralcel od-h洗脱hplc图。
具体实施方式
[0016]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0017]
申请人发现，以涂敷型多糖衍生物手性柱，正己烷/异丙醇作为流动相体系，等度洗脱，可以将帕罗韦德起始物料及其对映异构体进行有效分离，从而可以准确测定帕罗韦德起始物料的手性纯度ee%值。
[0018]
本发明hplc检测方法，可按照以下方法实现：（1）取帕罗韦德起始物料消旋体适量，用异丙醇溶解，配制成每1ml异丙醇含帕罗韦德起始物料约3mg的样品溶液。
[0019]
（2）设置流动相流速为1.0 ml/min，检测波长210nm，色谱柱柱温20℃。
[0020]
（3）取（1）的样品溶液5μl注入液相色谱仪，完成帕罗韦德起始物料及其对映异构体的分离，从而检测手性纯度ee%值。
[0021]
其中检测条件为：高效液相色谱仪：thermo ultimate 3000，dad检测器；色谱柱：daicel chiralcel od-h，4.6*250mm，5μm手性柱；流动相：正己烷（通道一）、异丙醇（通道二）；洗脱程序：15%异丙醇，洗脱15min；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样体积：5μl。
[0022]
本发明采用常用的od-h色谱柱和常用的中性试剂实现分离，且配制方法简单易操
作，使得该起始物料的手性质量控制的效率显著提高。
[0023]
对比例1仪器与条件：高效液相色谱仪：thermo ultimate 3000，dad检测器；色谱柱：daicel chiralcel ig，4.6*250mm，5μm手性柱；流动相：正己烷（通道一）、异丙醇（通道二）；洗脱程序：15%异丙醇，洗脱15min；检测波长：全扫；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样体积：5μl。
[0024]
实验步骤：取定向合成的帕罗韦德起始物料的消旋体30mg，置于10ml容量瓶中，加异丙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为方法开发用的样品溶液。
[0025]
取上述样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1，图1中1号峰为帕罗韦德起始物料，2号峰为其对映异构体峰，从图中可看出，该条件下，帕罗韦德起始物料与其对映异构体不能有效分离，且有拖尾现象。
[0026]
对比例2仪器与条件：高效液相色谱仪：thermo ultimate 3000，dad检测器；色谱柱：daicel chiralcel od-h，4.6*250mm，5μm手性柱；流动相：正己烷（通道一）、异丙醇（通道二）；洗脱程序：20%异丙醇，洗脱15min；检测波长：全扫；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样体积：5μl。
[0027]
实验步骤：取定向合成的帕罗韦德起始物料的消旋体30mg，置于10ml容量瓶中，加异丙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为方法开发用的样品溶液。
[0028]
取上述样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图2，图2中1号峰为帕罗韦德起始物料，2号峰为其对映异构体峰，从图中可看出，该条件下，帕罗韦德起始物料与其对映异构体分离度明显改善，但2号峰有包峰。
[0029]
对比例3仪器与条件：高效液相色谱仪：thermo ultimate 3000，dad检测器；色谱柱：daicel chiralcel od-h，4.6*250mm，5μm手性柱；流动相：正己烷（通道一）、异丙醇（通道二）；洗脱程序：15%异丙醇，洗脱15min；
检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样体积：5μl。
[0030]
实验步骤：取定向合成的帕罗韦德起始物料的消旋体30mg，置于10ml容量瓶中，加异丙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为方法开发用的样品溶液。
[0031]
取上述样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3，图3中1号峰为帕罗韦德起始物料，2号峰为其对映异构体峰，从图中可看出，该条件下，帕罗韦德起始物料与其对映异构体完全分离，2号峰所包色谱峰也被洗脱出，使对映异构体含量检出更准确。帕罗韦德起始物料主峰在4.5min左右。
[0032]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。