一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种。


背景技术：

2.丝胶蛋白在家蚕茧壳中的主要蛋白之一，约占茧壳重量的20-30％。丝胶蛋白具有良好的亲水性和较低的免疫原性，已被广泛用于床上用品、贴身衣物、人造皮革类护垫等产品开发，此外，丝胶蛋白还可以与其他高分子材料混合制成功能性、可降解性的高分子材料，如人造骨钉、人造皮肤等，小分子量的丝胶水解物可以用于护肤品的制作。随着人们对丝胶蛋白的应用需求日益增加，目前常规的从普通家蚕茧壳中提取丝胶蛋白的方法不但技术繁杂，提取成本也很高，极有必要开发新的可低成本大量获取丝胶蛋白的方法。


技术实现要素：

3.基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种。
4.依据本发明技术方案的第一方面，提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，其通过在家蚕psg特异上调家蚕蜕皮激素应答因子，家蚕蜕皮激素应答因子包括bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)，使得家蚕psg不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产丝胶茧。
5.其中通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法包括以下步骤：
6.第一步、gal4/uas表达载体构建；
7.第二步、获得杂交得psg过表达的gal4/uas转基因家蚕；
8.第三步、通过对杂交得psg过表达的gal4/uas转基因家蚕的丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
9.第四步、通过对psg特异的gal4/uas转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
10.第五步、通过对psg特异的gal4/uas转基因家蚕的丝腺进行dna提取，提取成功的dna根据设计的引物进行pcr扩增，扩增结果进行核酸电泳；根据设计引物的大小与扩增出来的大小一致，说明转基因成功。
11.其中，gal4/uas表达载体构建包括构建了1种家蚕psg特异gal4表达载体，载体目的基因表达框包括：家蚕fibh基因启动子(seq id no.7)(seq id no.7)；目的基因为编码gal4蛋白结合结构域的基因序列即gal4bd(seq id no.8)；vp16为激活基因表达的蛋白结
no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)转基因家蚕的丝腺结果图；
22.附图3为psg特异性的gal4/uas过表达bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕的茧壳示意图；
23.附图4为psg特异性的gal4/uas过表达bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)转基因家蚕的基因组鉴定结果图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术方案的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术方案的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体结构或部件或具体参数。
25.本发明基于蜕皮激素是调控昆虫生长发育和变态的关键激素，在家蚕中蜕皮激素对丝腺生长发育和丝蛋白合成具有非常重要的调控作用。通过基因调控蜕皮激素应答因子的表达，可影响家蚕丝腺的发育，进而控制丝蛋白的表达与合成。通过对蜕皮激素相关应答因子的改造利用，有望开发出丝胶茧家蚕品种，促进丝胶蛋白的规模化和低成本生产。
26.本发明提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种，本发明通过在家蚕psg特异上调家蚕蜕皮激素应答因子(包括bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6))使家蚕psg不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，该方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产薄茧(丝胶茧)，丝胶蛋白含量可达90％以上。有关研究表明，丝胶可以广泛用于床上用品、贴身衣物、人造皮革类护垫等商品；同样还可以与其他高分子材料混合制成功能性、可降解性的高分子材料，如人造骨钉、人造皮肤等；小分子量的丝胶水解物可以用于护肤品的制作，因此本发明提供的大规模生产丝胶方法具有很高的应用价值。
27.本发明通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种，其主要基于gal4/uas双元表达系统创制一种后丝退化，丝素蛋白合成受阻的转基因方法；还利用所述方法制作转基因家蚕品种，使其只生产不同程度的丝胶茧以便于大规模生产丝胶蛋白。
28.本发明的通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，包括以下步骤：
29.第一步、gal4/uas表达载体构建：
30.构建了1种家蚕psg特异gal4表达载体。载体目的基因表达框包括:启动子为fibh(seq id no.7)；目的基因为编码gal4蛋白结合结构域的基因序列即gal4bd(seq id no.8)；vp16(seq id no.9)为增强子(seq id no.9)；ser1-polya为终止信号(seq id no.10)，将目的表达框插入到piggybac载体骨架上即pbac[3
×
p3-dsred]。该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3
×
p3-dsred序列(seq id no.11)，该序列是由3倍重复的p3启动子
(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了dsred(红色荧光蛋白)序列组成；随后在3
×
p3-dsred序列(seq id no.11)5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.12)和piggybac左臂(seq id no.13)，筛选标记为眼睛发红色荧光。
[0031]
分别构建了6种uas表达载体：所述载体目的基因表达框包括：与gal4蛋白结合的10
×
uas序列(seq id no.14)；6种家蚕蜕皮激素应答因子即bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)为目的基因；ser1-polya为终止信号(seq id no.10)，将目的表达框插入到piggybac载体骨架上即pbac[3
×
p3-ecfp]。该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3
×
p3-ecfp序列(seq id no.15)，该序列是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了ecfp(青色荧光蛋白)序列组成；随后在3
×
p3-ecfp序列(seq id no.15)5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.12)和piggybac左臂(seq id no.13)，筛选标记为眼睛发青色荧光。
[0032]
第二步、获得杂交得psg过表达的gal4/uas转基因家蚕；
[0033]
具体包括：将gal4/uas表达载体通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的gal4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的uas转基因家蚕，将gal4转基因家蚕分别与uas转基因家蚕进行两两杂交，获得6种眼睛即发红色荧光也发青色荧光的psg过表达的gal4/uas转基因家蚕。
[0034]
第三步、通过对杂交得psg过表达的gal4/uas转基因家蚕的丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；具体为：通过对上述6种psg特异过表达的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
[0035]
第四步、通过对psg特异的gal4/uas转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；具体为：通过对上述psg特异的gal4/uas转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
[0036]
第五步、通过对psg特异的gal4/uas转基因家蚕的丝腺进行dna提取，提取成功的dna根据设计的引物进行pcr扩增，扩增结果进行核酸电泳；具体为：通过对上述6种psg特异的gal4/uas转基因家蚕的5l6d丝腺进行dna提取，提取成功的dna根据设计的引物进行pcr扩增，扩增结果进行核酸电泳。根据设计引物的大小与扩增出来的大小一致，说明转基因成功。
[0037]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0038]
实施例1，其为家蚕psg特异性gal4/uas表达载体的构建，构建一种后部丝腺特异的gal4系统，过表达6种家蚕蜕皮激素应答因子即bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)的uas表达系统，其包括以下步骤：
[0039]
步骤s1构建psg特异的gal4表达载体：
[0040]
依次将家蚕fibh基因启动子序列(seq id no.7)与gal4bd基因序列(seq id no.8)、增强子vp16序列(seq id no.9)及终止信号ser1-poly a(seq id no.10)串联形成目的基因表达框，通过利用asci将骨架载体pbac[3
×
p3-dsred]和目的基因表达框切开，通过t4链接酶进行链接，成功构建家蚕psg特异性gal4的表达载体并命名为hg4。
[0041]
步骤s2构建以bmecra(seq id no.1)为目的基因的uas表达载体：
[0042]
uas串联的过表达基因表达框依次为：10
×
uas序列(seq id no.14)，bmecra(seq id no.1)为目的基因，ser1-polya为终止信号(seq id no.10)，通过利用fsei和bgiii将骨架载体pbac[3
×
p3-ecfp]和目的基因表达框切开，通过t4链接酶进行链接，最终形成uas过表达载体。
[0043]
步骤s3构建以bmusp(seq id no.2)为目的基因的uas表达载体
[0044]
基本与步骤s2相同；与步骤s2不同的是，目的基因为bmusp(seq id no.2)，其余均与步骤2一致。
[0045]
步骤s4构建以bme74(seq id no.3)为目的基因的uas表达载体：
[0046]
基本与步骤s2相同；与步骤s2不同的是，目的基因为bme74(seq id no.3)，其余均与步骤2一致。
[0047]
步骤s5构建以bmhr4(seq id no.4)为目的基因的uas表达载体
[0048]
基本与步骤s2相同；与步骤s2不同的是，目的基因为bmhr4(seq id no.4)，其余均与步骤2一致。
[0049]
步骤s6构建以bmhr3(seq id no.5)为目的基因的uas表达载体
[0050]
基本与步骤s2相同；与步骤s2不同的是，目的基因为bmhr3(seq id no.5)，其余均与步骤2一致。
[0051]
步骤s7构建以bmftz-f1(seq id no.6)为目的基因的uas表达载体
[0052]
基本与步骤s2相同；与步骤s2不同的是，目的基因为bmftz-f1(seq id no.6)，其余均与步骤2一致。
[0053]
实施例2，其为gal4/uas转基因家蚕的制作，分别制作了过表达bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)的gal4/uas转基因家蚕，其包括以下步骤：
[0054]
步骤s21转基因注射及荧光筛选：
[0055]
将构建成功的家蚕后部丝腺特异性gal4/uas表达载体，分别与辅助质粒(a4helper)以浓度450ng/μl(纳克每微升)进行等比例混合，通过eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕nistari(一年内可以饲养多批次蚕种材料)为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4度放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的g0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的g0代蚕蛾，通过自交或回交得到g1代(注射第二代)蚕卵，用olympus荧光显微镜筛选，分别得到命名为bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)青色荧光的uas转基因蚕及并命名为hg4的红色荧光的gal4转基因家蚕的蛾圈。并通过饲养一代后正常保种。
[0056]
步骤s22过表达bmecra(seq id no.1)转基因家蚕的制作：
[0057]
通过将hg4转基因家蚕与bmecra(seq id no.1)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果
如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0058]
步骤s23过表达bmusp(seq id no.2)转基因家蚕的制作：
[0059]
通过将hg4转基因家蚕与bmusp(seq id no.2)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0060]
步骤s24过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕的制作：
[0061]
通过将hg4转基因家蚕与bme74(seq id no.3)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0062]
步骤s25过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕的制作：
[0063]
通过将hg4转基因家蚕与bmhr4(seq id no.4)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0064]
步骤s26过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕的制作：
[0065]
通过将hg4转基因家蚕与bmhr3(seq id no.5)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0066]
步骤s27过表达bmftz-f1(seq id no.6)转基因家蚕的制作：
[0067]
通过将hg4转基因家蚕与bmftz-f1(seq id no.6)的uas转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕，结果如附图1所示，证明gal4/uas转基因家蚕制作成功。
[0068]
实施例3，psg特异性的gal4/uas过表达转基因家蚕丝腺表型观察，其包括以下：
[0069]
步骤s31 psg特异过表达bmecra(seq id no.1)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0070]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmecra(seq id no.1)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bmecra(seq id no.1)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0071]
步骤s32 psg特异过表达bmusp(seq id no.2)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0072]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmusp(seq id no.2)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bmusp
(seq id no.2)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0073]
步骤s33 psg特异过表达bme74(seq id no.3)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0074]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bme74(seq id no.3)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bme74(seq id no.3)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0075]
步骤s34 psg特异过表达bmhr4(seq id no.4)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0076]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr4(seq id no.4)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bmhr4(seq id no.4)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0077]
步骤s35 psg特异过表达bmhr3(seq id no.5)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0078]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr3(seq id no.5)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bmhr3(seq id no.5)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0079]
步骤s36 psg特异过表达bmftz-f1(seq id no.6)的gal4/uas转基因家蚕的丝腺表型观察：
[0080]
饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmftz-f1(seq id no.6)的gal4/uas转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的gal4/uas转基因家蚕至五龄，通过在1
×
pbs的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕nistari和psg特异特异过表达bmftz-f1(seq id no.6)的gal4/uas转基因家蚕的五龄第六天(5l6d)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
[0081]
实施例4，其为如图3所示结果为psg特异过表达gal4/uas转基因家蚕的蚕茧观察，其包括以下：
[0082]
步骤s41 psg特异过表达bmhr3(seq id no.5)的gal4/uas转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕至上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察nistari和过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
[0083]
步骤s42 psg特异过表达bmhr4(seq id no.4)的gal4/uas转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕至
上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察nistari和过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
[0084]
步骤s43 psg特异过表达bme74(seq id no.3)的gal4/uas转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕nistari和psg特异过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕至上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察nistari和过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
[0085]
实施例5，其包括psg特异过表达gal4/uas转基因家蚕的鉴定，主要包括psg特异过表达bmecra(seq id no.1)、bmusp(seq id no.2)、bme74(seq id no.3)、bmhr4(seq id no.4)、bmhr3(seq id no.5)、bmftz-f1(seq id no.6)的转基因家蚕的基因组鉴定。
[0086]
其中，psg特异性的gal4/uas过表达bmecra(seq id no.1)转基因家蚕的分子鉴定包括步骤：
[0087]
步骤s51、解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmecra(seq id no.1)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0088]
步骤s52、将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取步骤如下：
[0089]
(1)将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2小时-3小时。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5ml的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。
[0090]
(2)将1ml的dna抽提buffer缓冲液加入离心管中，3000rpm涡旋混匀。按100μl/ml(微升每毫升)的工作浓度加入rna酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶k，55℃水浴消化过夜。
[0091]
(3)将等体积的tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μl(微升)上清液至新的离心管中。
[0092]
(4)将600μl tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。
[0093]
(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。
[0094]
(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。
[0095]
(7)用无菌枪头小心挑出沉淀后转移至新的1.5ml离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1次-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。
[0096]
(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30μl-50μl te缓冲液溶解dna沉淀。
[0097]
(9)利用分光光度计检测dna纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。
[0098]
步骤s53基因组pcr：
[0099]
(1)利用primer5软件设计引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。
[0100]
(2)以上述提取的基因组为模板进行pcr扩增目的片段，反应体系如下：
[0101]
基因组dna 1μl；
[0102]
dntp(脱氧核糖核苷三磷酸) 0.8μl；
[0103]
hifi taq酶 0.1μl；
[0104]
正反向引物 各0.2μl；
[0105]
缓冲液
ⅰꢀ
1μl；
[0106]
双蒸水 6.7μl；
[0107]
总共体系 10μl；
[0108]
(3)pcr扩增条件如下：
[0109]
94℃预变性 5min；
[0110]
94℃变性 30s；
[0111]
50℃退火 30s；
[0112]
72℃延伸 30s；
[0113]
重复35个循环；
[0114]
72℃10min。
[0115]
(4)上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μl pcr扩增产物进行电泳检测，检测结果如图4所示，证明过表达bmecra(seq id no.1)转基因制作成功。
[0116]
psg特异性的gal4/uas过表达bmusp(seq id no.2)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
[0117]
步骤s61解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmusp(seq id no.2)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0118]
步骤s62将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取步骤见步骤s52。
[0119]
步骤s63基因组pcr：
[0120]
具体步骤见步骤s53，在bmusp(seq id no.2)两端设计引物，通过基因组pcr进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达bmusp(seq id no.2)转基因家蚕制作成功。
[0121]
psg特异性的gal4/uas过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
[0122]
步骤s71、解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0123]
步骤s72、将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取步骤见步骤s52。
[0124]
步骤s73基因组pcr：
[0125]
具体步骤见步骤s53，在bme74(seq id no.3)两端设计引物，通过基因组pcr进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达bme74(seq id no.3)转基因家蚕制作成功。
[0126]
psg特异性的gal4/uas过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
[0127]
步骤s81解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0128]
步骤s82将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取步骤见步骤s52。
[0129]
步骤s83基因组pcr：
[0130]
具体步骤见步骤s53，在bmhr4(seq id no.4)两端设计引物，通过基因组pcr进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达bmhr4(seq id no.4)转基因家蚕制作成功。
[0131]
psg特异性的gal4/uas过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
[0132]
步骤s91解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0133]
步骤s92将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取方法见步骤s52。
[0134]
步骤s93基因组pcr：
[0135]
具体步骤见步骤s53，在bmhr3(seq id no.5)两端设计引物，通过基因组pcr进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达bmhr3(seq id no.5)转基因家蚕制作成功。
[0136]
psg特异性的gal4/uas过表达bmftz-f1(seq id no.6)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
[0137]
步骤s101、解剖野生型家蚕nistari和psg特异过表达bmftz-f1(seq idno.6)转基因家蚕五龄第六天(5l6d)的psg，并通过1.5ml的离心管收集。
[0138]
步骤s102、将解剖并收集的psg进行基因组的提取，提取方法见步骤s52。
[0139]
步骤s103、基因组pcr：
[0140]
具体步骤见步骤s53，在bmftz-f1(seq id no.6)两端设计引物，通过基因组pcr进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达bmftz-f1(seq id no.6)转基因家蚕制作成功。
[0141]
本发明涉及的基因序列如下：
[0142]
seq id no.1 bmecra序列
[0143]
atgggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacggagctgaaacacgaggtggcgtaccgcggcgtgctgcccggccaggtgaaggccgagcctggcgtcagtcacaacggccatccggtcaacggacacgtccgggactggatggcggggggagctgcgggcgggggttcgccctccccaggcgcgccgggacaaccgcagcccagcaacggatactcgtcgccactatcctcaggcagctacggtccgtacagccctaatggaaaaatagcctgctctcccgttcttcatcaaataggtcgagaggaactttcgccggcttcaagcataaatggctgcagtgctgatgctgacgccagacggcagaagaaaggtcctgcacctcgacagcaagaggagctatgtcttgtctgcggcgacagagcctccggataccactacaacgcactgacgtgtgaaggatgcaaaggattcttcaggcggagtgtcaccaaaaacgcagtatatatttgtaaatttggacatgcctgtgaaatggatatgtacatgaggaggaaatgtcaagagtgtcgattaaagaaatgtctagcggtaggaatgaggcctgaatgtgtcatacaggagcccagtaaaaataaagacaggcaaagacaaaagaaagacaaaggaatattattacctgttagtacgaccacagtcgaagaccacatgcccccgatcatgcaatgtgatccacctccgcccgaggccgccaggattcacgaagtcgtcccgaggtatctttcggagaagctgatggagcagaacaggcagaagaacataccaccattgtcggcgaatcagaagtctctgatcgcgaggctcgtgtggtaccaggagggatatgagcagccctcttacgaggatctcaaaagagtaacgcagacttggcagtcggatgaagaggacgaggaatccgatctagaacacgctgtatctaatttcatgatgagaatgtgcgaaatgaaaattcacgtgatggtgagcaagggcgaggagctgttc
accggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
[0144]
seq id no.2 bmusp序列
[0145]
atgtacccatacgacgtcccagactacgcttcgagcgtggcgaagaaagataaaccgacaatgtcggtaactgcgttgatcaatagggcgtggccaatgacgcctagcccacagcagcagcagcagatggtgccgtctacacagcattcgaatttcctgcagccaatggctacgccttcaaccacacccaatgttgaactcgatatacaatggctgaacatagagtcagggtttatgtcgcctatgtcaccgcccgaaatgaagccagatacggcgatgctcgacggtttccgagacgactcgacgccgccccctcccttcaagaattatccccctaaccatcccttgagcggctcaaaacatctatgctccatatgtggtgacagagcctcgggcaaacattacggagtatacagttgtgaaggctgcaaagggttcttcaagaggacagtcaggaaggatctcacatacgcgtgccgggaggacaagaattgtataatagataaacgccagcggaatcgttgccagtactgccgataccagaagtgtctcgcttgcggcatgaagagggaggctgtgcaagaggagagacagcgagccgcgaggggtacagaagacgcccatcccagcagctctgtacaggagctatcgatcgagcggctgctggaattggaggcgttagttgcggattcagctgaggagttacagatcctacgtgtcggtcccgaaagcggcgtaccggccaagtaccgagcccccgtctcgagtctttgtcaaataggcaacaaacagatagccgctctcattgtttgggcgcgtgacattccacacttcgggcagctagaaatcgacgatcagatccttctaatcaagggctcctggaacgaactgctgctgttcgctatcgcatggcggtctatggagttcctgaatgatgaaagagagaacgtagactcgcggaatacggcgccgcctcaactcatttgtttaatgccaggcatgacgctgcaccgcaactccgcgctgcaggccggcgtggggcagatcttcgaccgcgtgctctccgagctgtcgctcaagatgcgctccctccgcatggaccaggccgagtacgtcgcgctcaaggccatcatactcctcaatcctgacgtaaaaggattgaagaataaacaagaagtggacgttcttcgagaaaagatgttcttatgcctggacgagtactgccggcgctcgcgcggcggggaggagggtcggttcgcggcgctgctgctgcggctgccggcgctgcgctccatctcgctcaagagcttcgagcacctctacctgttccacctcgtggccgagggcagcgtgagctcgtacatccgcgacgcgctctgcaaccacgcgccgcccatcgacaccaacatcatgatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacga
gctgtacaagtaa
[0146]
seq id no.3 bme74序列
[0147]
atgccatttattgaagacgagtggtggtccgccgagaatgagggcagaatggtcgatctctcaaattgccttcagggacagtttcaggacgcggtagtggctgccggcggtcaggcggcggcccagcttcagcagatggcctcgtcactaggcgagctgtcgcaggccgagctgtccaacatcgtgggcggcctcaccctggagccggagagctctgaagcggcagaccccgacgacatcctgaagcagctcggggagaccgcgttcgacaacttcgatacgtttttcacggatctcactaacgccaccgcttcgggcgcaccacctatcgagataaagcaagaagagaacaacaacatatcgtcgccagcgtccagcagtcaactgcaagggtactaccctcaaagtcaattacatttacaaaacaacgggcagcaaagattgcagcaactccttagatcgggcaccaacgccattaacaatgccgttaataataacattaacaatggaagatataatattgcgtcgcaaaatccgttgctcgccgagaaattatcttcaacgcccagcggcatcaagcaagaaccagtcagttcagagtacacggggacgagtatgaactatggaagtgcatcgccgttgcagcgagtgccgagcgggaaaccgcaagctcacgacgctggtggagtgaatggagaaccaacaggactggccctcggagccagagcgctgctgcacggtctcctggcgccctcaccctcggtcaggcaccatcccctgtacacggcgcccaacacaggctccctcccaccttcgccagcggacagtggggtatcggatgtggagtcgtcctcgtccggagcaggttccgctgaggacctgaagacgaggcttcaacctcccccgccggcgcccttccacgcccccttcctgcccttctaccagcatcatcagatcgcttccacattgcagcacgccgctgcacatcctcgaccaccagtgggagcgttgagcgatcgtgacgcatatggatatggttacggcggcgggggaggcgggactcaccacttcgcagcgcctgcgcccccgccgctgccgcacgacgagctgccatactccgtattcgacttcggcgactaccagcgccaccatcatcacaacaaactgaagccgaagaaaaggcctcgctccgatgcacctcccacgccgggcgtcaagcgcaagagccgggagggctccaccacgtacctgtgggagttcctgctgaagctgctgcaggaccgcgagtactgcccgcgcttcatcaagtggacgaaccgcgagaagggcgtgttcaagctggtcgactcgaaggcggtgtcgcgactctggggcctgcacaagaacaagccagacatgaactacgagaccatgggccgcgccctgcgctattactaccagcgcggcatcctcgctaaggtggacggccagcgcctcgtctaccagttcgtggacgtgcccaaggacatcgtcgagatcgactgttcgttggcg
[0148]
seq id no.4 bmhr4序列
[0149]
atgacctccacaatgggaataatgacacttagccgcgggccgtgtgacctcgacaacatgagtctatttcaagacctcaaactaaagaggcggaaagttgactccagatgtagcagcgatggcgagtcggcggccgacaccagcacttcgtcacctgacccaggaccgccttcgccgcgtatgtctgaagccgggtgcagcacgccgccgcacccgccgcccgtgttcgatggcggtggctctccgtcaccttcacccgcttgccatcccaccgttatacgctcggcgccaccctactcagtcatcaagtttgaaggtgcacaatccgctgtcaaagcagaaagttcgcctgcgagtggaaaaaaccagcccacaacgcagtctcagttgtcttcagtgaagttggaaagcgcaccgcaagaatcaccacaaccgttcagaccacgtaccctcgtaccgcctccgcctggagttcacgctaatctatcaccaggacattggccgccggccgcttgtataaatggtgttaaacctgaacttataggcggaaattttccaccacagccgattgaaaataaaccaggtgcgcgtggacaaacacaatggagaggtactcctgctgttataatgggcgaatccggaggtgtccgaacaatgttctggaccttaccagcgcctagttcaagtagtgagcctgcagccagtgcttcgcatacttcatccacgccttctcctgatccagcttcatgcagtgaggagtcagcagcgaggctattactcaatttaggtggcgagttacgacgacctagagggccaccattgaacatggaactactctgggccggagacgtgtcccagctccctgctcaccaacaaattcatgcgttaaatctgagcgccgctgccggaagcatcgcgggttcttctccaatggcaggtgctagttccttagcgttacccagaccagaactgcgtacatatgcaccagagactgaacgcgatgaagacgaacaaccaatgatatgcatgatttgcgaagacaaagcgactggactgcattacggcataattacttgtgaaggctgtaagggatttttcaaacgaactgtccaaaacagaagggtttacacgt
gcgtcgctgacggtggctgtgaaattacaaaggcacaaagaaatagatgccagtattgtagattcaaaaaatgtattgaacaaggaatggttctacaagctgtacgagaggacaggatgcctggtgggaggaacagtggagctgtttacaatttatacaaagtgaaatataagaagaacaagaaagccaacaaaacagctacggctacaagtcgagcttcgccaccagaaaaacctaaagaacccttacccccactcccaccgcatttggtcaatggtaccatacttaagactgcactaacaaatcccagcgaggttgttcatttgagagcaaggcttgaaagtgccgtgtcgtcgtcacgagatcgagccgtccctttggacagggcgctgcacatgattcgcgctctgattgactgtgacgctatggaagacattgcgacagtacgacacctccctgacttgcttcatgacacttcggaaataagcgacaaattgtgtaagatcggtgattctattgtgcacaaaatggtagcgtggacgaaaaaactaccgttcattatggaaatccctatggaaatacactcaaaattattaatggaaaagtggcatgagatctcagtattaacgacagcggcgtatcaagcgatgcacggaaagcagacccacgctcctccctcgtcagatcacgaacaggactttatgcaagaggtaaacgccaacctccggacattgcagaattgcttgacgtcacttatgggcaggcccattacgctggagcagttgcgattggatgtaggacttgtcgtggaaaagatgacgcagataacctgtgttttccgtcgcatacagctccgaatggaggaatacgtctgcctcaaagtctatatactgcttaatcaagaagtcgaactcgagggaatccaggaccgctacgtgcaagtactacgcagctaccttgaacacgccaacccgcaccatccgggcaggctacaggaactgttcgccagaatcccagagatccaggcggcggctaacttgctcctcgagagcaaaatgttctacgttccgttcgtgctgaactcggcggagatcaga
[0150]
seq id no.5 bmhr3序列
[0151]
atgttgaacatgtttgatatgtggaactctgtgagcaagctggaggcgcagtccaatgtgcagcaaagccaacagccacacacttcaggtgggagcattaaagcccaaatcgagataataccgtgcaaggtatgcggagataaatcgtcgggggtgcactatggcgtgatcacctgcgagggatgcaaaggattcttcagacgatcccagagcacagtggtgaactaccagtgtcctcgcaacaaggcctgcgtcgtggacagggtcaaccgcaaccgatgccagtactgcagactacagaagtgcctcaaactcggcatgagtcgtgatgccgtgaaattcggtcgcatgtcgaagaagcagcgagagaaggtcgaggacgaggtcagataccacaaggcgcagatgcgggtgcaggctgatgcggcgccggactccgtgtacgacgcccagcagcagacgcccagctcgagcgaccagttccacgggcattataacagctacccaggatacgggtcgccgttgtcttcgtatggctacaacaacgccgggccagcgctaccctcgaacatgagcgggatgcagccgcagcccccagcccagcccccgtacgaggtctcaggcgactacgtggactccacaacgacatacgagcccaaacagacagggttcttggacgcagacttcataagtcacgtggagggtgacattagcaaggtgctagtgaaaagtttgacagaggcgcacgcgaatacaaatccgaagctggattacatacatgagatgttcggcaagccccaggatgtttctaagctcttgttctataactccatgacctacgaggagatgtggttggactgcgccgacaagctcaccgcgatgatccagaacatcattgagttcgcgaaactcatacctggtttcatgaagctcacccaggacgatcaaatactgctgcttaaatcaggttcgttcgagttggcgatcgtccgcctgtcgcggctaatcgacgtgaaccgcgaccaggtgctctacggagacgtggtgctacccgtgcgggagtgcgtgcacgcgcgcgatcccagagacgtagctctggtgcaaggaatctttgaggctgccaagagcatcgctcgactgaagctgaccgagactgaactggctctataccagagccttgtgctcctgtggccagagcgtcacggcgtgatgggcaactcggagatcagatgtctcttcaacatgtccatgtcggcgatgcggcatgagatcgaggtcaaccacgcgccgctcaagggtgacgtcaccgtgctggatacactcctggccaagatacccactttcagagatctctccctgatgcacctcggagcgctgagccgtttcaaagcgacgcatccgcatcacgttttcccagctttatacaaagaattgttctctttagacagtgttttagattacacgcacgga
[0152]
seq id no.6 bmftz-f1序列
[0153]
atgcacgaagacgctccaaaaatgagtatagcgcaaagtctggccgcctccacgagccagccaaaaggtgatatcgttacagaaattcccctggaattcgccatgagctctatggagacaaaatctatcgaaacaaccaacgtg
gagttgaaaattacctacgtagatcctacaactggcactggaggtgaaccaggagcgtatctgccgacagcaggaacagtttgcgaccaaactgataccaaggatgtaatagaagaattgtgtcccgtctgtggagacaaagtcagcggctaccactatggattgctgacgtgcgaatcctgcaaaggtttcttcaaaagaaccgttcagaacaagaaggtttatacatgcgtcgccgaaagagcctgccacatagacaaaactcaacggaaacgctgtcccttttgccgtttccagaaatgtcttgatgtgggcatgaaacttgaagcggttcgagcagatcgtatgcgcggtggtcgcaataaatttggccctatgtacaaacgagaccgtgcccgtaaactacaaatgatgcgtcagcgacaaatcgccgttcagactctgcgcggttctctaggggacggtggattagtccttggttttggttctccgtacacagctgtatccgttaaacaagagatacagattccgcaagtatcatcattgacgtcctcgcctgagtcgtcgccgggaccagcgctccttggggctcagccacagccgccgcagccacctccaccaccaactcacgacaagtgggaagcccactcaccacactcggcgtcgccggatgctttcacgttcgatacacaatcgaacaccgccgctacaccatccagcacagccgaagctactagcactgaaactttacgagtttctccaatgatcagagaattcgtacaaaccgtcgatgaccgcgagtggcagaatgcactgttcggactcttacaaagccaaacatataaccagtgcgaagtagatctcttcgagttaatgtgcaaagtgctggaccaaaatttattctctcaagtggattgggcaagaaacacagtgttctttaagtatttaaaggttgatgaccaaatgaaacttctacaggactcatggtctgttatgctggttttggatcatttacaccagagaatgcacaatggtctgccagacgagaccacactccacaacgggcagaagtttgacctgctctgtttggggctacttggagttccttcattagccgaccacttcaatgaattacagaataaactagcagaattgaaattcgacgttccagattacatatgcgttaaattcatgcttcttctcaatcccgaggttaggggtatcgtaaacgtgaagtgcgttcgtgaaggttaccaaacagtacaagccgcccttcttgactacactcttacctgctatccaacgatacaggataagtttggaaaacttgtaatggtagtgccagagatacacgctttagcggctcggggagaagagcacctgtaccagcggcattgtgcaggccaggcacctacccagactcttctcatggaaatgctgcacgcaaaacgcaaatctgactacaaggacgacgacgacaagtga
[0154]
seq id no.7家蚕fibh基因启动子序列
[0155]
cctgcgtgatcaggaaaaatgtggaaagcttaacgattttgtcacattttacttatcacaacttgtttttataataattcgcttaaatgagcagctattacttaatctcgtagtggtttttgacaaaatcagcttctttagaactaaaatatcatttttttcgtaatttttttaatgaaaaatgctctagtgttatacctttccaaaatcaccattaattaggtagtgtttaagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaag
[0156]
seq id no.8 gal4bd基因序列
[0157]
atgaaactgctctcatcaatcgaacaggcctgtgacatttgtagactcaaaaaactcaaatgctccaaggagaaacccaaatgtgccaaatgcctgaaaaacaactgggagtgccggtactctcctaaaaccaaacggagccct
ctcacacgggcccatctcactgaagtggaatctcgactcgaacggctcgaacagctctttctgctcatctttcctagagaggatctcgacatgatcctgaaaatggatagcctccaggacatcaaagccctgctcactggactgtttgtccaggataacgtgaacaaggacgccgtgaccgataggctggcatccgtggaaaccgatatgccactcacactgagacagcaccggattagtgccacatcttcttccgaggagtcatccaataagggacagcgacagctcaccgtgtca
[0158]
seq id no.9蛋白激活结构域vp16序列
[0159]
tgcaccgcccctattaccgatgtgtctctgggcgacgaactccggctggatggcgaggaagtcgatatgacccctgccgacgctctcgacgatttcgacctggaaatgctgggagatgtcgaatctccttctcctggcatgacacacgatcccgtgtcttacggagcactggatgtgtaa
[0160]
seq id no.10终止信号ser1-poly a序列
[0161]
tacaactaaacacgacttggagtattccttgtagtgtttaagattttaaatcttacttaatgacttcgaacgattttaacgataactttctctttgtttaactttaatcagcatacataaaaagccccggttttgtatcgggaagaaaaaaaatgtaattgtgttgcctagataataaacgtattatcaaagtgtgtggttttcctttaccaaagacccctttaagatgggcctaatgggcttaagtcgagtcctttccgatgtgttaaatacacatttattacactgatgcgtcgaatgtacacttttaataggatagctccactaaaaattattttatttatttaatttgttgcaccaaaactgatacattgacgaa
[0162]
seq id no.11 3
×
p3-dsred序列
[0163]
gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgcgctcctccaagaacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggcaccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggccacaacaccgtgaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctgcttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgccaccacctgttcctgtagtcataatcagccataccacatttgtag
[0164]
seq id no.12 piggybac右臂
[0165]
ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttaaacattctctcttttacaaaaataaacttattttgtactttaaaaacagtcatgttgtattataaaataagtaattagcttaacttatacataatagaaacaaattatacttattagtcagtcagaaacaactttggcacatatcaatattatgctctcgacaaataacttttttgcattttttgcacgatgcatttgcctttcgccttattttagaggggcagtaagtacagtaagtacgttttttcattactggctcttcagtactgtcatctgatgtaccaggcacttcatttggcaaaatattagagatattatcgcgcaaatatctcttcaaagtaggagcttctaaacgcttacgcataaacgatgacgtcaggctcatgtaaaggtttctcataaattttttgcgactttggaccttttctcccttgctactgacattatggctgtatataataaaagaatttatgcaggcaatgtttatcattccgtacaataatgccataggcca
cctattcgtcttcctactgcaggtcatcacagaacacatttggtctagcgtgtccactccgcctttagtttgattataatacataaccatttgcggtttaccggtactttcgttgatagaagcatcctcatcacaagatgataataagtataccatcttagctggcttcggtttatatgagacgagagtaaggggtccgtcaaaacaaaacatcgatgttcccactggcctggagcgactgtttttcagtacttccggtatctcgcgtttgtttgatcgcacggttcccacaatggttt
[0166]
seq id no.13 piggybac左臂
[0167]
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[0168]
seq id no.14 10
×
uas序列
[0169]
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[0170]
seq id no.15 3
×
p3-ecfp序列
[0171]
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[0172]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。