一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法

1.本发明涉及数字核酸检测领域，更具体地，涉及一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法。


背景技术：

2.核酸检测在病原体感染的鉴定、遗传分析与遗传疾病的诊断上起着核心的作用。在生物样本中，核酸数量往往非常低，因此需要通过核酸扩增实验来大大增加目标核酸数量。其中，聚合酶链式反应(pcr)最为常见。基于此反应，研究者开发了实时荧光定量pcr(qpcr)，是目前主流的核酸定量方法。然而，该方法是一种依赖于标准曲线或者标准品才能确定目标核酸量的相对定量技术，在建立标准曲线时费时费力，极易收到人为因素以及环境因素的干扰。
3.数字pcr(dpcr)是一种无需标准曲线、可实现绝对定量的技术，其中数字液滴pcr(ddpcr)最为常见。该技术主要由三个环节组成：核酸分散、pcr扩增和信号读取，每个环节需要一个专门的设备。ddpcr中，通常利用微流控技术产生数以万计、大小均一且确定的油包水液滴，核酸被多倍稀释并分散至这些液滴中，以致于每个液滴中包含0或1个核酸。随后，每个液滴同时参与pcr反应，可在常规的pcr仪器上完成，含有核酸的液滴将会发出荧光。扩增结束后，通常采用流式的策略读取每个液滴的荧光信号，并统计阴阳性液滴数量。由于每个液滴中包裹的核酸分子数量服从泊松分布，可估算出样本中目标核酸数量。在ddpcr领域，美国伯乐公司的产品较为成熟，国内的新翌公司等，也有产品上市，这些产品大都包括一台液滴生成仪和一台液滴读取仪，分别专门实现核酸分散与信号读取环节，造价昂贵，限制了其推广。
4.基于数字液滴pcr灵敏度高、可实现绝对定量的优点，许多研究致力于简化液滴生成与信号采集设备，提高数字核酸检测的易获得性和便携性。为了简化液滴的生成并降低其成本，北京大学黄岩谊教授课题组提出使用微通道阵列配合离心机，生成大小均一的液滴。加州大学的一个课题组提出使用颗粒物作为模板，加入到混合液中，然后通过震荡混合器来产生液滴，颗粒物模板提高了震荡得到液滴大小的均一性，得到较为均一的微液滴。他们还使用基于压电喷墨的商用打点机生成大量的微液滴，实现了ddpcr。上海交通大学一个课题组使用slipchip完成样本与试剂混合液的高效率分散，并开发了配套的设备进行扩增和信号读取。
5.为了降低液滴读取的成本，研究人员们提出了许多新的方法。imagej和cellprofiler等开源的图像处理软件已被广泛用于液滴图像的处理中。浙江大学一个课题组提出使用卷积神经网络的机器视觉方法，进行更精准的图像分割与信号判定。北京大学一个课题组搭建了立体扫描的光路，实现了大量液滴的高速读取。加州大学旧金山分校一个课题组提出使用酶标仪、qpcr仪等仪器对大量液滴进行同时读取，虽然失去了数字核酸检测绝对定量的优势，但是利用了大体积检测的通量读取的优势，并提高了其准确性。
6.这些新方法虽然在一定程度上降低了数字核酸检测的技术门槛与成本，但是依然
在技术上依赖于大小均一的液滴或腔室，这一苛刻的前提条件对技术的开发与推广造成了较大的限制。使用非均一体积的液滴实现数字核酸检测，是降低液滴生成环节成本的很有前景的解决方案。
7.加州理工大学一个课题组设计了具有不同体积微井的阵列，并对非均一体积的数字核酸检测方法进行了系统的实验和理论分析，结果表明小体积微井阵列可以降低检测下限，而大体积微井阵列可以提高检测动态范围。他们用这个方法成功地开发了用于检测hiv病毒和乙肝病毒的slipchip。美国华盛顿州智创实验室的课题组使用涡旋振荡的方法生成非均一体积的液滴，完成扩增后检测阳性液滴的数目，然后利用统计模型对结果进行修正，从而完成核酸浓度的定量检测。他们将类似的方法也用于细菌的定量检测。华盛顿大学的一个课题组使用涡旋振荡的方法生成非均一体积的液滴，待pcr完成后，使用激光共聚焦显微镜对液滴进行拍照，获得液滴的体积，然后使用最大似然估计的方法求解以阳/阴性和液滴体积为参数的泊松方程，得到待测样本的浓度。上述工作证明了利用非均一体积液滴完成数字核酸检测的可行性，但是这些方法依然有一些不足。首先，定量检测的方法依赖于荧光成像，对设备提出了较高的要求。其次，扩增依赖于pcr，需要准确控温的热循环仪器，难以在资源受限的环境下应用。
8.现有的技术中，中国发明专利公开了一种核酸分析装置及核酸定量方法，包括电路板、感测芯片、微孔阵列、温度控制元件以及微流体元件。感测芯片配置于电路板上且包括多个图像传感器。微孔阵列配置于感测芯片上且包括多个微孔。各微孔对应于一个或多个图像传感器。温度控制元件配置于电路板上。微流体元件配置于微孔阵列上且包括微流道。微流道与各微孔相连通。微流体元件与感测芯片分别位于微孔阵列的相对两侧，但是其需要生成大小均一、预设的液滴，且需荧光成像，操作难度比较大。


技术实现要素：

9.本发明为解决现有的核酸定量方法需要专门的液滴生成设备生成大小均一、预设的液滴以及需要专门的荧光成像系统读取荧光信号的技术缺陷，提供了一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法。
10.为实现以上发明目的，采用的技术方案是：
11.一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法，包括以下步骤：
12.s1：生成非均一液滴，并进行等温扩增；
13.s2：让液滴在微通道中流动，并录制液滴在微通道中流动的视频；
14.s3：构建基于区域卷积神经网络的图像分割模型，并进行训练；
15.s4：将录制好的视频输入训练完成后的图像分割模型中，训练完成后的图像分割模型自动对视频图像进行分割与识别，得到核酸检测结果。
16.上述方案中，不需要荧光成像与读取设备，而利用微流控技术生成的观察芯片，使液滴流过毫米宽的通道并进行明场成像；以沉淀物代替荧光作为液滴阴阳性状态的指示，得到液滴状态与面积参数等数据；将图像处理算法输出的数据代入基于泊松分布的核酸浓度计，得到目标核酸浓度。
17.优选的，在步骤s1中，在步骤s1中，生成体积非均一液滴，其阴性液滴个数为m，且体积为v-,i
(0《i《＝n)；阳性液滴个数为n，且体积为v
,j
(0《j《＝n)；利用最大似然估计，其浓
度c满足以下公式：
[0018][0019]
之后对不同浓度的核酸样本进行扩增。
[0020]
上述方案中，环介导等温扩增是一种类似于pcr的核酸扩增方法，具有可以在恒温下进行核酸扩增、扩增过程中产生可见沉淀等优点。扩增反应进行时，游离的dntp与核酸单链结合，脱落下来的焦磷酸根离子与lamp试剂中的镁离子结合生成焦磷酸镁沉淀。
[0021]
优选的，所述阴性液滴为不含核酸的液滴；所述阳性液滴为含有核酸的液滴。
[0022]
优选的，在步骤s2中，让扩增后的液滴在微通道中流动，对液滴分别进行明场与荧光场的录制，越高浓度的样本中出现沉淀的频率越高，且荧光与沉淀呈现一一对应的关系；低荧光强度范围聚集的大多数为无沉淀液滴，而高荧光强度范围聚集的大多数为有沉淀液滴。
[0023]
优选的，在步骤s3中，卷积神经网络是掩膜区域卷积神经网络结构的一部分；掩膜区域卷积神经网络不仅预测出每个感兴趣区域的类别和边界框，还在目标的像素级位置上生成掩膜；利用mask r-cnn作为图像分割模型，其主干模型为resnet-50模型，在模型训练中，使用了学习率为0.0005的随机梯度下降优化算法，原始图像、相关的标签和掩码信息形成了mask r-cnn模型的训练和测试数据；还使用了imgaug图像增广工具，对每个训练批量即时执行增广操作。
[0024]
优选的，在步骤s4中，包括以下步骤：
[0025]
s41：将液滴流动视频，作为图像分割模型的输入；
[0026]
s42：图像分割模型根据有无沉淀物这一判断条件，对视频图像中的阴阳性液滴进行自动分割与识别；
[0027]
s43：算法输出检测完成的视频，标记出液滴的类型以及边界，并且得到包含液滴阴阳性参数与面积大小的数据文件；
[0028]
s44：根据液滴阴阳性参数与面积大小的数据文件得到核酸浓度。
[0029]
优选的，在步骤s41中，先录制好不同核酸浓度的视频，从每个视频中随机抽取帧，共抽取了638帧；使用labelme标注工具手动圈出液滴的边界并打上对应分类标签，若液滴中含肉眼可见的絮状沉淀，则标注为“阳性”，对应生成红色掩膜；否则为阴性，对应生成绿色掩膜。
[0030]
优选的，在步骤s42中，由区域提议网络扫描图像并生成提议，首先在每个像素点生成不同大小和形状的锚框，之后筛选出含有物体且位置和大小更为精准的锚框作为提议；将提议与特征图对齐，由卷积神经网络对其进行分类并生成边界框和掩膜。
[0031]
优选的，在步骤s43中，模型训练完成后，将录制好的视频输入掩膜区域卷积神经网络中，对视频图像中的液滴进行分割与识别，得到检测后的视频，以及包含液滴大小与状态信息的json格式文件。
[0032]
优选的，在步骤s44中，将json格式文件作为核酸浓度计算的输入，首先进行面积到体积的转换，最后代入最大似然估计得到的求解公式，得到核酸浓度。
[0033]
上述方案中，本方法结合了图像处理与环介导等温扩增，实现了明场条件下基于
非均一液滴的即时数字核酸检测，免去了专门的液滴生成仪器与荧光读取仪器，大大降低了成本，且操作便捷；使用均匀液滴对算法分割与识别的效果进行验证。使用聚焦流动的微流控芯片产生大小确定并且体积均匀的液滴，第一批用于标准的ddlamp中，用基于均一液滴的核酸浓度计算模型得到金标准。第二批则输入方法中进行液滴分割与分类，并将结果代入基于非均一液滴的核酸浓度计算模型中。两个结果之间非常接近；之后使用非均一液滴对基于非均一液滴的核酸浓度计算模型进行验证。将具有已知浓度的标准品作为样本，并利用涡旋产生液滴，用图像处理算法进行分割与识别，高浓度呈现良好的线性关系。
[0034]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0035]
本发明提供的一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法，不需要荧光成像与读取设备，而利用微流控技术生成的观察芯片，使液滴流过毫米宽的通道并进行明场成像；以沉淀物代替荧光作为液滴阴阳性状态的指示，得到液滴状态与面积参数等数据；将图像处理算法输出的数据代入基于泊松分布的核酸浓度计，得到目标核酸浓度。
附图说明
[0036]
图1为本发明的方法流程图；
[0037]
图2为本发明的荧光与沉淀对应关系图；
[0038]
图3为本发明的荧光与沉淀具有强相关性示意图；
[0039]
图4为本发明的均匀体积假设计算的单均匀乳液测量结果、非均匀体积假设计算的单均匀乳液结果，以及采用非均匀乳液测量结果示意图；
[0040]
图5为本发明的由不同相机拍摄的代表性原始显微照片和相应的处理后的示意图；
[0041]
图6为本发明的不同相机的测量结果示意图；
[0042]
图7为本发明的使用不同涡旋时间下不同浓度的标准进行校准测量示意图；
[0043]
图8为本发明的基于掩膜区域卷积网络的液滴分割与识别模型示意图；
[0044]
图9为本发明的基于非均一液滴的数字等温扩增核酸定量实验流程图。
具体实施方式
[0045]
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；
[0046]
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
[0047]
实施例1
[0048]
如图1～图7所示，一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法，包括以下步骤：
[0049]
s1：生成非均一液滴，并进行等温扩增；
[0050]
s2：让液滴在微通道中流动，并录制液滴在微通道中流动的视频；
[0051]
s3：构建基于区域卷积神经网络的图像分割模型，并进行训练；
[0052]
s4：将录制好的视频输入训练完成后的图像分割模型中，训练完成后的图像分割模型自动对视频图像进行分割与识别，得到核酸检测结果。
[0053]
上述方案中，不需要荧光成像与读取设备，而利用微流控技术生成的观察芯片，使液滴流过毫米宽的通道并进行明场成像；以沉淀物代替荧光作为液滴阴阳性状态的指示，
得到液滴状态与面积参数等数据；将图像处理算法输出的数据代入基于泊松分布的核酸浓度计，得到目标核酸浓度。
[0054]
优选的，在步骤s1中，在步骤s1中，生成体积非均一液滴，其阴性液滴个数为m，且体积为v-,i
(0《i《＝n)；阳性液滴个数为n，且体积为v
,j
(0《j《＝n)；利用最大似然估计，其浓度c满足以下公式：
[0055][0056]
之后对不同浓度的核酸样本进行扩增。
[0057]
上述方案中，环介导等温扩增是一种类似于pcr的核酸扩增方法，具有可以在恒温下进行核酸扩增、扩增过程中产生可见沉淀等优点。扩增反应进行时，游离的dntp与核酸单链结合，脱落下来的焦磷酸根离子与lamp试剂中的镁离子结合生成焦磷酸镁沉淀。
[0058]
优选的，所述阴性液滴为不含核酸的液滴；所述阳性液滴为含有核酸的液滴。
[0059]
优选的，在步骤s2中，让扩增后的液滴在微通道中流动，对液滴分别进行明场与荧光场的录制，越高浓度的样本中出现沉淀的频率越高，且荧光与沉淀呈现一一对应的关系；低荧光强度范围聚集的大多数为无沉淀液滴，而高荧光强度范围聚集的大多数为有沉淀液滴。
[0060]
如图2所示，可以看出越高浓度的样本中出现沉淀的频率越高，且荧光与沉淀呈现一一对应的关系。
[0061]
如图3所示，可以看到低荧光强度范围聚集的大多数为无沉淀液滴，而高荧光强度范围聚集的大多数为有沉淀液滴。如果我们以荧光强度0.3作为阈值，则可以得到，99.0％的高荧光液滴含有沉淀(真阳)，99.6％的低荧光液滴不含有沉淀(真阴)，这就证明了荧光与沉淀之间具有高度的相关性，因此沉淀可代替荧光作为可靠的阳性液滴标志物。
[0062]
优选的，在步骤s3中，卷积神经网络是掩膜区域卷积神经网络结构的一部分；掩膜区域卷积神经网络不仅预测出每个感兴趣区域的类别和边界框，还在目标的像素级位置上生成掩膜；利用mask r-cnn作为图像分割模型，其主干模型为resnet-50模型，在模型训练中，使用了学习率为0.0005的随机梯度下降优化算法，原始图像、相关的标签和掩码信息形成了mask r-cnn模型的训练和测试数据；还使用了imgaug图像增广工具，对每个训练批量即时执行增广操作。
[0063]
优选的，在步骤s4中，包括以下步骤：
[0064]
s41：将液滴流动视频，作为图像分割模型的输入；
[0065]
s42：图像分割模型根据有无沉淀物这一判断条件，对视频图像中的阴阳性液滴进行自动分割与识别；
[0066]
s43：算法输出检测完成的视频，标记出液滴的类型以及边界，并且得到包含液滴阴阳性参数与面积大小的数据文件；
[0067]
s44：根据液滴阴阳性参数与面积大小的数据文件得到核酸浓度。
[0068]
优选的，在步骤s41中，先录制好不同核酸浓度的视频，从每个视频中随机抽取帧，共抽取了638帧；使用labelme标注工具手动圈出液滴的边界并打上对应分类标签，若液滴中含肉眼可见的絮状沉淀，则标注为“阳性”，对应生成红色掩膜；否则为阴性，对应生成绿
色掩膜。
[0069]
优选的，在步骤s42中，由区域提议网络扫描图像并生成提议，首先在每个像素点生成不同大小和形状的锚框，之后筛选出含有物体且位置和大小更为精准的锚框作为提议；将提议与特征图对齐，由卷积神经网络对其进行分类并生成边界框和掩膜。
[0070]
优选的，在步骤s43中，模型训练完成后，将录制好的视频输入掩膜区域卷积神经网络中，对视频图像中的液滴进行分割与识别，得到检测后的视频，以及包含液滴大小与状态信息的json格式文件。
[0071]
优选的，在步骤s44中，将json格式文件作为核酸浓度计算的输入，首先进行面积到体积的转换，最后代入最大似然估计得到的求解公式，得到核酸浓度。
[0072]
上述方案中，本方法结合了图像处理与环介导等温扩增，实现了明场条件下基于非均一液滴的即时数字核酸检测，免去了专门的液滴生成仪器与荧光读取仪器，大大降低了成本，且操作便捷；使用均匀液滴对算法分割与识别的效果进行验证。使用聚焦流动的微流控芯片产生大小确定并且体积均匀的液滴，第一批用于标准的ddlamp中，用核酸浓度计算模型得到金标准。第二批则输入方法中进行液滴分割与分类，并将结果代入基于非均一液滴的核酸浓度计算模型中。两个结果之间非常接近；随后，我们使用非均一液滴对基于非均一液滴的核酸浓度计算模型进行验证。将具有已知浓度的标准品作为样本，并利用涡旋产生液滴，用图像处理算法进行分割与识别。结果如图4所示，高浓度呈现良好的线性关系，证明分割模型与估算公式都可靠。其动态检测范围为37.2-11000拷贝/微升，检测限为5.6拷贝/微升，检测时长为1.5-2小时。除此之外，如下图所示，本方法在不同的涡旋时间和不同的图像质量下均鲁棒性较好，结果之间并无很大差别，其如图5～图7所示。
[0073]
实施例2
[0074]
如图8所示，由于需要将沉淀物作为阳性液滴指示，因此需要建立一种新的液滴分割、分类方法。所以可以搭建基于mask r-cnn的深度学习算法，分割与识别出图像中的液滴，得到液滴的面积与阴阳性参数。
[0075]
先录制好不同核酸浓度的视频，从每个视频中随机抽取帧，共抽取了638帧。接着，使用labelme标注工具手动圈出液滴的边界并打上对应分类标签，若液滴中含肉眼可见的絮状沉淀，则标注为“阳性”，对应生成红色的掩膜(mask)，阴性液滴则为绿色掩膜。该步骤如图8(a)所示。
[0076]
mask r-cnn(掩膜区域卷积神经网络)在实例分割任务中具有良好的性能，其网络结构可以简单分为：卷积神经网络(cnn)、区域提议网络(rpn)、兴趣区域对齐层(roi)、全卷积层(fcn)。该网络不仅可以预测出每个感兴趣区域(roi)的类别和边界框，还可以在目标的像素级位置上生成掩膜(mask)。mask r-cnn框架分为两个阶段：第一阶段是扫描图像并生成提议(可能包含对象的区域)，由rpn完成，首先在每个像素点生成不同大小和形状的锚框，筛选出含有物体且位置和大小更为精准的锚框作为提议；第二阶段将提议与特征图对齐，对其进行分类并生成边界框和掩膜，主要由cnn完成。该模型流程如图8(b)所示。
[0077]
本实施例中，利用这种mask r-cnn作为图像分割模型，并将abdulla的mask r-cnn代码用于tensorflow2实现。首先，选择resnet-50为主干模型。为了加快模型训练速度，将原来为1368*1368像素的视频帧的尺寸缩小为768*768像素。除此之外，将每一张训练图像的感兴趣区域(roi)数量设置为512，以及将训练中金标准实例物体检测数量上限设置为
100。rpn中的非极大抑制阈值设为0.95，以产生足够多的提议。锚框的尺寸设为32，64，128，256，512像素，步长为4，8，16，32，64像素，长宽比为0.5，1，2。根据实验的具体情况，检测中每张图像的物体检测数量上限设置为400。
[0078]
在模型训练中，使用了学习率为0.0005的随机梯度下降优化算法。原始图像和相关的标签和掩码信息形成了mask r-cnn模型的训练(90％)和测试(10％)数据。还使用了imgaug这种图像增广工具，对每个训练批量即时执行增广操作。图像增在对训练图像进系列的随机变化之后，比如裁剪、翻转、改变颜色和亮度，生成相似但不同的训练样本，扩大了训练集的规模，从而减少模型对某些属性的依赖，提高模型的泛化能力和鲁棒性。
[0079]
模型训练完成后，将录制好的视频输入模型中，模型自动对视频图像进行分割与识别，得到检测后的视频，以及包含液滴大小与状态的json格式文件，如图8(c)所示。
[0080]
模型预测在不同阈值的测试数据上的平均精度(map)和分类的精度-召回曲线如图8(d)所示。经过训练的mask r-cnn显示出惊人的准确度，map约为88％，iou高达0.8。当iou达到0.9(预测框必须与真实框重叠90％以上)时，map由于严格要求而降低。精确率-召回率曲线也遵循相同的趋势，中到高(0.5-0.8)iou阈值提供了高精度和召回率。
[0081]
实施例3
[0082]
如图9所示，一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法的具体操作如下：
[0083]
(1)试剂准备：
[0084]
lamp试剂、核酸与对应引物、矿物油或biorad evagreeni油
[0085]
(2)非均一液滴的生成：
[0086]
利用涡旋振荡仪生成大小不均一的油包水液滴，水相是lamp试剂、dna与其引物。
[0087]
(3)等温扩增：
[0088]
油包水液滴在热循环仪中进行扩增，于63℃下扩增43分钟。
[0089]
(4)读取芯片准备：
[0090]
液滴的读取采用在微通道内成像的方法。我们将使用光刻和软刻蚀技术加工高度为约46.5μm，宽度约为800μm的微通道。通道设计有两个入口和一个出口，位于端口处的入口为油相入口，位于通道中部的入口为液滴入口。
[0091]
(5)液滴的流动视频采集：
[0092]
液滴的驱动采用手动注射的方法。首先，油相入口，通过软管与注射泵相连，注射泵持续、稳定的通油，目的是保持液滴之间的间隙，避免液滴之间太过拥挤。液滴入口处，则通过软管与手持注射器相连，软管中含有扩增后的液滴。显微镜下选择好一段适合录制的通道，开启注射泵开始通油，手慢慢推动注射器将扩增后的液滴注入微通道中，同时用10x明场显微镜录制液滴流动视频。
[0093]
(6)液滴的图像分割与识别：
[0094]
将录制好的视频作为图像算法的输入后进行分割与识别。算法将自动生成含有检测框与掩膜的视频，以及对应的json格式数据文件。视频中，检测框中是分割出的液滴，掩膜则用于标记液滴的状态与大小，阳性液滴显示红色，阴性液滴显示绿色。数据文件中，将包含液滴的面积和状态的信息。
[0095]
(7)浓度计算：
[0096]
将json格式文件作为计算模型的输入，首先进行面积到体积的转换，最后代入最大似然估计得到的求解公式，得到核酸浓度。
[0097]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。