一种检测极酸性pH的方法及试剂盒与流程

一种检测极酸性ph的方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物荧光分析技术领域，具体涉及一种检测极酸性ph的方法及试剂盒。


背景技术：

2.质子，作为一个熟悉的阳离子，在生物学中起着关键作用。ph的波动对许多细胞事件都有明显的影响，例如细胞代谢、生长、信号转导、趋化性、细胞凋亡和自噬。尽管大多数生物无法在强酸性环境下生存，仍然存在相当数量幽门螺杆菌和“嗜酸菌”等微生物。如肠病原体，它通过高度酸性的哺乳动物胃部可以达到肠道，引起疾病感染。哺乳动物有些部位的ph值很低，例如胃液，ph值会显著影响其生理过程。由于缺乏有效的方法来检测这种情况下的酸性ph，这些细胞中的精确ph值仍然难以确定。但是，监测活细胞内部ph变化对于探索细胞功能和了解生理病理过程至关重要。
3.荧光成像由于具有高分辨率、高灵敏度和实时成像的特点常用于生物医学研究。大多数已知的ph荧光指示剂都属于两个类别。一种检测的ph范围为6-8，属于中性范围。另一种检测的ph范围为4-6，属于弱酸性范围。但是很少有适用于ph值低于1的更为酸性条件的荧光指示剂。
4.传统的可见光、近红外一区(700-900nm，称为nir-1)区域能够获得ph值为4-6的弱酸性环境下的图像。目前检测ph范围为4-6的弱酸性环境的荧光方法有紫外光、可见光和近红外一区荧光检测方法，但是这些方法存在诸多限制，比如酸性响应度差、荧光信号发射波长短、穿透深度差、自发荧光强、散射率高以及信噪比低等。在近红外二区(900-1700nm，称为nir-ii)区域的波长范围内可以获得较高的成像分辨率，进一步提高成像的穿透深度、灵敏度和分辨率，然而，目前仍缺乏检测ph值小于1的极酸性ph的近红外二区荧光方法。因此，开发具有极酸性响应灵敏、穿透深度大、自发荧光低、散射弱且信噪比高的近红外二区检测方法具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种能够检测ph值小于1的近红外二区荧光方法及试剂盒，与紫外光、可见光、近红外一区等荧光检测极酸性方法比较，本发明的方法具有极酸性响应灵敏、穿透深度大、自发荧光低、散射弱且信噪比高等优势。
6.本发明提供一种检测极酸性ph的方法，包括如下步骤：
7.s1：配制一种吩噻嗪盐溶液，所述吩噻嗪盐的化学结构式如式(ⅰ)所示：
8.9.s2：将s1中所述吩噻嗪盐溶液与待测体系混合；
10.s3：通过检测待测体系的荧光强度得到ph值。
11.进一步的，式(ⅰ)中r1和r2均为-ch3，所述吩噻嗪盐为亚甲基蓝，其化学结构式如式(ⅱ)所示：
[0012][0013]
进一步的，式(ⅰ)中r1和r2均为-h，所述吩噻嗪盐为azure a，其化学结构式如式(ⅲ)所示：
[0014][0015]
进一步的，式(ⅰ)中r1和r2分别为-ch3和-h，所述吩噻嗪盐为azure b，其化学结构式如式(ⅳ)所示：
[0016][0017]
azure a和azure b为亚甲基蓝的类似物，支链上的替代基团略有不同，所以具有与亚甲基蓝相似和的性质和功能。
[0018]
进一步的，步骤s1中所述吩噻嗪盐溶液的浓度为50-500μg/ml。溶液的浓度取决于荧光检测仪器的配置，灵敏度高的仪器可以用低浓度的溶液，如50μg/ml；反之，灵敏度低的仪器就需要高浓度的溶液，如500μg/ml。
[0019]
本发明还提供一种检测极酸性ph的试剂盒，所述试剂盒中包括一种吩噻嗪盐和溶剂，所述吩噻嗪盐的化学结构式如式(ⅰ)所示：
[0020][0021]
进一步的，式(ⅰ)中r1和r2均为-ch3，所述吩噻嗪盐为亚甲基蓝。
[0022]
进一步的，式(ⅰ)中r1和r2均为-h，所述吩噻嗪盐为azure a。
[0023]
进一步的，式(ⅰ)中r1和r2分别为-ch3和-h，所述吩噻嗪盐为azure b。
[0024]
进一步的，所述溶剂为水、二甲亚砜(dmso)，乙醇、四氢呋喃(thf)中的任意一种。它们都能够溶解所述吩噻嗪盐。如果用在体内检测，用水溶解最无毒无害。
[0025]
本发明还提供所述的试剂盒在极酸性ph检测上的应用。
[0026]
进一步的，所述极酸性的酸性范围为ph小于1。
[0027]
本发明还提供所述的试剂盒在生物标记中的应用。
[0028]
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
[0029]
1.本发明的方法和试剂盒适用于ph值低于1的极酸性条件。
[0030]
2.本发明的方法和试剂盒极酸性响应灵敏。
[0031]
3.本发明的方法荧光信号发射波长长、穿透深度大，不需切片即可观察。
[0032]
4.本发明的方法自发荧光低、散射弱且信噪比高。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0034]
图1为本发明实施例1中亚甲基蓝(mb)形成质子化亚甲基蓝(mbh)的过程示意图；
[0035]
图2为本发明实施例1中mbh在不同酸性条件下的近红外二区荧光发射光谱；
[0036]
图3为本发明实施例2中azure a和azure b在酸性条件的近红外二区荧光发射光谱；
[0037]
图4为本发明实施例5中mb用于检测胃酸分泌过多的近红外二区荧光成像图。
具体实施方式
[0038]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0039]
本发明公开了一种吩噻嗪盐，其在ph值小于1的情况下具有近红外二区荧光发射性质，所述吩噻嗪盐的结构通式如下：
[0040]
具有所述结构通式的物质具有相似的理化性质。
[0041]
式中r1和r2可以分别独立选自-ch3和-h中的任意一种。
[0042]
其中，r1和r2均为-ch3，所述吩噻嗪盐为亚甲基蓝；
[0043]
或者r1和r2均为-h，所述吩噻嗪盐为azure a；
[0044]
或者r1和r2分别为-ch3和-h，所述吩噻嗪盐为azure b。
[0045]
本发明公开了一种质子化亚甲基蓝(mbh)具有发射近红外二区荧光的性质，mbh是
亚甲基蓝(mb)在极性酸条件下生成的一种化合物，目前对mbh的研究很少，只报道过mbh在波长664nm和748nm处有两个吸收峰，没有报道过它有其他应用。mbh可以通过亚甲基蓝(mb)在强酸性条件下生成，即ph值小于1(0.1m h

)的条件，其反应环境h

浓度越大，酸性越强，mbh生成量越多，其发射近红外二区荧光信号越强，因而mbh具有强酸性响应特性。
[0046]
此外，本发明还公开了mb类似物azure a(cas号：531-53-3，cas名称：3-amino-7-(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride)和azure b(cas号：531-55-5，cas名称：3-(dimethylamino)-7-(methylamino)phenothiazin-5-ium chloride)在ph值小于1的情况下也具有近红外二区荧光发射性质，azure a和azure b在酸性条件下与h

结合发生质子化，环境酸性越强，其近红外二区荧光信号越强。
[0047]
因此，可以基于所述质子化的吩噻嗪盐，如mbh、azure a和azure b的近红外二区荧光信号变化检测ph值小于1的酸性情况。
[0048]
实施例1质子化亚甲基蓝(mbh)在不同酸性条件下的近红外二区荧光发射光谱
[0049]
首先利用盐酸配置氢离子浓度从10-7
m到6m的系列溶液，然后加入50μg/ml mb，会立刻生成mbh，其反应过程如图1所示。在808nm波长下激发，测定其近红外二区荧光发射光谱。图2显示的是mbh在不同酸性条件下的近红外二区荧光发射光谱，图2a中横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，图2b中横坐标为氢离子浓度，纵坐标为荧光强度。图2a中显示mbh在不同酸性条件下的近红外二区荧光发射波长约为950nm，在近红外二区900-1700nm的波长范围内，这与现有技术中发射光谱在近红外一区的荧光探针大有不同。荧光信号发射波长长就具有更大的穿透深度，从而实现荧光信号强、自发荧光低、散射弱且信噪比高的效果。此外图2a中还显示随着氢离子浓度的升高，酸性越强，mbh发射近红外二区的荧光越强。图2b表明mbh具有酸性响应的ph值为1(h

浓度为10-1
m)，以这个ph值为节点，酸性越强，荧光的强度越高，说明mbh适用于ph值小于1的极酸性环境。图2b的图可作为mbh的标准曲线，通过检测荧光强度的大小即可在图中对应得出氢离子的浓度，从而换算出ph值的大小。
[0050]
实施例2azure a和azure b也具有极酸性响应的近红外二区荧光发射性质
[0051]
本发明还发现mb类似物azure a(cas号：531-53-3，cas名称：3-amino-7-(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride)和azure b(cas号：531-55-5，cas名称：3-(dimethylamino)-7-(methylamino)phenothiazin-5-iumchloride)，它们在ph值小于1的环境中也具有近红外二区荧光发射性质，如图3所示，图3a和3b分别为azure a和azure b的结构式，图3c和图3d分别为azure a和azure b在酸性条件的近红外二区荧光发射光谱，图3e和图3f分别为azure a和azure b在不同氢离子浓度下的荧光强度。图3c和图3d中横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，图3e和图3f中横坐标为氢离子浓度，纵坐标为荧光强度。图3c和图3d显示azure a和azure b在不同酸性条件下的近红外二区荧光发射波长均为950nm左右，在近红外二区900-1700nm的波长范围内，这与现有技术中发射光谱在近红外一区的荧光探针大有不同，荧光信号发射波长长就具有更大的穿透深度，从而实现荧光信号强、自发荧光低、散射弱且信噪比高的效果。此外，azure a和azure b所处的环境中氢离子浓度越高，酸性越强，其近红外二区荧光信号越强。图3e和图3f表明azure a和azure b具有酸性响应的ph值为1(h

浓度为10-1
m)，以这个ph值为节点，酸性越强，荧光的强度越高，说明azure a和azure b与mbh的效果相似，适用于ph值小于1的极酸性环境。图3e和图3f可分别作为azure a和azure b的标准曲线，通过检测荧光强度的大小即可在图中对应得出氢离子的浓
度，从而换算出ph值的大小。
[0052]
实施例3本发明的试剂盒用于检测体外体系ph值的方法
[0053]
先用试剂盒中的溶剂(可以是水、二甲亚砜、乙醇、四氢呋喃中的任一种)溶解试剂盒中的吩噻嗪盐(可以是亚甲基蓝、azure a和azure b中的任意一种)，配置成50-500μg/ml的吩噻嗪盐水溶液。将所述水溶液与待检测体系混合，混合后保持吩噻嗪盐的最终浓度为50μg/ml，1分钟后，将混合体系装入荧光皿中，用爱丁堡fls920荧光光谱仪检测荧光光谱，使用的激发波长为808nm，在900-1700nm波段收集荧光信号，通过荧光信号的强度对照标准曲线(亚甲基蓝的标准曲线为图2b，azure a的标准曲线为图3e，azure b的标准曲线为图3f)即可得出待测体系的ph值。
[0054]
实施例4本发明的试剂盒用于检测体内ph值的方法
[0055]
先用试剂盒中的溶剂(可以是水、二甲亚砜、乙醇、四氢呋喃中的任一种)溶解试剂盒中的吩噻嗪盐(可以是亚甲基蓝、azure a和azure b中的任意一种)，配置成50-500μg/ml的吩噻嗪盐水溶液。将所述水溶液灌注到动物体内(如灌胃)，1分钟后，用近红外二区小动物成像仪器检测荧光光谱，使用的激发波长为808nm，在滤光片为900-1700nm波段收集荧光信号，通过荧光信号的强度对照标准曲线(亚甲基蓝的标准曲线为图2b，azure a的标准曲线为图3e，azure b的标准曲线为图3f)即可得出待测体系的ph值。实施例5本发明的试剂盒用于动物体内极酸性环境检测的应用实例
[0056]
有一种胃病由于胃酸分泌过多而引起，患者会感到胃部不适，出现胃部灼烧感、吞酸、反胃、吐酸水等现象。正常胃液呈酸性，ph值为1.3-1.8，当胃酸分泌增多时，胃液ph值小于1。亚甲基蓝(mb)可以在ph值小于1的条件下生成mbh，基于mbh的近红外二区荧光信号检测胃酸分泌过多的情况。将一只裸鼠麻醉后，小鼠左侧躺姿拍照，作为空白对照，图4中blank表示的图片即为空白对照。随后用试剂盒中的亚甲基蓝粉末加入溶剂水配制成100μl亚甲基蓝浓度为500μg/ml的水溶液，然后用灌胃针，往小鼠胃中灌入100μl上述水溶液，1分钟后，放在小动物成像仪器中拍照，使用的激发波长为808nm，在滤光片为900-1700nm波段收集荧光信号，结果为图4中mb组的照片。然后用100μl 1m的hcl(ph为0)溶液给小鼠灌胃1分钟后再放在小动物成像仪器中拍照，结果为图4中ph0组的照片。最后用100μl 1m nahco3小苏打给小鼠灌胃后置于小动物成像仪器中拍照，结果为图4中nahco3组的照片。以上结果显示，首先用mb溶液灌胃没有荧光信号发出，因为小鼠此时胃酸时正常分泌，随后用100μl 1m hcl溶液灌胃制造小鼠胃酸分泌过多模型，此时小鼠胃部出现近红外二区荧光信号，且信号清晰强度高，无其他自发荧光信号干扰，图中荧光信号为白色区域所示。最后用100μl 1m nahco3溶液灌胃中和小鼠胃中分泌过多的酸，小鼠胃部的近红外二区荧光信号再次消失，表明此时小鼠胃酸分泌恢复正常。以上实验结果表明利用mbh的近红外二区荧光信号变化可以检测胃酸分泌过多情况，故可以用于生物标记。胃酸分泌的环境ph值极其低，本发明的mbh探针能够在极酸性环境下发出清晰的荧光信号，无须切片，可以直接使用动物活体观察，穿透深度大，且没有自发荧光的干扰，散射弱且信噪比高。
[0057]
综上，本发明的吩噻嗪盐(包括mbh及mb的类似物azure a和azure b)具有强酸性响应特性，反应环境中h

浓度越大，酸性越强，其发射近红外二区荧光信号越强，与紫外光、可见光、近红外一区等荧光检测极酸性方法比较，具有极酸性响应灵敏、穿透深度大、自发荧光低、散射弱且信噪比高等优势，可用于ph值小于1的极度酸性环境中生物样品ph变化的
检测，可用于生物体内ph值的检测。
[0058]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。