治疗癌症的联合疗法的制作方法

1.本发明涉及使用如本文所述的式(i)化合物和变构抑制剂或免疫检查点分子对癌症患者的一种或多种联合治疗。


背景技术：

2.慢性粒细胞白血病(cml)是一种罕见的血液系统恶性肿瘤，年发病率约为1.9例/100,000。bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂(tki)显著改善了cml的临床管理。然而，尽管第一代bcr-abl tki伊马替尼和几种第二代tki提供了临床益处，但仍有许多患者产生耐药性。这种对tki的获得性耐药是cml治疗的主要挑战。bcr-abl激酶突变是获得性耐药的关键机制，t315i是最常见的耐药突变，发生在约25％的耐药cml患者中。t315i突变患者对第一代和第二代bcr-abl抑制剂均具有耐药性。因此，持续需要更有效的新疗法和治疗。本发明的方法为癌症患者提供了新的选择。
3.hqp-1351是一种新型的、口服有效的第三代bcr-abl抑制剂，旨在有效靶向bcr-abl突变体，包括t315i，用于治疗对第一代和第二代tki耐药的cml病人。


技术实现要素：

4.一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者共同给药：
5.a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐；和
6.b)变构抑制剂；
7.其中式(i)具有以下结构：
[0008][0009]
其中：
[0010]
r1是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-4
烷氧基或是苯基；和
[0011]
r2是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基或是卤素。
[0012]
在另一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者共同给药：
[0013]
a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐；和
[0014]
b)免疫检查点分子。
[0015]
在一个实施例中，式(i)化合物是具有以下结构的hqp-1351：
[0016][0017]
在一个实施例中，变构抑制剂是asciminib。
[0018]
在一个实施例中，免疫检查点分子是pd-1或pd-ll。
附图说明
[0019]
图1a和1b说明hqp-1351、ponatinib abl001在baf3(bcr-abl、t315i/f317l)细胞wst测定研究中的结果。
[0020]
图2a-2d说明了hqp-1351、ponatinib abl001在baf3(bcr-abl、t315i/y253)细胞研究中的结果。
[0021]
图3a和3b说明ponatinib、hqp-1351 abl001在baf3(bcr-abl、e255v/t315i)细胞wst测定研究中的结果。
[0022]
图4a和4b说明ponatinib、hqp-1351 abl001在baf3(bcr-abl,e255k/t315i)细胞研究中的结果。
[0023]
图5说明wb-tz-04-2020-hqp-1351、ponatinib abl001在baf3 bcr-abl-t315i细胞研究结果。
[0024]
图6说明baf3 bcr-abl-e255v/t315i细胞系-20201110-1111研究结果中的wb-tz-04-2020-hqp-1351、ponatinib abl001。
[0025]
图7a和7b说明hqp-1351、ponatinib abl001在baf3 bcr-abl-e255v/t315i细胞系-20201111-1113中诱导细胞凋亡的研究结果。
[0026]
图8a和8b说明在t315i原位肿瘤模型中当hqp-1351与abl001组合时的优异效果。
[0027]
图9a和9b说明在y253h/t315i原位肿瘤模型中当hqp-1351与abl001组合时的优异效果。
[0028]
图10a和10b说明hqp-1351和abl001在f317l/t315i原位肿瘤模型中的优异功效。
[0029]
图11a和11b说明了hqp-1351和abl001在e255v/t315i原位肿瘤模型中的比较功效。
[0030]
图12a-c说明hqp-1351在体外增强抗pd-1功效。
[0031]
图13a-f说明hqp-1351在体内增强抗pd-ll功效。.
[0032]
图14a-f说明hqp-1351以剂量和时间依赖性方式抑制p-src和pd-ll表达。
[0033]
图15显示了用hqp1351处理72小时的sup-b15细胞的细胞活力曲线。
[0034]
图16显示了hqp1351在费城染色体阳性(ph 或bcr-abl1 )和阴性(ph-或bcr-abl1-)白血病细胞系中的抗增殖ic
50
值。
具体实施方式
[0035]
在此引用的所有已发表的文件通过引用整体并入本文。.
[0036]
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0037]
术语“大约”在本文中用于表示大约、在该范围内、大致或大约。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展规定数值之上和之下的边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于将高于和低于规定值的数值修改为10％。
[0038]
术语“包括”是指“包括但不限于”。
[0039]
术语“治疗(treatment,)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制其进展，包括但不限于治疗益处。在一些实施方案中，治疗在一种或多种症状出现后进行。在一些实施方案中，治疗可以在没有症状的情况下进行。例如，可以在症状出现之前对受试者进行治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传或其他易感因素)。症状消失后也可以继续治疗，例如预防或延迟复发。
[0040]
术语“abl001”是指asciminib。
[0041]
治疗益处包括根除和/或改善正在治疗的潜在疾病，例如癌症；它还包括根除和/或改善与潜在病症相关的一种或多种症状，从而在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍受潜在病症的折磨。
[0042]
在一些实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括以下一种或多种：(a)抑制病症(例如，减少由病症引起的一种或多种症状，和/或减少病症的程度紊乱)；(b)减缓或阻止与疾病相关的一种或多种症状的发展(例如，稳定疾病和/或延缓疾病的恶化或进展)；和/或(c)缓解疾病(例如，导致临床症状消退、改善疾病、延缓疾病进展和/或提高生活质量)。
[0043]
术语“给药(administering)”或“给药(administration)”包括使用任何合适的制剂或给药途径向患者递送化合物或其药学上可接受的盐、或其前药或其他药学上可接受的衍生物，例如在此描述。
[0044]
术语“共同给药(co-administration)”或“联合治疗(combination therapy)”被理解为使用分开的制剂或单一药物制剂给予两种或更多种活性剂，或以任何顺序连续给予，使得存在一段时间(或所有)活性剂同时发挥其生物活性。
[0045]
术语“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“有效量(effective amount)”是指可有效引发所需生物学或医学反应的量，包括化合物的量，当向受试者施用以治疗病症时，该量足以实现这种疾病的治疗。有效量将根据病症、其严重程度以及待治疗对象的年龄、体重等而变化。有效量可以是一剂或多剂(例如，可能需要单剂或多剂以达到期望的治疗终点)。如果与一种或多种其他药剂联合，可以或已经达到期望的或有益的结果，则可以认为以有效量给予有效量。由于化合物的联合作用、加成或协同作用，可以任选地降低任何共同施用的化合物的合适剂量。
[0046]
考虑向其施用的术语“患者”包括但不限于人类(即任何年龄组的男性或女性，例如儿科受试者(例如婴儿、儿童、青少年)或成年受试者(例如，青年、中年或老年)和/或其他灵长类动物(例如，食蟹猴、恒河猴)。.
[0047]
要通过本发明的方法治疗的“受试者”可以指人类或非人类动物，优选哺乳动物，
更优选人类。在某些实施方案中，受试者在使用本发明的方法开始治疗之前具有可检测的肿瘤。在某些实施方案中，受试者在使用本发明的方法开始治疗时具有可检测的肿瘤。
[0048]
术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指降低患疾病或病症的风险。预防并不要求受试者的疾病或状况永远不会发生或复发。
[0049]
术语“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”是指化合物、盐、组合物、剂型和其他材料，其可用于制备适用于兽药或人类药物用途的药物组合物。
[0050]
术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和低等动物的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应等的那些盐，并且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceutical sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐。化合物1的药学上可接受的盐包括那些衍生自合适的无机和有机酸和碱的盐。
[0051]
药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过使用本领域中使用的其他方法，例如离子交换。
[0052]
其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、戊二酸、富马酸盐半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、棕榈酸盐、棕榈酸盐苯丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。尽管药学上可接受的抗衡离子将优选用于制备药物制剂，但其他阴离子作为合成中间体是完全可接受的。因此，当这些盐是化学中间体时，它可能是药学上不希望有的阴离子，例如碘化物、草酸盐、三氟甲磺酸盐等。
[0053]
此处使用的术语“药用可接受载体”是指与受体主体(优选哺乳动物，更优选人类)兼容的物质，并且适合于在不终止制剂活性的情况下将活性制剂递送到目标部位。与载体相关的毒性或不良反应(如果有的话)最好与预期使用活性药物的合理风险/效益比例相称。
[0054]
术语“口服”是指施用旨在被摄取的组合物。口服形式的实例包括但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂以及滴剂。这种形式可以整个吞咽或可以咀嚼形式。
[0055]
术语“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是共刺激检查点分子，即打开信号，或抑制检查点分子，即关闭信号。如本文所用，“共刺激检查点分子”是免疫系统中产生信号或共刺激的分子。“抑制性检查点分子”。如本文所用是免疫系统中的分子，其降低信号或共抑制。
[0056]
术语“免疫检查点分子的调节剂”是能够改变受试者中免疫检查点活性的药剂。在某些实施方案中，免疫检查点分子的调节剂改变一种或多种免疫检查点分子的功能，包括pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag3、cd160、2b4、tgfβ、vista、btla、tigit、lair1、ox40、cd2、cd27、icam-1、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、lfa-1、1cos、4-1bb、gitr、
cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light和cd83。免疫检查点的调节剂可以是免疫检查点的激活剂(例如激动剂)或抑制剂(例如拮抗剂)。在一些实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体fab片段、二价抗体、抗体药物偶联物、scfv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在一些实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是小分子。在一个具体实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是抗pd1抗体。在一个具体实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是抗pd-l1抗体。在一个具体实施方案中，免疫检查点分子的调节剂是抗ctla-4抗体。
[0057]
如本文所用，术语“共同给药(co-administering)”或“共同给药(co-administration)”是指式(i)化合物或hqp-1351的给药之前、同时或基本上同时、之后或间歇地给药施用变构抑制剂或免疫检查点调节剂。
[0058]
术语“完全消退”是指治疗后检测不到肿瘤。
[0059]
术语“部分消退”是指与治疗前相比肿瘤体积变小(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)。
[0060]
在本技术中存在一系列列举的数值的所有事件中，应当理解，任何列举的数值都可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有这样的数值范围，即具有数值上限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一个的数值可以是任何此处引用的数值。此处提供的范围应理解为包括该范围内的所有值。例如，1-10被理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当的分数值。表示为“高达”某个值(例如，高达5)的范围应理解为所有值，包括范围的上限，例如0、1、2、3、4和5，以及小数值为合适的。最多或一周内被理解为包括0.5、1、2、3、4、5、6或7天。类似地，由“至少”界定的范围被理解为包括所提供的较低值和所有较高的数字。
[0061]
术语“烷基”是指具有一定数量碳原子的支链或直链烷基。例如，“c1-c5烷基”中“c1-c5”的定义是指具有1、2、3、4或5个碳原子的直链或支链烷基。例如：“c1-c5烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基等。
[0062]
术语“环烷基”是指具有特定碳原子数的特定单饱和环烷基。例如，“环烷基”包括环丙基-、甲基-环丙基-、2,2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基-、环己基等。
[0063]
术语“烷氧基”是指甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。
[0064]
术语“卤”或“卤素”是指氯、氟、溴和碘。
[0065]
这里描述了本发明的各种(列举的)实施方案。将认识到在每个实施方案中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的进一步实施方案。
[0066]
实施方案1一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者共同施用：
[0067]
a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐；和
[0068]
b)变构抑制剂；
[0069]
其中式(i)具有以下结构：
[0070][0071]
其中
[0072]
r1是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-4
烷氧基或苯基；和
[0073]
r2是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基或卤素。
[0074]
在式(i)化合物的一个实施方案中，r1是氢或c
1-4
烷基。
[0075]
在式(i)化合物的另一个实施方案中，r1是氢。
[0076]
在式(i)化合物的另一个实施方案中，r2是氢或c
1-4
烷基。
[0077]
在式(i)化合物的另一个实施方案中，r2是c
1-4
烷基。
[0078]
在式(i)化合物的另一个实施方案中，r2是甲基或乙基。在另一个实施方案中，r2是甲基。
[0079]
在式(i)化合物的另一个实施方案中，r1是氢，r2是c
1-4
烷基。
[0080]
式(i)化合物是针对广谱bcr-abl突变的新型选择性强抑制剂，包括t3151、e255k/v、g250e、h396p、m351t、q252h、y253f/h或bcr-ablwt。
[0081]
式(i)化合物或其药学上可接受的盐也是针对其他激酶的有效抑制剂，包括kit、braf、ddr1、pdgfr、fgfr、flt3、ret、src、tie1和tie2。
[0082]
实施方案2实施方案1中的方法，其中式(i)化合物为hqp-1351或其药学上可接受的盐，其中hqp-1351具有以下结构：
[0083][0084]
hqp-1351是一种新型的、具有口服活性的、有效的第三代bcr-abl抑制剂，旨在有效靶向bcr-abl突变体，包括t315i，并且它正在开发用于治疗对首次和第二代酪氨酸激酶抑制剂(tki)。
[0085]
hqp-1351的化学名称是3-(2-(1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基-n-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-苯甲酰胺。
[0086]
式(i)化合物或hqp-1351化合物或其药学上可接受的盐可以根据2014年9月30日授权的美国专利号8,846,671b2中描述的生产方法制备，该专利以引用方式并入本文中，其全部和用于所有目的或与其类似的方法。
[0087]
实施方案3实施方案1或2的方法，其中变构抑制剂是asciminib。
[0088]
本发明发现hqp-1351也称为奥瑞巴替尼，增强了变构抑制剂对bcr-abl复合突变
所赋予的抗性的作用。用针对bcr-abl atp结合位点的酪氨酸激酶抑制剂(tki)进行治疗可促进ph 白血病的恢复。然而，检查点突变t315i和复合突变体的出现赋予了对这些tki的抗性。hqp-1351是针对bcr-abl的新一代tki。它是一种atp位点抑制剂，目前正在开发用于r/r cml。
[0089]
asciminib是一种变构抑制剂，靶向bcr-abl激酶的肉豆蔻酰基结合口袋和下游信号。研究表明，将asciminib与ponatinib联合使用只能克服bcr-abl复合突变体引起的部分耐药性。hqp-1351与asciminib的新组合，靶向bcr-abl蛋白的atp袋和变构区，可以促进对含有复合突变的激酶的抑制作用。
[0090]
asciminib可以根据nature(london,united kingdom),543(7647),733-737：2017中描述的方法或根据pct公开wo2013/171639中描述的方法制备。
[0091]
基于baf3细胞构建了一系列具有bcr-abl单一或复合突变的细胞。使用体外抗增殖、蛋白质印迹和facs测定法分析hqp-1351作为单一药剂或与asciminib组合的效果。使用源自具有t315i和/或复合突变的baf3细胞的同基因小鼠模型评估体内功效。
[0092]
基于细胞的抗增殖研究证明了hqp-1351对bcr-abl单突变或复合突变的优越活性，ic
50
值范围在6-300nm之间。尤其是，hqp-1351在对抗这些复合突变方面比ponatinib、asciminib和其他tki更有效。此外，hqp-1351与asciminib的组合对bcr-abl复合突变非常有效，尤其是那些含有t315i的突变。体内研究进一步表明，与单一药物相比，hqp-1351与asciminib的共同给药可显著延长生存期。重要的是，在含有复合突变的模型中，抗肿瘤作用比ponatinib加asciminib更有效。在机制上，联合治疗协同下调bcr-abl和下游蛋白crkl和stat5的磷酸化。并增强caspase-3和parp-1的裂解，从而引发细胞凋亡，进而增强抗肿瘤作用。
[0093]
本发明实施方案1的结果表明，atp结合位点抑制剂hqp-1351和变构抑制剂的组合可能对bcr-abl中含有单一或复合突变的肿瘤细胞具有最佳的抗肿瘤作用。这种新策略可能有助于克服单一tki治疗后的二次复合突变。
[0094]
实施方案4实施方案1-3的方法，其中癌症是血液恶性肿瘤。
[0095]
实施方案5实施方案4的方法，其中血液恶性肿瘤是白血病。
[0096]
实施方案6实施方案4的方法，其中血液恶性肿瘤是慢性粒细胞白血病。
[0097]
实施方案7实施方案1-6的方法，其中所述方法用于治疗对当前酪氨酸激酶抑制剂疗法具有抗性的慢性髓性白血病患者。
[0098]
实施方案8实施方案7所述的方法，其中所述对当前酪氨酸激酶抑制剂疗法具有抗性的慢性粒细胞白血病患者是由bcr-abl突变引起的。
[0099]
实施方案9实施方案8的方法，其中bcr-abl突变是t3151、e255k/v、g250e、h396p、m351t、q252h、y253f/h或bcr-ablwt突变。
[0100]
实施方案10实施方案8的方法，其中bcr-abl突变为t3151突变。
[0101]
实施方案11实施方案1-3的方法，其中所述癌症为乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨转移癌、结直肠癌、食道癌、头颈癌、肺癌、肺类癌或胃癌。
[0102]
实施方案12实施方案11的方法，其中肺癌是非小细胞肺癌(nsclc)。
[0103]
实施方案13实施方案11的方法，其中肺癌是小细胞肺癌(sclc)。
[0104]
实施方案14一种抑制bcr-abl突变体的方法，该方法包括使bcr-abl突变体与a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐接触；b)变构抑制剂，其中式(i)化合物具有以下结构：
[0105][0106]
其中：
[0107]
r1为氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-4
烷氧基或苯基；和
[0108]
r2是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、卤素。
[0109]
实施方案15实施方案14的方法，其中式(i)化合物为hqp-1351或其药学上可接受的盐，其中hqp-1351具有以下结构：
[0110][0111][0112]
实施方案16实施方案14或15的方法，其中变构抑制剂是asciminib。
[0113]
实施方案17实施方案14-16的方法，其中抑制是体外或体内的。
[0114]
实施方案18实施方案14-19的方法，其中抑制是在患有对当前酪氨酸激酶抑制剂疗法有抗性的慢性髓性白血病患者中进行的。
[0115]
实施方案19实施方案18的方法，其中对当前酪氨酸激酶抑制剂疗法具有抗性的慢性髓性白血病患者是由bcr-abl突变引起的。
[0116]
实施方案20实施方案19的方法，其中bcr-abl突变是t3151、e255k/v、g250e、h396p、m351t、q252h、y253f/h或bcr-ablwt突变。
[0117]
实施方案21实施方案19的方法，其中bcr-abl突变是t3151。
[0118]
本发明进一步发现hqp-1351增强了nsclc中t细胞介导的抗肿瘤免疫反应。本发明的发现提供了支持hqp-1351和抗pd-1/pd-l1联合作为一种潜在的联合治疗方法来提高nsclc免疫疗法疗效的证据。
[0119]
尽管包括pd-1/pd-l1抗体的免疫检查点抑制剂(ici)在一些癌症治疗中表现出有利的治疗反应，但相当一部分癌症患者仍然没有反应。无反应率的实质性限制突出了对合适的联合疗法的需求。src家族激酶在多种人类恶性肿瘤中过度表达或激活，作为调节抗肿瘤免疫的候选靶标。hqp-1351是一种口服生物可利用的多激酶抑制剂，已在慢性粒细胞白血病中显示出临床疗效。本发明证明hqp-1351作为src抑制剂能够增加非小细胞肺癌(nsclc)的抗肿瘤免疫，如下面的实施例所示。
[0120]
pd-1，程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，也称为cd279和pdcd1)是一种抑制性受体，对
免疫系统有负调节作用。与主要影响初始t细胞的ctla-4不同，pd-1在免疫细胞上更广泛地表达，并调节外周组织和肿瘤微环境中的成熟t细胞活性。pd-1通过干扰t细胞受体信号传导来抑制t细胞反应。pd-1有两个配体，pd-l1和pd-l2。已经开发了对pd-1特异的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文所公开地使用。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是调节pd-1的活性和/或表达的药剂。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是结合pd-1的药剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是pd-1激动剂。在一些实施方案中，检查点调节剂是pd-1拮抗剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节器是一种pd-1结合蛋白(如抗体)从下组中进行选择pembrolizumab(可瑞达，原名兰博利珠单抗，默克公司)、nivolumab(opdivo；百时美施贵宝)、匹地珠单抗(ct-011，curetech)、js-001(上海君实生物科技有限公司)、shr-1210(incyte/江苏恒瑞医药有限公司)、medi0680(也称为amp-514；amplimmune inc./medimmune)、pdr001(诺华)、bgb-a317(百济神州)、tsr-042(也称为anb011；anaptysbio/tesaro,inc.)、regn2810(也称为cemiplimab，再生元制药公司/赛诺菲-安万特)和pf-06801591(辉瑞)。其他pd-1结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的并且公开于例如美国专利号9,181,342、8,927,697、7,488,802、7,029,674中；美国专利申请公开号2015/0152180、2011/0171215、2011/0171220；以及pct公开号wo 2004/056875、wo 2015/036394、wo 2010/029435、wo 2010/029434、wo 2014/194302，其各自通过引用并入本文。
[0121]
pd-l1/pd-l2。pd配体1(pd-l1，也称为b7-h1)和pd配体2(pd-l2，也称为pdcd1lg2、cd273和b7-dc)与pd-1受体结合。两种配体与cd28和ctla-4相互作用的b7-1和b7-2蛋白属于同一b7家族。pd-l1可以在许多细胞类型上表达，包括例如上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。pd-l1的连接减少了ifn、tnf和il-2的产生并刺激了il10的产生，il10是一种与t细胞反应性和增殖降低以及抗原特异性t细胞无反应性相关的抗炎细胞因子。pd-l2主要在抗原呈递细胞(apc)上表达。pd-l2连接也会导致t细胞抑制，但在pd-l1-pd-1相互作用通过g1/g2期细胞周期停滞抑制增殖的情况下，pd-l2-pd-1连接已被证明通过阻断b7来抑制tcr介导的信号传导：cd28在低抗原浓度下发出信号，并在高抗原浓度下减少细胞因子的产生。已经开发了对pd-l1和pd-l2具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文所公开地使用。
[0122]
在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是调节pd-ll的活性和/或表达的药剂。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是结合pd-l1的药剂(例如，抗pd-l1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是pd-l1激动剂。在一些实施方案中，检查点调节剂是pd-l1拮抗剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节器是pd-l1结合蛋白(例如，抗体或fc融合蛋白)从下组中进行选择durvalumab(也称为medi-4736；阿斯利康/celgene corp./medimmune)、atezolizumab(tecentriq；也称为mpdl3280a和rg7446；genetech inc.)、avelumab(也称为msb0010718c；默克雪兰诺/阿斯利康)；mdx-1105(bms-936559，medarex/百时美施贵宝)、amp-224(amplimmune，葛兰素史克)、ly3300054(礼来公司)、js003(上海君实生物科技有限公司)、shr-1316(江苏恒瑞医药有限公司)、kn035(alphamab and 3d medicines)或ck-301(checkpoint therapeutics)。另外的pd-l1结合蛋白是本领域已知的并且公开于例如美国专利申请公开号2016/0084839、2015/0355184、2016/0175397和pct公开号wo 2014/100079、wo/2016/030350、wo2013181634，其各自通过引用并入本文。
[0123]
在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是调节pd-l2的活性和/或表达的药剂。在
一些实施方案中，免疫检查点调节剂是结合pd-l2的药剂(例如，抗pd-l2抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是pd-l2激动剂。在一些实施方案中，检查点调节剂是pd-l2拮抗剂。pd-l2结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的并且公开于例如美国专利号9,255,147、8,188,238；美国专利申请公开号2016/0122431、2013/0243752、2010/0278816、2016/0137731、2015/0197571、2013/0291136/、2011/0271358；以及pct公开号wo 2014/022758和wo 2010/036959，其各自通过引用并入本文。
[0124]
在某些实施方案中，免疫检查点调节剂的给药剂量比特定癌症的标准剂量低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂的剂量为特定肿瘤疾病免疫检查点调节剂标准剂量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施方案中，当施用免疫检查点调节剂的组合时，至少一种免疫检查点调节剂以低于特定肿瘤病症的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施方案中，当施用免疫检查点调节剂的组合时，至少两种免疫检查点调节剂以低于用于特定肿瘤病症的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施方案中，当施用免疫检查点调节剂的组合时，至少三种免疫检查点调节剂以低于特定肿瘤病症的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施方案中，当施用免疫检查点调节剂的组合时，所有免疫检查点调节剂以低于用于特定肿瘤病症的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂以低于免疫检查点调节剂标准剂量的剂量施用，并且式(i)化合物或hqp-1351以低于标准剂量的剂量施用。
[0125]
实施方案22一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者共同给药：
[0126]
a)式(i)化合物或其药学上可接受的盐；和
[0127]
b)一种免疫检查点分子，其中式(i)具有以下结构：
[0128][0129]
其中
[0130]
r1是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-4
烷氧基或苯基；和
[0131]
r2是氢、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、卤素。
[0132]
实施方案23实施方案22的方法，其中式(i)化合物为hqp-1351或其药学上可接受的盐。
[0133]
实施方案24实施方案21-22所述的方法，其中所述免疫检查点分子是pd-1或pd-l1。
[0134]
实施方案25实施方案21-22所述的方法，其中所述免疫检查点分子是pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag3、cd160、2b4、tgfβ、vista、btla、tigit或lair1。
[0135]
实施方案26实施方案21-22所述的方法，其中所述免疫检查点分子是pembrolizumab(派姆单抗)、ipilimumab(伊匹单抗)、nivolumab(纳武单抗)、atezolizumab
(阿特珠单抗)、avelumab、durvalumab(度伐单抗)、cemiplimab(西米普利单抗)、lirilumab、tremelimumab(曲美木单抗)或pidilizumab(匹地利珠单抗)。
[0136]
实施方案27实施方案21-22所述的方法，其中所述免疫检查点分子是amp-224、amp-514、bgb-a317、cemiplimab(西米普利单抗)、js001、pdr-001、pf-06801591、ibi-308、pidilizumab(匹地利珠单抗)、shr-1210或tsr-042。
[0137]
实施方案28实施方案22-27所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨转移癌、结直肠癌、食道癌、头颈癌、肺癌、肺类癌或胃癌。
[0138]
实施方案29实施方案28的方法，其中肺癌是非小细胞肺癌。
[0139]
实施方案30实施方案29的方法，其中肺癌是小细胞肺癌。
[0140]
实施方案31实施方案1-13和22-30的方法，其中将式(i)化合物或其药学上可接受的盐口服给予有需要的患者。
[0141]
实施方案32如前任一实施方案所述的方法，其中在28天的治疗周期期间每隔一天(qod)施用所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0142]
实施方案33实施方案32的方法，其中式(i)的化合物是hqp-1351。
[0143]
实施方案34实施方案32的方法，其中hqp-1351以约1mg、约2mg、约4mg或约8mg的量每隔一天施用一次。
[0144]
实施方案35实施方案32的方法，其中hqp-1351以约12mg或约20mg的量每隔一天施用一次。
[0145]
实施方案36实施方案32的方法，其中hqp-1351以约30mg、约40mg或约45mg的量每隔一天施用一次。
[0146]
实施方案37实施方案32的方法，其中hqp-1351以约50mg或约60mg的量每隔一天施用一次。
[0147]
在一些实施方案中，用于治疗癌症的联合疗法包括至少一个21天的治疗周期，其中式(i)的化合物，例如hqp-1351，或其药学上可接受的盐，以治疗有效的给药数量。
[0148]
在一些实施方案中，治疗有效量为0.5mg-100mg，优选1mg-80mg，更优选1mg-60mg，最优选约1mg、约2mg、约4mg或约8mg。
[0149]
在一些实施方案中，hqp-1351的治疗有效量为约12mg或约20mg。
[0150]
在一些实施方案中，hqp-1351的治疗有效量为约30mg、约40mg或约45mg。
[0151]
在一些实施方案中，hqp-1351的治疗有效量为约50mg或约60mg。
[0152]
在某些实施方案中，在21天治疗周期的前两周，有需要的患者每隔一天口服hqp-1351治疗有效量，而在治疗周期的第三周不给药。
[0153]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1、3、5、7、9、11和13天，给患者口服配方(i)的化合物，如hqp-1351，或药物可接受的盐。
[0154]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第14-21天不施用式(i)化合物，例如hqp-1351或其药学上可接受的盐。
[0155]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向患者口服式(i)化合物，例如hqp-1351或其医药上可接受的盐，其量为约50mg至约200mg。
[0156]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1、3、5、7、9、11和13天，给患者口服配方(i)的化合物，如hqp-1351，或药物可接受的盐，剂量约为50mg。
[0157]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向患者口服式(i)化合物，例如hqp-1351或其医药上可接受的盐，其量约为100mg。
[0158]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向患者口服式(i)化合物，例如hqp-1351或其医药上可接受的盐，其量约为150mg。
[0159]
在一些实施方案中，在21天治疗周期的第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向患者口服式(i)化合物，例如hqp-1351或其医药上可接受的盐，其量约为200mg。
[0160]
在一些实施方案中，asciminib被口服施用。
[0161]
在一些实施方案中，pd-1或pd-ll在21天治疗周期的第1天通过静脉输注以200mg的量施用。
[0162]
在一些实施方案中，联合治疗至少包括21天治疗周期中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。在一些实施方案中，联合治疗持续到疾病进展或不可接受的毒性。
[0163]
在某些实施方案中，至少1、2、3、4或5个周期的联合治疗被给予受试者。在每个周期结束时，对受试者的反应标准进行评估。在每个周期中还监测受试者的不良事件(例如，凝血、贫血、肝肾功能等)以确保治疗方案被充分耐受。
[0164]
提供以下实施例是为了说明而非限制。
[0165]
实施例1hqp-1351的抗增殖测定以增强变构抑制剂对bcr-abl复合突变赋予的抗性的影响
[0166]
方法
[0167]
抗增殖作用通过基于水溶性四唑(wst)的测定使用cell counting kit-8(cck-8，#d3100l4057，上海瑞博生物科技有限公司测定。将细胞接种在96孔板中并用不同浓度的测试物品处理。使用9种不同浓度的asciminib和3种固定剂量的hqp1351测试了组合效果。每种处理一式三份进行测试。然后将平板在37℃和5％co2下培养72小时。处理结束时，每孔直接加入20μl/孔的cck-8试剂。然后将板在37℃下与5％co2孵育2-4小时。在酶标仪(spectramax i3x，molecular devices，us)上在450nm处检测od值。ic
50
值使用graphpad prism 7.0软件使用非线性回归(曲线拟合)型数据分析计算。对于组合效应测定，使用单一试剂对照的三次重复孔的平均od值将细胞活力归一化。当联合曲线的计算ic
50
小于单药的ic
50
(联合曲线左移)且联合指数(ci)小于1.0(calcusyn version 2.0，zhou)时，表明两种化合物之间具有协同作用。
[0168]
流式细胞术分析
[0169]
使用annexin v-pi(碘化丙啶)染色试剂盒(#c1062l，beyotime生物技术，中国)测定凋亡细胞。简而言之，在用测试物品处理指定时间后收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤。然后用膜联蛋白-v和pi染色细胞，并用流式细胞仪(cytoflex，beckman，us)进行分析。通过分析每次处理10,000个细胞获得细胞凋亡图谱。
[0170]
蛋白质印迹分析
[0171]
在用测试物品处理指定时间后，收获培养的细胞并用冰冷的pbs洗涤。细胞沉淀在含有1％pmsf和1％蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液中裂解。使用bca protein assay kit(#p0011，beyotime biotechnology，china)测定蛋白质浓度。在8-12％sds-page上分离细胞
裂解物(20-50μg)。将分离的蛋白质转移到pvdf膜(#10600023，amersham，us)。pvdf膜在室温下用1％bsa缓冲液印迹1小时。在含有5％bsa的1xtbst中将膜与一抗在4℃下孵育过夜。用1xtbst清洗膜3次。将膜与hrp偶联的二抗在室温下孵育1小时。用1xtbst清洗膜3次。使用superecl plus(#36208es76，yeasen biotech，china)和图像系统(azure c300，azure biosystems，us)对信号进行可视化.
[0172]
原位模型的体内功效
[0173]
使用源自具有t315i和/或复合突变的baf3细胞的同基因小鼠模型评估体内功效。通过在无菌条件下将肿瘤细胞(1
×
105/只)静脉注射到尾静脉建立肿瘤模型。将小鼠随机分为对照组和治疗组，每组8-10只小鼠，并从接种后第二天开始治疗。每周测量动物体重两次。以治疗时间(天)为x轴，对应的存活率在y轴上绘制试验品的抗肿瘤活性曲线。采用对数秩(mental-cox)检验来分析治疗组和对照组之间任何差异的统计显著性。prism版本7(graphpad software inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)用于所有统计分析和图形展示。
[0174]
结果
[0175]
基于baf3鼠pro-b细胞系构建了一系列表达bcr-abl单一或复合突变的细胞系。使用体外抗增殖试验、蛋白质印迹和facs试验分析hqp-1351作为单一药物或与asciminib组合的作用。基于细胞的抗增殖研究表明hqp-1351对bcr-abl单突变或复合突变具有优异的活性，ic
50
值范围为6-300nm。尤其是，hqp-1351在对抗这些复合突变方面比ponatinib、asciminib和其他tki更有效。此外，hqp-1351与asciminib的组合对bcr-abl复合突变非常有效，尤其是那些含有t315i的突变。体内研究进一步表明，与单一药物相比，hqp-1351与asciminib(abl001)的共同给药可显著延长生存期。重要的是在携带t315i或复合突变的模型中，抗肿瘤作用比ponatinib加asciminib更有效。结果见表1-6和图1-11。
[0176]
表1
[0177]
hqp-1351：bcr-abli单药在baf3(bcr-abl)细胞系中的作用
[0178]
[0179][0180]
表2
[0181]
bcr-abli单药在baf3(bcr-abl)细胞系中的体外作用
[0182][0183]
表3
[0184]
在t315i原位肿瘤模型中，hqp1351与abl001联合使用效果更佳
[0185][0186]
研究结果也显示在图8a和8b中。
[0187]
表4
[0188]
y253h/t315i原位肿瘤模型中hqp1351与abl001联合使用效果更佳
[0189][0190]
研究结果也显示在图9a和9b中。
[0191]
表5
[0192]
hqp-1351和abl001在f317l/t315i原位肿瘤模型中的优异疗效
[0193][0194]
研究结果也显示在图10a和10b中。
[0195]
表6
[0196]
hqp-1351和abl001在e255v/t315i原位肿瘤模型中的可比疗效
[0197][0198]
研究结果也显示在图11a和11b中。
[0199]
结论
[0200]
结果表明，atp结合位点抑制剂hqp-1351和变构抑制剂的组合对bcr-abl单突变或复合突变的肿瘤细胞具有协同抗肿瘤作用。在不受理论约束的情况下，联合治疗协同下调bcr-abl和下游蛋白crkl和stat5的磷酸化，并增强caspase-3和parp-1的切割，从而引发细胞凋亡并随后增强抗肿瘤作用。这种新策略可能有助于克服tki治疗后的二次复合突变。
[0201]
实施例2hqp-1351作为src抑制剂在非小细胞肺癌研究中提高抗肿瘤免疫力的研究一般方法
[0202]
细胞毒性试验用于确定hqp-1351在nsclc细胞系中的抗肿瘤活性。此外，通过蛋白质印迹、定量pcr和流式细胞术研究了hqp-1351处理细胞中pd-l1的表达。此外，还在体外和体内测定了hqp-1351单独或与ici组合在增强抗肿瘤免疫方面的作用。使用基因操作技术建立稳定的src敲低nsclc细胞以探索其潜在机制。
[0203]
细胞培养和试剂
[0204]
nsclc细胞系(a549、h1299、h460)、lewis肺癌(llc)细胞系和293t细胞系来自美国典型培养物保藏中心(atcc，美国)，并通过短串联重复(str)分析进行验证。细胞在含有10％胎牛血清的rpmi-1640(对于nsclc细胞系)或dmem(对于llc细胞和293t细胞)中培养，并在37℃的加湿5％co2培养箱中培养。外周血单个核细胞(pbmc)在t细胞培养基(rpmi-1640中添加10％人血清、5％l-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(sigma-aldrich，美国)和il-2(100iu/ml)。hqp-1351由ascentage pharma group inc.提供。对于体外研究，hqp-1351以10μm的浓度溶解在dmso中并储存在-20℃。对于体内研究，hqp-1351溶解在0.2％hpmc。
[0205]
细胞活力测定
[0206]
细胞以每孔3
×
103个细胞的密度在96孔板中培养12小时，其中含有200μl培养基。贴壁后，细胞用指定浓度的hqp-1351预处理72小时。将20μl cck8试剂(dojindo laboratories，日本)加入每孔200μl培养基中，并在37℃下孵育2-4小时。然后用分光光度计在450nm处测量吸光度值。所有实验均重复3次，每次试验至少进行3次。在graphpad prism 8.0版上用非线性回归分析了剂量反应曲线和半数最大抑制浓度(ic
50
)值。
[0207]
蛋白质印迹分析
[0208]
用指示浓度处理细胞，并用冷pbs洗涤两次。在ripa裂解缓冲液(santa cruz biotechnology,germany)中收集全细胞提取物，并使用bca蛋白测定试剂盒(thermofisher,usa)测定裂解液的蛋白浓度。蛋白质样品通过10％的sds-page凝胶电泳，
并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(roche,usa)。封闭后，用针对src、p-src、pd-l1、gapdh、β-微管蛋白(cell signaling technology，美国)的一抗(1：1000)对膜进行探测，然后用结合辣根过氧化物酶(santa cruz biotechnology，美国)的二抗(1：5000)清洗并孵育。采用化学发光试剂(pierce ecl试剂盒，thermo fisher scientific,usa)观察蛋白条带，image lab(bio-rad laboratory,usa)定量蛋白水平。rna提取和实时定量pcr用trizol(invitrogen,usa)提取细胞总rna进行mrna分析。使用transcriptor first strand cdna synthesis kit(roche applied science,usa)将rna逆转录到cdna图谱，然后按照说明书使用faststart sybr green master(rox)试剂(roche applied science,usa)进行实时pcr反应。real-time pcr分析采用biorad cfx96系统(sybr green,bio-rad,usa)和相应的引物，评估src mrna的表达水平。数据被归一化为三次样本中的gapdh水平。引物如下：
[0209]
src正义引物：gagcggctccagattgtcaa(seq id no:1)；
[0210]
src反义引物：ctggggatgtagcctgtctgt(seq id no:2)；
[0211]
pdl1正义引物：tatggtggtgccgactacaa(seq id no:3)；
[0212]
pdl1反义引物：tgcttgtccagatgacttcg(seq id no:4)；
[0213]
gapdh正义引物：ggtgaaggtcggagtcaacgg(seq id no:5)；
[0214]
gapdh反义引物：cctggaagatggtgatgggatt(seq id no:6)。
[0215]
shrna和质粒dna的转染
[0216]
src shrna和shrna scramble对照(genecopoeia，美国)与psih-h1-puro lentivector packaging kit(system biosciences，usa)一起瞬时转染。使用lipofectamine 2000转染试剂(life technologies，美国)并按照制造商的说明，在293t细胞中进行转染，该细胞在10cm培养皿中生长至～80％汇合。h460和h1299细胞被感染并与病毒颗粒在37℃下孵育过夜。在转染后48小时，通过在生长培养基中补充嘌呤霉素(h460为1.5μg/ml，h1299为2μg/ml将细胞置于嘌呤霉素选择下。通过蛋白质印迹和rt-pcr验证了基因表达的稳定抑制。
[0217]
集落形成试验
[0218]
作为效应细胞，使用ficoll梯度离心(solarbio，北京)从健康志愿者的血液中纯化人pbmc。经流式细胞术(fcm)测定，分离细胞的纯度》95％。将nsclc细胞系接种在用hqp-1351处理或未处理的96孔板中。人外周血单核细胞用100ng/ml cd3抗体、100ng/ml cd28抗体和10ng/ml il-2激活，然后与nsclc细胞共培养。细胞是否用pd-l1 ab处理，并与活化的pbmc以多种靶标-效应比(1：0、1：1、1：4、1：16)共培养(所有样品一式三份)。共孵育4天后，24孔板孔用pbs洗涤两次以去除pbmc，然后将存活的肿瘤细胞固定并用吉姆萨染色液染色。扫描干燥的板并量化强度。
[0219]
流式细胞术分析
[0220]
将活化的pbmc以1
×
106/孔的密度接种在6孔板中，然后与用hqp-1351以4：1的比例预处理的肿瘤细胞共培养24h。将抗人pd-l1抗体atezolizumab(selleck chemicals,usa)(50μg/ml)添加到适当的孔中。共培养后，分离pbmc并用抗cd3和抗cd8抗体染色以估计cd8 细胞比例。对于ifn-γ、tnf-α和颗粒酶b分析，收获pbmc，然后在37℃下用brefeldin a(biolegend，美国)处理另外3小时以防止细胞外分泌。随后，按照制造商的说明，使用细胞内固定和透化缓冲液套件(ebioscience，美国)固定和透化pbmc。然后通过细胞内染色标记
cd8 t细胞中ifn-γ、tnf或颗粒酶b阳性细胞的百分比并通过流式细胞术检测。用于流式细胞术分析的抗体购自美国ebiosciences。匹配的同种型对照用于每个抗体来设门。flowjo(treestar,usa)软件用于分析流式细胞术数据。通过将特定抗体的中值荧光强度除以同种型对照的中值荧光强度来计算标准化荧光强度。结果表示为三个独立实验的平均值
±
sd。
[0221]
体内小鼠研究
[0222]
c57bl/6小鼠来自北京vital river实验动物科技有限公司，并保存在中山大学肿瘤中心动物中心的spf级隔离设施中。所有动物实验均采用8-12周龄雌性小鼠。实验经中山大学癌症中心机构委员会批准，按照广东省动物关爱使用委员会批准的实验方案进行。将llc细胞(在200μl培养基中培养10
×
105个细胞)皮下注射到免疫功能良好的c57bl/6小鼠右侧皮下。每3天用卡尺测量肿瘤生长，按1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。当肿瘤达到约100mm3时，将小鼠随机分为对照组和实验组。最终事件定义为肿瘤大小达到2000mm3，此时动物被安乐死。用hqp-1351或大鼠抗pd-l1抗体(αpd-l1，克隆10f.9g2；biolegend,usa)，hqp-1351和αpd-l1组合，或生理盐水和igg2bκ(克隆rtk4530；美国biolegend)。hqp-1351(50mg/kg)自肿瘤植入后第13天起，每天灌胃给药。抗pd-l1抗体治疗(10mg/kg)每周腹腔注射，分别在第16、23、30、37和44天。生存分析采用kaplan-meier分析和log-rank检验。
[0223]
统计分析
[0224]
使用ibm spss statistics 19软件或graphpad prism使用student t检验或单向方差分析或dunnett检验进行统计分析。所有实验一式三份重复。数据表示为平均值
±
标准偏差(sd)。统计显著性定义为p《0.05。
[0225]
结果
[0226]
hqp-1351在体外增强抗pd-l1的功效
[0227]
首先，为了排除hqp-1351诱导的生长抑制变化引起的潜在偏差，我们对不同细胞系进行生长抑制曲线，并建立了50％的抑制浓度(ic
50
)(图1a)。然后，为了探讨hqp-1351联合pd-1/pd-l1阻断是否能发挥协同免疫治疗作用，我们在体外测试了hqp-1351联合抗pd-l1阻断抗体的疗效。hqp-1351联合pd-l1抗体(atezolizumab)对肿瘤生长的抑制作用显著高于单独hqp-1351或单独pd-l1阻断。图12a-c显示hqp-1351在体外增强了抗pd-l1的疗效。用cck8测定hqp-1351对不同人癌细胞的细胞毒性。每个点表示三次独立实验的均值
±
标准差(sd)。(b-c)。集落形成试验的t细胞毒性试验。测定hqp-1351预处理后的h460、h1299细胞、未预处理的细胞、pd-1抗体处理或不处理的细胞，以及与pbmcs(目标细胞：效应细胞＝1：0、1：1、1：4、1：8)共培养24孔板4天的存活情况。
[0228]
hqp-1351增强体内抗pd-l1的功效
[0229]
在llc细胞荷瘤小鼠中，与单纯使用hqp-1351或pd-l1 ab治疗的小鼠相比，接受hqp-1351和pd-l1 ab治疗的小鼠在肿瘤生长方面表现出更显著的延迟(图2a-c)。同时，实验小鼠的体重没有明显下降，这表明联合疗法对小鼠的耐受性相对较好。图13a-f显示hqp-1351在体内增强了抗pd-l1的功效。对c57bl/6小鼠进行不同治疗后的肿瘤体积测定(n＝5)。误差条代表三个独立实验的sem。(b)不同处理c57bl/6小鼠的体重变化(n＝5)。
[0230]
hqp-1351以剂量和时间依赖性方式抑制p-stat3和pd-l1表达
[0231]
为了进一步探索hqp-1351增强pd-l1抗体的潜在机制，我们进一步验证了hqp-1351对pd-l1表达的抑制作用。在不同浓度的hqp-1351处理后，我们观察到hqp-1351以浓度
依赖的方式降低了nsclc细胞系中的pd-l1表达和p-src磷酸化(图14a)。此外，2μm hqp-1351在不同时间点处理的细胞显示pd-l1和p-src水平的抑制呈时间依赖性(图14b)。为了验证这一点，我们还进行了实时pcr(rt-pcr)分析(图14c)。结果表明，hqp-1351对p-src和pd-l1的表达具有时间依赖性和浓度依赖性。图14a-c显示hqp-1351抑制p-src和pd-l1的表达呈剂量和时间依赖性。在图14a中，h460和a549细胞分别用不同浓度的hqp-1351处理24h,western blot检测p-src、src和pd-l1的表达。图14b中，h460和a549细胞分别用2μm hqp-1351处理不同时间间隔的细胞，western blot检测p-src、src和pd-l1的表达。图14c中，h460和a549细胞分别用不同浓度的hqp-1351和2μm hqp-1351处理24h，用rt-pcr检测src和pd-l1的表达。
[0232]
结果
[0233]
我们的数据表明，hqp1351作为src抑制剂可增强nsclc中t细胞介导的抗肿瘤免疫反应。我们发现src抑制剂hqp-1351可显著降低nsclc细胞和动物模型中pd-l1的表达。观察到的抑制作用是时间和浓度依赖性的。此外，我们的结果表明，hqp-1351和抗pd-l1联合可在体外和体内改善t细胞介导的肿瘤细胞杀伤，这与激活的cd8 t细胞毒性细胞的细胞因子分泌升高有关，包括ifn-γ、tnf-α和颗粒酶-b。此外，我们还观察到，用hqp-1351联合pd-l1阻断剂治疗的小鼠比单独用单一药物治疗的小鼠存活时间更长。我们还提供证据支持hqp-1351和抗pd-1/pd-l1的组合作为一种潜在的联合治疗方法，以提高nsclc免疫治疗的疗效。
[0234]
实施例3hqp-1351在费城染色体阳性pre-b all细胞系(ph all sup-b15)中的抗肿瘤活性
[0235]
细胞活力测定
[0236]
白血病细胞以10,000个细胞的密度接种在不透明的96孔板中，并与浓度逐渐增加的hqp1351或载体(dmso)一起孵育。处理后，根据制造商(promega,madison,wi,usa,cat#g7571的说明，通过cell-titer3d cell viability assay发光检测试剂盒测量细胞活力。使用biotek synergy h1 hybrid multi-mode(microplate)reader(biotek,shanghai)检测发光信号。绘制细胞增殖(即活力)曲线并使用graphpad prism 6.0版软件计算抗增殖ic
50
值(graphpad software,美国加利福尼亚州圣地亚哥)。
[0237]
图15显示了用hqp1351处理72小时的sup-b15细胞的细胞活力曲线。
[0238]
图16显示了hqp1351在费城染色体阳性(ph 或bcr-abl1 )和阴性(ph-或bcr-abl1-)白血病细胞系中的抗增殖ic
50
值。数据表明，hqp1351选择性地抑制包括sup-b15在内的ph 细胞的增殖。
[0239]
结论
[0240]
hqp1351有效抑制ph all sup-b15细胞的增殖并诱导原代pre-b all细胞和all细胞系的凋亡。