金石蚕苷在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及金石蚕苷在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。


背景技术：

2.广东紫珠(callicarpa kwangtungensis chun.)，为马鞭草科紫珠属代表性药用植物，主要分布在中国大陆南部。全株入药，性凉、味苦涩，具有收敛止血、散瘀和清热解毒之功效，在民间主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、肺炎和外伤出血等。广东紫珠是中成药“抗宫炎片”和“妇炎康泡腾片”等的主要原料药材，广泛应用于妇科炎症制剂，为2015版《中国药典》收录药材品种。作为民间临床妇科炎症及各类出血症的常用药物，广东紫珠具有良好的开发应用前景。
3.现代研究发现，广东紫珠中含有苯丙素苷类、黄酮类、多糖和挥发油等化学成分。2020版《中华人民共和国药典》一部中规定广东紫珠药材中金石蚕苷(c
35h46o19
)和连翘酯苷b(c
34h44o19
)的总量不得少于0.50％。金石蚕苷(poliumoside)为苯丙素苷类物质，cas号：94079-81-9，分子式：c
35h46o19
，分子量：770.73，其具有抗菌消炎抗病毒作用，可用于散瘀止血，消肿止痛。目前尚未见有将金石蚕苷用于预防和/或治疗宫颈癌的报道。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供金石蚕苷在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：
6.金石蚕苷在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
7.所述的金石蚕苷的浓度优选为3.125～200μm；更优选为50～100μm。
8.所述的预防和/或治疗癌症药物优选为预防和/或治疗宫颈癌的药物；更优选为通过诱导宫颈癌细胞凋亡来预防和/或治疗宫颈癌的药物。
9.一方面，金石蚕苷作用于hela细胞后，导致keap1蛋白表达量上调，核内nrf2蛋白表达量下降，使keap1-nrf2信号通路失活，从而导致抗氧化酶表达量减少，细胞中ros水平增多，进而导致细胞死亡。另一方面，金石蚕苷通过激活促凋亡蛋白bax并且抑制抗凋亡蛋白bcl-2活性，促使bax/bcl-2比例上调，使caspase-3活化为cleaved caspase-3，导致线粒体损伤，从而诱导细胞凋亡。
10.一种预防和/或治疗宫颈癌的药物，包括金石蚕苷。
11.所述的预防和/或治疗宫颈癌的药物还包含药学上可接受的辅料。
12.所述的药学上可接受的辅料优选包括但不限于抗氧化剂、缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
13.所述的预防和/或治疗宫颈癌的药物的给药方式包括但不限于口服给药。
14.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
15.本发明首次发现金石蚕苷能够诱导宫颈癌细胞凋亡，因此可将金石蚕苷用于制备预防和/或治疗宫颈癌的药物。金石蚕苷可以诱导hela细胞内产生大量ros，导致氧化应激通路keap1-nrf2失活，促使bax/bcl-2比例上调，使caspase-3活化为cleaved caspase-3，引发线粒体损伤，从而诱导细胞凋亡。
附图说明
16.图1为金石蚕苷的结构式图。
17.图2为金石蚕苷的1h nmr谱图。
18.图3为金石蚕苷的
13
c nmr谱图。
19.图4为金石蚕苷的dept 13
c 135nmr谱图。
20.图5为金石蚕苷作用hela细胞后hoechst 33258荧光染色结果图。
21.图6为金石蚕苷作用hela细胞后ao/eb双荧光染色结果图。
22.图7为金石蚕苷对hela细胞生长周期的影响结果图。
23.图8为金石蚕苷对hela细胞凋亡的影响结果图。
24.图9为金石蚕苷对hela细胞内活性氧ros水平的影响结果图。
25.图10为金石蚕苷对hela细胞中keap1蛋白和nrf2核蛋白表达影响结果图。
26.图11为金石蚕苷对hela细胞中bax、bcl-2、casepase-3、cleaved casepase-3蛋白表达影响的结果图。
具体实施方式
27.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
28.实施例1：金石蚕苷的制备
29.金石蚕苷的制备：
30.12kg干燥广东紫珠(购自于江西萍乡)枝和叶粉碎过筛，置于渗漉筒中用甲醇反复提取，提取液合并减压浓缩后得到浸膏1kg；然后用适量蒸馏水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取液分别减压浓缩至干，得到石油醚部位85g，乙酸乙酯部位108g，正丁醇部位400g，水部位260g。取正丁醇萃取物(即正丁醇部位390g)经ab-8型大孔树脂柱层析，依次以0％、20％、40％、70％、100％(v/v)甲醇梯度洗脱，tlc检测合并，减压浓缩得5个不同梯度甲醇洗脱组分fr.1～fr.5。fr.3经diaion hp-20型大孔树脂依次以0％、20％、40％、70％、100％甲醇梯度洗脱，40％甲醇洗脱部位经sephadex lh-20凝胶柱柱层析，以20％甲醇/水洗脱分离得到金石蚕苷poliumoside(516mg)，结构式见图1，该化合物核磁图谱见图2-4。
31.实施例2：金石蚕苷对hela细胞凋亡的作用机制
32.(1)mtt检测细胞增殖抑制率
33.采用mtt法检测金石蚕苷在不同浓度下对宫颈癌hela细胞存活率的影响。具体操作如下：
34.胰酶消化，1000rpm离心5min收集hela细胞，hela细胞购于中国上海细胞库(atcc)，将细胞悬液吹打均匀，调整浓度为5
×
103个/ml，准备96孔板，每孔中加入100μl，重
复3孔，培养24h。分别设置空白组、对照组和给药组。给药组中金石蚕苷的浓度梯度分别为3.125μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm和200μm。空白组加入完全培养基，对照组加入含dmso的完全培养基。终止培养前4h，每孔加入5mg/ml mtt溶液20μl，继续避光培养。孵育完毕后，加入150μl dmso，使结晶充分溶解，采用酶标仪在λ＝490nm处检测od值。
35.结果表明：金石蚕苷对hela细胞增殖的抑制作用呈量效关系，ic
50
为58.77
±
0.24μm。
36.(2)hoechst 33258荧光染色
37.hoechst 33258染色试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司，hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，是特异性dna染料，主要用于细胞核染色。具体操作步骤如下：
38.染色液的配制：将hoechest 33258染色液用pbs缓冲液(hoechest 33258染色液与pbs缓冲液体积比(ml:ml)1:100；pbs缓冲液ph＝7.4，0.01m；下同)稀释，配制成染色液。试剂b用纯水稀释(试剂b与纯水体积比(ml:ml)1:10)。用70％(v/v)的酒精浸泡洁净的盖玻片大约5min，完全培养基洗涤1次，把消毒后的盖玻片置于6孔板中。
39.胰酶消化hela细胞，制成细胞悬液，细胞数为5
×
105个/ml。准备6孔板，每孔1ml细胞悬液，37℃、5％co2培养24h。分组处理，给药组分别加入50μm、100μm含金石蚕苷的完全培养基2ml，对照组加入完全培养基2ml，重复3孔，培养24h。吸去板中旧的培养液，每孔加入0.5ml 4％多聚甲醛组织固定液固定5min，吸去固定液，加入0.5ml染色液，室温条件下，锡箔纸包裹孵育15min。用试剂b洗涤盖玻片，将抗荧光淬灭剂滴至载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，在荧光显微镜下观察。
40.荧光显微镜观察如图5显示：对照组细胞是均匀蓝色荧光，与对照组相比，给药组经不同浓度金石蚕苷处理hela细胞后，出现亮蓝色荧光，蓝色呈浓染致密，且金石蚕苷浓度越大，蓝色荧光越亮。说明金石蚕苷能够诱导hela细胞凋亡，且呈剂量依赖性。
41.(3)ao/eb双荧光染色
42.吖啶橙(ao)具有膜通透性，能透过细胞膜，使核dna和rna染色，发出绿色荧光；而eb无膜通透性，只能透过细胞膜受损的细胞，与核dna结合后发出橘红色荧光，当两者联用时，绿色且细胞形态正常的则为活细胞，绿色但呈固缩状则为早凋细胞，当核染色呈现橘红色且细胞核呈固缩状，则为晚凋细胞；因此可以通过双染来区分细胞的状态。
43.ao/eb双染细胞凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司，具体操作步骤如下：
44.染色缓冲液的配制：试剂c由无菌去离子水10倍稀释。
45.胰酶消化hela细胞，制成细胞悬液，细胞数为5
×
105个/ml，准备洁净的6孔板，每孔中加入1ml细胞悬液，培养24h。分组处理，实验组分别加入50μm、100μm的含药完全培养基2ml，对照组加入完全培养基2ml，重复3孔，培养24h。
46.消化收集细胞，用0.5ml染色缓冲液重悬细胞。加入5μl ao染色液和5μl eb染色液，混匀后，于4℃条件下，锡箔纸包裹孵育15min。取洁净且无菌的载玻片，将抗荧光淬灭剂滴在载玻片上，再滴加上5μl细胞悬液，轻轻盖上盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。
47.荧光显微镜结果如图6，对照组细胞呈现绿色，与对照组细胞相比，给药组在不同浓度金石蚕苷处理hela细胞后，细胞核被染色成为黄色或者橘黄色，并且细胞有的呈念珠
状，细胞膜呈固缩状，该现象与细胞凋亡有关，表明金石蚕苷能够诱导hela细胞凋亡。
48.(4)细胞周期分析
49.为了明确金石蚕苷对hela细胞周期的影响，采用不同浓度(50μm、100μm)的金石蚕苷处理hela细胞后用pi染色法检测了细胞周期分布。具体操作步骤如下：
50.收集细胞，细胞浓度为5
×
105个/ml，将细胞悬液移取至6孔板中，培养24h。分组处理，吸去旧培养液，给药组分别加入50μm、100μm含金石蚕苷的完全培养基2ml，对照组加入完全培养基2ml，重复3孔，于培养箱中培养24h。
51.胰酶消化hela细胞，使细胞浓度为5
×
106个/ml，用4℃的pbs缓冲液润洗2次，0.5ml pbs缓冲液重悬细胞，均匀吹打，缓缓滴加乙醇，边加边涡旋，防止细胞成团，4℃条件下，固定过夜。取5
×
106个细胞，放在锥形离心管中，1000g离心10min，弃上清，收集细胞。用4℃的pbs缓冲液润洗2次，0.5ml pbs缓冲液重悬细胞。加入rnase a溶液20μl，37℃水浴30min，1000rpm离心10min，弃上清，收集细胞，加入0.4ml pi(碘化丙啶)染液重悬细胞，混匀后，4℃避光孵育40min，流式细胞仪检测。
52.结果如图7所示，金石蚕苷浓度分别为50μm和100μm作用于hela细胞24h后，与对照组(42.84％)对比，金石蚕苷在g0/g1期dna含量分别增加为46.8％和49.3％。由此可知金石蚕苷刺激hela细胞后，会将细胞周期停滞在g0/g1期，导致细胞增殖生长受到抑制，最终诱导细胞凋亡。
53.(5)annexin v-fitc/pi双染法检测细胞凋亡
54.为探究金石蚕苷对细胞凋亡的影响，采用不同浓度的金石蚕苷作用于hela细胞后用annexin v-fitc/pi检测了细胞凋亡，通过计算早期凋亡和晚期凋亡的总和来分析细胞凋亡。
55.具体操作步骤如下：
56.收集hela细胞，使细胞数为5
×
105个/ml，种于6孔板中，培养24h。分组处理，给药组分别加入50μm、100μm含金石蚕苷的完全培养基2ml，对照组加入完全培养基2ml，重复3孔，培养24h。
57.使用不含edta的胰酶消化培养后的hela细胞，4℃的pbs缓冲液润洗2次。用0.4ml结合液将细胞吹匀，使细胞浓度为1
×
106个/ml。加入5μl annexin v染色液，摇晃均匀，4℃条件下，锡箔纸包裹孵育15min。加入5μl pi染色液，吹打均匀，4℃条件下，锡箔纸包裹孵育5min，流式细胞仪检测。
58.结果如图8所示，金石蚕苷浓度分别为50μm和100μm作用于hela细胞24h后，与对照组对比，金石蚕苷对hela细胞的凋亡率分别为10.43％和11.04％。
59.(6)hela细胞中活性氧的测定
60.为了研究金石蚕苷对hela细胞中ros水平的影响，采用流式细胞仪检测了不同浓度金石蚕苷作用于细胞后ros含量的变化。具体操作步骤如下：
61.dcfh-da工作液配制：用无血清培养基将活性氧ros荧光探针dcfh-da稀释为1/1000。
62.(1)收集hela细胞，细胞数为5
×
105个/ml，种于6孔板中，培养24h。分组处理，给药组分别加入50μm、100μm含金石蚕苷的完全培养基2ml，对照组加入完全培养基2ml，阴性组加入完全培养基2ml，重复3孔，培养24h。收集细胞，阴性组细胞用无血清培养基重悬，其他
组细胞用dcfh-da工作液制成细胞悬液，使细胞浓度为1
×
106个/ml，室温条件下，锡箔纸包裹孵育20min。基础培养基洗涤细胞3次后重悬细胞，流式检测结果。
63.(2)同时调整细胞密度为5
×
104个/ml，每孔100μl接种于96孔板中，培养24h。设置对照组(对照组加入完全培养基)、不同浓度的金石蚕苷给药组(50μm、100μm)以及n-乙酰-l-半胱氨酸(nac) 金石蚕苷给药组(nac 药物组中，预先加入1ml 10mm的nac预处理1小时后，再加入1ml不同浓度的金石蚕苷溶液，使得nac终浓度为5mm，金石蚕苷终浓度为50μm、100μm。)培养24h，去除细胞培养基，用pbs缓冲液洗细胞2次，每孔加入0.2ml dcfh-da工作液，室温条件下，锡箔纸包裹孵育20min，酶标仪检测结果。
64.结果如图9显示，金石蚕苷浓度分别为50μm和100μm作用于hela细胞24h后，与对照组(ros含量为53.4％)对比，金石蚕苷给药组细胞内的ros含量分别为82.4％和87.4％，说明金石蚕苷的加入提高了hela细胞内ros含量。加入抗氧化剂n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)后，胞内ros含量有不同程度下降，与对照组对比具有显著性差异(p《0.01)。可知金石蚕苷刺激细胞后可诱导细胞内ros水平提高，从而诱导细胞凋亡。
65.实施例3：金石蚕苷对hela细胞氧化应激通路中keap1和nrf2蛋白含量的影响
66.keap1-nrf2信号通路在保护细胞免受氧化应激损害方面发挥着重要作用。细胞为了对抗ros会启动一系列抗氧化的信号通路，以减弱ros对细胞的损害。nrf2是抗氧化应激的关键因子，nrf2的激活受keap1的严格调控。
67.核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司，具体操作步骤如下：
68.(1)细胞总蛋白提取
69.弃去6孔板中培养基，加入预冷的pbs缓冲液，洗涤分别经实施例2的50μm、100μm金石蚕苷处理的hela细胞2次，冰上操作，洗涤后每孔加入1ml预冷的pbs缓冲液浸没细胞，将细胞用细胞刮刀轻柔地刮出来，放至2ml离心管中，低速离心5min，弃去上清，每管加100μl提前配制好的裂解液(ripa:pmsf体积比(ml:ml)99:1，购于上海碧云天生物技术有限公司)，冰上裂解15min，低温高速离心10min，收集上清液，得细胞总蛋白。
70.(2)细胞核蛋白提取
71.弃去6孔板中培养基，用预冷的pbs缓冲液洗3次，低速离心10min，弃上清，留下分别经实施例2的50μm、100μm金石蚕苷处理的hela细胞沉淀备用。每20μl沉淀加入200μl提取液a(每200μl蛋白提取液a加入1μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后得到提取液a，置冰上备用。)吹打均匀，使细胞团分开，放置冰上，摇晃10min，低温高速离心5min，弃上清，沉淀用pbs缓冲液重悬，再低温高速离心5分钟，弃上清，加入200μl预先配制好的提取液b(每200μl蛋白提取液b加入1μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后得到提取液b，置冰上备用。)在沉淀中，吹匀后涡旋，放置冰上，摇床摇晃30min，低温高速离心10min，取上清，得细胞核蛋白。
72.(3)蛋白含量测定
73.bca蛋白定量试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司。
74.配制bca工作液；稀释标准品；每孔加入1μl或者2μl的待测蛋白后，加入pbs缓冲液补足20μl；向各孔加入0.2ml bca工作液，放置37℃烘箱中孵育30min；取出96孔板，摇晃均匀，酶标仪检测结果，于λ＝562nm处测定吸光值，计算出蛋白浓度。
75.蛋白变性：加入5
×
上样缓冲液，100℃煮沸10min，使蛋白变性，保存于-20℃中。
76.(4)电泳步骤
77.配胶：将下层胶配置液加入到50ml离心管中，颠倒混匀。将配制好的下层胶溶液用1ml长枪头缓慢地加入到玻璃板中，小心的注入，避免产生气泡，再用超纯水进行液封40min，待凝固后，取上层胶配制液加入到50ml离心管中，颠倒混匀。小心地倒出超纯水，用吸水纸将残留的超纯水吸净，将上层胶缓缓加入玻璃板中，使液面超过玻璃板，垂直插上10孔梳子，待上层胶凝固后，可直接进行实验，如果隔天使用则置于4℃放入电泳液中浸泡。
78.上样：将5
×
上样缓冲液加入蛋白样品，煮沸10min，贴上封口膜，防止ep管爆开漏液。将蛋白样品进行涡旋，高速涡旋5s。按照长玻璃在外侧，短玻璃在内侧，安装电泳装置；缓缓加入电泳缓冲液，缓冲液没过电泳槽，垂直拔出梳子，上样，使用上样枪头，插入上样孔中，不要扎入胶内，缓慢上样。marker孔加入3μl，上样完毕后再补满电泳液，上层胶恒压电泳，设定参数为(恒压80v；30min)，设置下层胶恒压电泳，设定参数为(恒压120v；60min)，跑至距长板底部0.5cm处停止电泳。
79.切胶：打开两块玻璃板，记住上样顺序，根据marker的痕迹，将胶放在电泳液中，将含有目的蛋白的胶切下，根据胶的大小剪pvdf膜。
80.转膜：将pvdf膜提前在甲醇中激活，活化1min。电转槽中加入电转液，用电转液润湿转印滤纸，采用三明治法，在电泳槽中加入冰袋(电转过程中热量较大)，将电转槽放入含有冰块的冰盒中，恒流转膜，设置参数为(恒流300ma，70min)，根据目的蛋白分子量的大小进行时间的调整。
81.封闭：将条带放置盒内，用5％牛血清白蛋白(bsa)浸没过条带，冰上封闭1h。封闭结束后，用tbst缓冲液(取2.42g三羟甲基氨基甲烷，8g nacl，1ml吐温-20定容至1l，即得；下同)清洗条带3次，每次10min。
82.封闭及一抗杂交：配制好含5％脱脂奶粉的tbst封闭液(每个条带约用3ml)。把膜取出，用镊子把pvdf膜放进手套中，根据marker的位置，用剪刀将膜剪成不同的条带，将条带取出，放入含有封闭液的转膜盒中，放置摇床上，冰上封闭50min；倾出封闭液，用tbst缓冲液润洗3遍，每次5min；一抗杂交(5％脱脂奶粉)，从-20℃冰箱中取出待用抗体(稀释比例1:1500)，4℃摇床过夜。
83.二抗杂交：回收一抗，tbst缓冲液润洗3次，每次10min；二抗杂交(tbst)，50min，抗体(稀释比例1:5000)；弃去二抗杂交液，tbst缓冲液润洗3次，每次5min；
84.显影：倾出tbst缓冲液，将购于affinity公司的ecl化学发光显影液中i液和ii液按体积比(ml:ml)1:1混匀，直接加于膜表面。
85.由图10可知，金石蚕苷作用于hela细胞24h后，可导致keap1蛋白表达量上调，核内nrf2蛋白表达量下降，提示金石蚕苷能够诱导细胞核nrf2蛋白水平下降，使keap1-nrf2信号通路失活，从而导致抗氧化酶表达量减少，细胞中ros水平增多，最终细胞无法对抗过多的ros，导致细胞死亡。
86.实施例4：金石蚕苷对hela细胞中bax、bcl-2、casepase-3、cleaved casepase-3蛋白表达影响
87.细胞凋亡的重要途径之一是线粒体途径。bcl-2家族的成员与该途径的调节密切相关，其中促凋亡蛋白bax和抗凋亡蛋白bcl-2的平衡能够决定细胞是否会发生凋亡。具体操作步骤同实施例3。
88.由图11可知，金石蚕苷作用于hela细胞后，与对照组相比较，bax/bcl-2比例明显上升，呈现明显剂量依赖性；cleaved caspase-3蛋白含量增加，caspase-3含量降低。因此推测：由于ros的大量产生，可以激活线粒体途径的凋亡发生。金石蚕苷主要通过激活促凋亡蛋白bax并且抑制抗凋亡蛋白bcl-2活性，促使bax/bcl-2比例上调，使caspase-3活化为cleaved caspase-3，导致线粒体损伤，从而诱导细胞凋亡。
89.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。