一种天然合成的低酰基三赞胶及其生产方法和鉴定方法与流程

1.本发明属于生物多糖技术领域，具体涉及一种天然合成的低酰基三赞胶及其生产方法和鉴定方法。


背景技术：

2.微生物胞外多糖是由好氧微生物合成的一类由单糖或衍生物经过糖苷键聚合形成的高分子聚合物。微生物多糖种类繁多、性能多样、生产周期短且不受气候和地理环境条件的限制，已经广泛应用于食品、石油、化妆品、地矿、医药、环境保护等二十多个行业几百种用途，是一类与人们生活息息相关的生物技术产品。鞘氨醇胶是由鞘氨醇单胞菌产生的一类微生物胞外多糖的统称，目前已经广泛应用的鞘氨醇胶主要包括：结冷胶、韦兰胶、迪特胶和鼠李胶等。此类鞘氨醇胶具有相对保守的主链结构，而侧链基团的种类、位置则具有极大的多样性，这使鞘氨醇的结构和功能更加丰富，从而赋予了每一种鞘氨醇胶独特的物理性质。比如没有糖基侧链的结冷胶能形成凝胶，从而在食品、日化和医学上得到了广泛的应用；具有鼠李糖或甘露糖侧链的韦兰胶，能形成耐酸、耐碱、耐高温的高粘度的溶液，具有一个或两个鼠李糖侧链的迪特胶在低浓度条件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、钻井、采油等高技术领域应用广泛；随着生物技术的发展，越来越多的可产鞘氨醇胶的菌株被鉴定，而这些新发现的天然聚合物资源在未来的生物胶应用中必将发挥更加重要的作用。
3.高酰基三赞胶是由鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)t-3(cgmcc 10150)产生的一种新型的鞘氨醇胶，具有凝胶、乳化、增稠、悬浮、稳定等优良性能。高酰基三赞胶可形成透明的弹性凝胶，其凝胶强度远高于低酰基结冷胶，是鞘氨醇胶中除结冷胶外另一个可形成凝胶的聚合物。并且，高酰基三赞胶可以通过简单、低成本的酸沉工艺提取，具有优越的市场前景。而酰基含量可显著影响多糖的流变学特性，比如结冷胶。结冷胶根据提取工艺不同可分为高酰基结冷胶和低酰基结冷胶，其中低酰基结冷胶透明度高，但为脆性凝胶。高酰基结冷胶可形成弹性凝胶，凝胶强度较高，但透明度低，这限制了其在某些高端产品上的应用。
4.目前，可形成凝胶的常见微生物胞外多糖有热可逆的结冷胶、热不可逆的可得然胶等。高酰基三赞胶同样是一种热可逆弹性凝胶。目前，低酰基三赞胶只能通过后提取处理获得，工艺复杂、成本较高，极大地限制了其生产和应用拓展。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种天然合成的低酰基三赞胶，属于高弹性、透明、温敏凝胶。
6.本发明的目的还在于提供一种天然合成的低酰基三赞胶的生产方法，具有操作简便，能耗低的优点。
7.本发明的目的还在于提供一种天然合成的低酰基三赞胶或含所述低酰基三赞胶的产品的鉴定方法，具有鉴定结果快速、准确的特点。
8.本发明提供了一种天然合成的低酰基三赞胶，所述低酰基三赞胶具有式i所示的重复单位；
[0009][0010]
其中，表示葡萄糖基团的c4位被ac取代，表示葡萄糖基团中c2或c6位被gi取代；ac为乙酰基；gi为甘油酰基；所述乙酰基的质量百分含量为4.0％～5.8％，所述甘油酰基的质量百分含量为3.0％～4.3％。
[0011]
本发明提供了一种所述低酰基三赞胶的生产方法，包括以下步骤：
[0012]
1)将鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)突变菌株接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；
[0013]
所述鞘氨醇单胞菌突变菌株是在鞘氨醇单胞菌菌株nxdp的基础上，将wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域的关键活性位点进行突变获得；
[0014]
所述关键活性位点包括以下一个或多个区域：walker a区域、walker a'区域、walker b区域和c端tyr簇；
[0015]
2)将所述发酵液的ph调至酸性，分离，得到的絮状沉淀为低酰基三赞胶。
[0016]
优选的，步骤1)中walker a区域的氨基酸序列如seq id no:2所示；
[0017]
walker a'区域的氨基酸序列如seq id no:3所示；
[0018]
walker b区域的氨基酸序列如seq id no:4所示；
[0019]
c端tyr簇的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0020]
优选的，步骤1)中发酵培养包括好氧发酵或微氧发酵。
[0021]
优选的，在所述好氧发酵时，通气量为1～2vvm，搅拌速度为500～600rpm。
[0022]
优选的，所述微氧发酵包括浅盘发酵和深层静置发酵。
[0023]
优选的，所述发酵的温度为28～32℃；所述发酵的时间为68～84h。
[0024]
本发明提供了所述低酰基三赞胶或所述生产方法得到的低酰基三赞胶在中轻度加工产品中的应用。
[0025]
本发明提供了一种针对所述低酰基三赞胶或其生产菌株或所述菌株t-4或所述中轻度加工产品的鉴定方法，包括以下步骤：
[0026]
1)提取待测样品的基因组dna；
[0027]
2)以步骤1)中所述基因组dna为模板，用gt1/gt2引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物；
[0028]
3)所述pcr产物进行测序，根据测序结果判断是否含有低酰基三赞胶：
[0029]
当测序结果与分子标记序列完全一致时，说明待测样品为含高酰基三赞胶的产品或其生产菌株nxdp；
[0030]
当测序结果与分子标记序列比对，在分子标记的关键活性位点存在突变时，说明待测样品为低酰基三赞胶或含低酰基三赞胶的产品或其生产菌株t-4；
[0031]
所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示；
[0032]
所述分子标记的关键活性位点包括以下一个或多个区域：walker a区域、walker a'区域、walker b区域和c端tyr簇。
[0033]
优选的，gt1的核苷酸序列如seq id no:6所示；
[0034]
gt2的核苷酸序列如seq id no:7所示。
[0035]
本发明提供了一种天然合成的低酰基三赞胶，所述低酰基三赞胶具有式i所示的重复单位；其中，葡萄糖基团的c4位被ac取代，而c2或c6位被gi取代；ac为乙酰基；gi为甘油酰基；所述乙酰基的质量百分含量为4.0％～5.8％，所述甘油酰基的质量百分含量为3.0％～4.3％。酰基含量可显著影响多糖的流变学特性，通过测定低酰基三赞胶的性能，以对比分析低酰基三赞胶与原始多糖高酰基三赞胶和高酰基结冷胶的性能差异，结果表明，低酰基三赞胶与原始高酰基三赞胶相比，具有更高的弹性(表现为更高的弹性、内聚性、回复性和更低的损耗因子)和更优良的温度敏感性(构象转变温度降低了13℃)；比高酰基结冷胶具有更低的构象转变温度(降低25℃)和相似的凝胶弹性。相比野生型菌株产生的高酰基三赞胶，本发明提供的低酰基三赞胶制备工艺简单，能耗低，适于广泛的工业生产，同时有助于进一步开发三赞胶产品种类、开拓应用市场、增加其市场竞争力，进而推动我国微生物多糖相关产业的发展。
[0036]
本发明提供的针对所述低酰基三赞胶或所述低酰基三赞胶产生菌株或所述中轻度加工产品的鉴定方法，是以低酰基三赞胶产生菌株构建过程中基因改造的目标基因为分子标记，当测序结果为分子标记的任一关键位点出现突变时，即为低酰基三赞胶产品或其生产菌株。所述鉴定方法快速、准确，能够满足工业快速检测的需求。
附图说明
[0037]
图1为采用hplc法测定低酰基三赞胶的单糖组成结果图；
[0038]
图2为低酰基三赞胶与原始高酰基三赞胶的1h nmr色谱分析图；
[0039]
图3为低酰基三赞胶与原始高酰基三赞胶的酰基含量分析图；
[0040]
图4为微生物多糖低酰基三赞胶、原始高酰基三赞胶和高酰基结冷胶的质构性能分析结果图；
[0041]
图5为微生物多糖低酰基三赞胶、原始高酰基三赞胶和高酰基结冷胶的流变学性能比对结果图；
[0042]
图6为wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域的关键活性位点示意图。
[0043]
生物材料保藏信息说明
[0044]
鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为2021年7月23日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为cgmcc no.22948，菌株编号为t-4。
具体实施方式
[0045]
本发明提供了一种天然合成的低酰基三赞胶，所述低酰基三赞胶具有式i所示的重复单位；
[0046][0047]
其中，表示葡萄糖基团的c4位被ac取代，表示葡萄糖基团中c2或c6位被gi取代；ac为乙酰基；gi为甘油酰基；所述乙酰基的质量百分含量为4.0％～5.8％，所述甘油酰基的质量百分含量为3.0％～4.3％。
[0048]
在本发明中，所述低酰基三赞胶由鞘氨醇单胞菌突变菌株生物合成。鞘氨醇单胞菌突变菌株是在亲本菌株sphingomonas sp.nxdp(cgmcc no.15406)基础上通过对多糖关键蛋白wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域的关键活性位点进行突变获得。所述关键活性位点包括以下一个或多个区域：walker a区域、walker a'区域、walker b区域和c端tyr簇。walker a区域的氨基酸序列优选如seq id no:2(srpsegkstsatata)所示；walker a'区域的氨基酸序列优选如seq id no:3(allvdad)所示；walker b区域的氨基酸序列优选如seq id no:4(vvvidap)所示；c端tyr簇的氨基酸序列优选如seq id no:5(gyynynysysy)所示。wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域的氨基酸序列优选如seq id no:8(enlddairtpddvqrmlnvpalgavpllkagenpfeeisnprsamaeayqsirtalelstahgvprslvftssrpsegkstsatataqnlartgkrallvdadlrlptlhkfldlknnagfvslltgqktvmdvrqptglegfdfissgplppapaellseaslnrflndalahydvvvidappvmgfadapliaaitegtvfvveadvahrgaartairrlvtsranvvgailtkfdapalgyynynysysyeygnranag)所示。wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域的核苷酸序列优选如seq id no:1(gaaaatctcgacgacgcgatccgcacgcccgacgatgtccagcgcatgctcaacgtgcctgcgctgggcgccgtcccgctgctcaaggccggcgagaacccgttcgaggaaatcagcaacccgcgctcggcgatggcggaagcctatcagtcgatccgcacggcgctggaactctcgaccgcgcacggcgtgccgcgcagcctggtgttcacgtccagccccccgtcggaaggcaagtcgacctcggccaccgccaccgcgcagaacctggcgcggaccggcaagcgcgcgctgctcgtcgatgccgatcttcgtctgccgacgctgcacaagttcctcgacctcaagaacaatgccggcttcgtcagcttgctgaccggccagaagacggtgatggacgtgcgccagccgaccggactggaaggcttcgacttcatctcgtcgggcccgctgccgcctgccccggcggaactgctcagcgaggcgtcgctcaaccgcttcctcaacgatgcgctggcgcattacgacgtggtggtgatcgacgccccgccggtgatgggcttcgccgacgcgccgctgatcgcggcgatcaccgagggcacggtgttcgtggtcgaggccgacgtggcgcaccgtggtgccgcacggaccgcgatccgccgcctggtcaccagccgcgccaatgtggtcggcgccatcctgaccaagttcgacgccccggcgctgggctattacaactacaactacagctacagctacgaatatggaaaccgcgccaacgcgggctga)所示。所述突变包括以下一种或几种：点突变、碱基缺失和插入突变。在本发明实施例中，对walker a区域优选分别进行了缺失突变和点突变，对walker a’区域进行缺失突变，对walker b区域进行了缺失突变，以上述构建的突变菌株为实验对象，分别检测其生产wzy型胞外多糖的情况。对walker a区域进行点突变获得的鞘氨醇单胞菌突变菌株命名为t-4，生物保藏编号为cgmcc no.22948。
[0049]
在本发明中，通过hplc和1h nmr方法，测定低酰基三赞胶中重复单元单糖组成、酰基含量，同时比较低酰基三赞胶与原始菌株产生的原始高酰基三赞胶的差异。结果表明，低酰基三赞胶具有与高酰基三赞胶相同的糖链和酰基结构，其葡萄糖基团的c4位被乙酰基
(ac)取代，而c2或c6位被甘油酰基(gi)取代，但低酰基三赞胶具有比高酰基三赞胶更低的酰基含量，其乙酰基和甘油酰基含量分别降低了10～40％和15～55％。具体结果如下表1所示。
[0050]
表1低酰基三赞胶和原始高酰基三赞胶的酰基含量
[0051][0052]
相比原始菌株产生的原始高酰基三赞胶，低酰基三赞胶分别降低了19.48％和28.55％。酰基含量的差异显著影响了多糖的质构和流变学特性。本发明通过测定低酰基三赞胶的质构性能发现，形成的低酰基三赞胶凝胶具比原始高酰基三赞胶具有更好的弹性、回复性及内聚性。测定低酰基三赞胶的流变学性能结果表明，低酰基三赞胶的凝胶温度和溶胶温度分别为38～45℃和34～40℃，而原始高酰基三赞胶为53.5℃和50.0℃，高酰基结冷胶则具有更高的凝胶和溶胶温度66.0℃和60.0℃。由此说明，新型多糖低酰基三赞胶具有比原始多糖更高的弹性，更低的构象转变温度；具有比高酰基结冷胶更低的构象转变温度。因此新型多糖低酰基三赞胶未来在食品、医疗、化工、建筑、采油等行业具有广泛的应用前景。
[0053]
本发明提供了一种所述低酰基三赞胶的生产方法，包括以下步骤：
[0054]
1)将上述鞘氨醇单胞菌突变菌株接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；
[0055]
2)将所述发酵液的ph调至酸性，分离，得到的絮状沉淀为低酰基三赞胶。
[0056]
在本发明中，发酵培养优选包括好氧发酵或微氧发酵。在所述好氧发酵时，通气量优选为1～2vvm，搅拌速度为500～600rpm。所述微氧发酵包括浅盘发酵和深层静置发酵。所述浅盘发酵中发酵液的深度优选为0.5～2cm，更优选为1.0cm。所述深层静置发酵中，发酵液的深度优选为3.0～20cm，更优选为5.0cm。所述好氧发酵中空气通气量优选为1～2vvm，更优选为1.5vvm。搅拌速度优选为500～600rpm，更优选为550rpm。所述发酵培养基优选为葡萄糖30～50g/l，豆粉0.5～2g/l，k2hpo41～2g/l，mgso40.1～1g/l，nano31～2g/l，ph 7.0，更优选为葡萄糖40g/l，豆粉1.2g/l，k2hpo41.5g/l，mgso40.5g/l，nano31.5g/l，ph 7.0。所述发酵时，菌株的接种量优选为5％～10％，更优选为8％。所述发酵的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。所述发酵的时间优选为68～84h，更优选为72h。
[0057]
在本发明中，调至酸性优选为调节至ph值为3。所述分离优选为离心。本发明对所述离心的转速没有限制，采用本领域所熟知的分离多糖的方法即可。收集絮状沉淀后，优选调节ph值至6.8～7.2，更优选为7.0。
[0058]
本发明提供了所述低酰基三赞胶或所述生产方法得到的低酰基三赞胶在中轻度加工产品中的应用。
[0059]
在本发明中，所述中轻度产品包括含低酰基三赞胶获得的饮料、肉灌肠类、乳制品、日化、医药、石油开采等产品。
[0060]
本发明提供了一种针对所述低酰基三赞胶或其生产菌株或所述中轻度加工产品的鉴定方法，包括以下步骤：
[0061]
1)提取待测样品的基因组dna；
[0062]
2)以步骤1)中所述基因组dna为模板，用gt1/gt2引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物；
[0063]
3)所述pcr产物进行测序，根据测序结果判断是否含有低酰基三赞胶：
[0064]
当测序结果与分子标记序列完全一致时，说明待测样品为含高酰基三赞胶的产品或其生产菌株nxdp；
[0065]
当测序结果与分子标记序列比对，在分子标记的关键活性位点存在突变时，说明待测样品为含低酰基三赞胶的产品或其生产菌株；
[0066]
所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示；
[0067]
所述分子标记的关键活性位点包括以下一个或多个区域：walker a区域、walker a'区域、walker b区域和c端tyr簇。
[0068]
本发明提取待测样品的基因组dna。
[0069]
本发明对待测样品提取基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可，例如dna提取试剂盒完成。
[0070]
提取后，本发明以所述基因组dna为模板，用gt1/gt2引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物。
[0071]
在本发明中，gt1的核苷酸序列优选如seq id no:6所示。gt2的核苷酸序列优选如seq id no:7所示。所述pcr扩增体系优选为：10～50ng/μl的dna模板：0.5μl，20μm的引物对(gt1/gt2)：0.4μl，premix taq聚合酶：12.5μl，dmso:2μl，加水至25μl；pcr反应条件为：95℃预变性10min；94℃：30s，55℃：45s，72℃：60s，35个循环；72℃延伸10min
[0072]
得到pcr产物后，本发明将所述pcr产物进行测序，根据测序结果判断是否含有低酰基三赞胶。
[0073]
在本发明中，由于合成低酰基三赞胶的菌株在构建时基于对鞘氨醇单胞菌菌株nxdp中wzy蛋白c端酪氨酸激酶区域的关键活性位点突变得到，非相应位点突变的菌株不能得到低酰基三赞胶，因此以亲本菌株鞘氨醇单胞菌菌株nxdp的wzy蛋白c端酪氨酸激酶区域的序列作为分子标记进行判断。当测序结果与分子标记序列完全一致时，说明待测样品为含高酰基三赞胶的产品或其生产菌株nxdp；当测序结果与分子标记序列比对，在分子标记的关键活性位点存在突变时，说明待测样品为含低酰基三赞胶的产品或其生产菌株。因此，本发明提供的鉴定方法操作简单，快速，而且结果准确可靠，适合工业上应用。
[0074]
下面结合实施例对本发明提供的一种天然合成的低酰基三赞胶及其生产方法和鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0075]
本发明所涉及的原料、试剂均为常规商品途径购买。
[0076]
本发明所涉及的引物具体信息见表1。
[0077]
表1引物及序列
[0078][0079][0080]
实施例1
[0081]
一种生产wzy型胞外多糖的突变菌株的构建方法
[0082]
1.wzy聚合酶的c端酪氨酸激酶区域(wzyc)基因敲除载体的构建
[0083]
靶基因通过双交换同源重组而失活。使用提取试剂盒提取菌株nxdp的基因组，靶基因的上下游同源臂以nxdp基因组为模板，分别使用引物csu/csl和cxu/cxl(引物序列见表1)及primestar dna聚合酶(takara bio,tokyo,japan)扩增。其中，pcr反应体系为：引物csu/csl或cxu/cxl各0.4μl；primestar dna聚合酶12.5μl；基因组模板1μl；水补足25μl。通过overlap pcr将上下游同源臂连接，overlap pcr反应体系为：引物csu/csl扩增得上游同源臂/引物cxu/cxl扩增得下游同源臂各0.5μl；引物csu/cxl各0.3μl；primestar dna聚合酶12.5μl；水补足25μl。pcr反应程序为：98℃15s，55℃，15s，72℃10s/kb，循环35次，16℃保
存。
[0084]
将pcr扩增产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。
[0085]
将重组片段及plo3质粒同时使用限制性酶saci和xbai进行酶切，酶切体系为：质粒或重组片段10μl，限制性内切酶saci和xbai各1μl，内切酶buffer 2μl，水补足20μl；酶切反应条件为37℃，酶切30～120min。酶切后片段使用tianquick midi purification kit试剂盒(天根)进行pcr纯化回收，将两者的回收产物用t4 dna连接酶于16℃过夜连接，连接体系为：质粒1μl，重组片段2μl，t4 dna连接酶1μl，buffer 1μl，水补足10μl。得到重组质粒plo3-δwzyc，并将重组质粒转入e.coli s17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
[0086]
2.被修饰的wzyc基因敲入载体构建
[0087]
靶基因通过双交换同源重组而敲入。使用提取试剂盒提取菌株nxdp的基因组，靶基因的上下游同源臂以nxdp基因组为模板，分别使用引物csu/cxl(引物序列如表1)及primestar dna聚合酶(takara bio,tokyo,japan)扩增。产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒(天根)进行纯化回收，获得目的片段。将目的片段及plo3质粒同时使用限制性酶saci和xbai进行酶切，酶切后片段使用试剂盒进行pcr纯化回收，将两者的回收产物用t4 dna连接酶于16℃过夜连接，得到质粒plo3-wzyc，并将质粒转入e.coli s17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。具体条件如下。pcr反应体系为：引物各0.4μl；primestar dna聚合酶12.5μl；基因组模板1μl；水补足25μl。pcr反应程序为：98℃15s，55℃，15s，72℃10s/kb，循环35次，16℃保存。酶切体系为：质粒或重组片段10μl，限制性内切酶saci和xbai各1μl，内切酶buffer 2μl，水补足20μl。连接酶体系为：质粒1μl，重组片段2μl，t4 dna连接酶1μl，buffer 1μl，水补足10μl。酶切反应条件为37℃，酶切60min。
[0088]
以来源于e.coli的etk氨基酸序列为模板预测wzyc的功能区，确定酪氨酸激酶wzyc的关键活性位点为：walker a、walker a'、walker b和c端tyr簇的氨基酸区域(图6)。利用定点突变pcr方法对其walker a、walker a'和walker b区域进行修饰(包括定点突变或者碱基缺失)。以质粒plo3-wzyc为模板，分别使用引物as/al(walker a区域缺失为例)、das/dal(walker a区域点突变为例)、a’s/a’l(walker a'区域缺失为例)和bs/bl(walker b区域缺失为例)，以primestar dna聚合酶(takara bio,tokyo,japan)扩增。并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段。dpnⅰ内切酶消化后转入e.coli s17感受态细胞中，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。从而获得基因敲入质粒plo3-wzyc-a、plo3-wzyc-da、plo3-wzyc-a’、plo3-wzyc-b。
[0089]
wzyc关键活性位点的修饰包含碱基缺失、定点突变等一切失活wzyc酪氨酸激酶功能的手段。
[0090]
3.wzyc缺失工程菌株nxdp(δwzyc)的构建方法
[0091]
在平板培养基挑nxdp单菌落接种至含cmr的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，挑取实施例1构建e.coli s17/plo3-δwzyc的单菌落至含有tetr的lb液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/l的mgso4溶液洗涤两次，离心，再用mgso4溶液重悬菌体，将nxdp和e.coli s17混
匀后置于0.22μm的滤膜上，在无抗性平板上培养12h进行接合转移。用mgso4溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有25μg/ml cm和25μg/mltet双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养36h。将单交换重组子接种于无抗性的5ml种子培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，传代两次，然后将其涂布至10％蔗糖平板上于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，在30℃、200rpm培养24h，使用引物wzyc 1/wzyc2进行菌落pcr验证，获得无痕缺失wzy蛋白c端酪氨酸激酶区域的工程菌株nxdp(δwzyc)。其菌株表现为不产多糖表型，单菌落形态如图1所示。
[0092]
4.酪氨酸激酶功能缺陷型工程菌株的构建方法
[0093]
在平板培养基挑nxdp(δwzyc)单菌落接种至含cmr的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，分别挑取e.coli s17/plo3-wzyc-a、e.coli s17/plo3-wzyc-da、plo3-wzyc-a’、plo3-wzyc-b的单菌落至含有tetr的lb液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/l的mgso4溶液洗涤两次，离心，再用mgso4溶液重悬菌体，将nxdp和e.coli s17按照2:1的比例混匀后置于0.22μm的滤膜上，在无抗性平板上培养12h进行接合转移。用mgso4溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有cmr和tetr的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养36h。将单交换重组子接种于无抗性的5ml种子培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，传代两次，然后将其涂布至10％蔗糖平板上于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃，200rpm培养24h，使用引物wzyc1/wzyc2(序列见表1)进行菌落pcr验证，获得酪氨酸激酶功能缺陷型工程菌株nxdp(wzyc-a)、nxdp(wzyc-da)、nxdp(wzyc-a’)、nxdp(wzyc-b)。四株工程菌株中，walker a区域缺失突变后核苷酸序列为agcaccgccaccgcg(seq id no:23)，氨基酸序列为stata(seq id no:24)；walker a区域点突变后核苷酸序列为agcggcccgtcggaaggcaagtcgacctcggccaccgccaccgcg(seq id no:25)，氨基酸序列为sgpsegkstsatata(seq id no:26)；walker a'和walker b区域缺失突变后对应功能区域核苷酸序列和氨基酸序列全部缺失。四株菌具有相同的表型，其中nxdp(wzyc-da)命名为t-4，并进行保藏，保藏编号为cgmcc no.22948。
[0094]
实施例2
[0095]
鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)生产微生物多糖的发酵方法。
[0096]
(1)将上述构建的4株鞘氨醇单胞菌单菌落和亲本菌株nxdp单菌落分别接种至5ml的tpg液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
[0097]
(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100或300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
[0098]
(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至发酵培养基中，分别按照好氧和微氧两种方式发酵，具体如下：
[0099]
好氧发酵：在含3l培养基的5l发酵罐中培养72小时，通气量为1vvm，搅拌速度为500～600rpm；
[0100]
微氧发酵：将已转接种子的发酵液转移至无菌容器中静置培养7天。
[0101]
其中，无菌容器可指90mm直径的无菌培养皿、250ml的摇瓶或250ml的厌氧瓶。
[0102]
tpg液体培养基：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉3g/l，牛肉浸粉3g/l；
[0103]
种子培养基：蔗糖10g/l，蛋白胨2.5g/l，酵母粉1.5g/l，k2hpo42.5g/l，mgso40.1g/l，ph 7.0；
[0104]
发酵培养基：葡萄糖35g/l，豆粉0.5g/l，k2hpo41.0 g/l，mgso40.4g/l，nano31.2g/l，ph 7.0。
[0105]
根据以上不同的发酵方式培养，获得5组发酵液。
[0106]
实施例3
[0107]
四株鞘氨醇单胞菌突变株和亲本菌株nxdp的产物多糖提取方法
[0108]
将实施例2得到的5组发酵液分别用稀盐酸调节ph至3.0得到絮状沉淀，沉淀经naoh调节至ph中性，烘干后粉碎，称重，获得4组低酰基三赞胶和1组原始菌株nxdp产生的原始高酰基三赞胶。
[0109]
实施例4
[0110]
hplc方法测定4组低酰基三赞胶的单糖组成
[0111]
根据文献已经报道的方法处理多糖样品，分为柱前衍生和高效液相色谱分析两个步骤。
[0112]
柱前单糖衍生物制备：称取10mg低酰基三赞胶冷冻干燥后纯品，配制2mol/l的三氟乙酸，在110℃干燥箱水解4h，取出放置于室温至冷却，将反应混合物12000r/min，离心5min，取离心后上清液，用0.3mol/lnaoh溶液中和至ph为7.0左右。
[0113]
取2mm的标准单糖(葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖醛酸)各50μl，和待测多糖水解液100μl，分别加入50μl 0.5mol/l的pmp甲醇溶液和0.3mol/l的naoh溶液，相互混匀，放置于70℃水浴锅水浴30min，取出后置于室温冷却20min，用50μl 0.3mol/l的盐酸溶液进行中和至ph 7.0左右，加入1ml氯仿进行萃取，充分震荡2min，12000r/min，离心5min，取上清溶液，重复进行三次。取10μl溶液进样。
[0114]
液相色谱条件：agilent 1100液相色谱系统
[0115]
流动相：溶剂a：0.05mol/l的磷酸缓冲液(kh2po
4-naoh，ph为6.9) 15％(v/v)的乙腈；溶液b：0.05mol/l的磷酸缓冲液(kh2po
4-naoh，ph为6.9) 40％(v/v)的乙腈；
[0116]
梯度模式设置：时间梯度设为0min-10min-30min，相应浓度梯度设置为：0-8％-20％，进样体积10μl，柱温为室温，流速设为1.0ml/min，检测波长为250nm。
[0117]
4组低酰基三赞胶的单糖组成十分一致，且与原始高酰基三赞胶单糖组成也一致，分别为葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和甘露糖(见图1)。
[0118]
实施例5
[0119]
nmr方法测定低酰基三赞胶的单糖组成
[0120]
将4组多糖低酰基三赞胶与原始菌株产物高酰基三赞胶结构通过1hnmr鉴定其单糖组成。称取20mg的低酰基三赞胶溶于500微升的氘代水溶剂中，利用600m核磁共振波谱仪确定其结构式，以原始高酰基三赞胶为对照，突变菌株获得的4组微生物多糖结果如图2所示。其中a、b、c、d分别代表α-l-rha、β-d-man、β-d-glca、β-d-glc异头碳的质子峰，说明两种多糖具有相同的单糖结构。其糖链重复单元结构如下所示：
[0121]
→
4)β-d-max(1
→
4)β-d-glca(1
→
3)α-l-rha(1
→
3)β-d-gle(
→
1。
[0122]
实施例6
[0123]
hplc测定低酰基三赞胶的酰基含量
[0124]
通过hplc测定实施例3获得的5组多糖的酰基含量。具体方法为：称取50mg低酰基三赞胶于50ml离心管中，加入10ml浓度为0.02m的naoh碱溶液，制备成浓度为0.5％的样品碱溶液；将溶解好的样品放置65℃恒温摇床中，200rpm，碱化处理2h，期间反复摇匀多次；碱化处理后于体系中加入3倍体积的无水乙醇，放置4℃冰箱静置1h；静置后配平，于4℃，9000g离心30min，收集上层清夜于一次性平皿中；将平皿放置65℃烘箱中，直至得到白色固体；加入浓度为0.3mol/l的hcl溶液将样品的ph调节至酸性，颠倒混匀；用去离子水定容至1ml，加入丙酸溶液(0.7g/l)1ml作为内标，混匀后用移液器转移样品至1.5ml ep管中；用0.22μm的滤器过滤样品，进样器取20μl进样，于agilent的hplc仪器进行样品分析处理。检测条件为：hpx-87h柱、uv检测器、流动相为0.005mol/l的h2so4溶液、流速0.6ml/min；检测波长210nm。
[0125]
利用不同浓度的乙酸(45、75、150、225、300、450mg/l)和甘油酸(31.25、62.5、75、125、150、250、500mg/l)作为标准品，丙酸为内标。以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标，绘制标准曲线。乙酸标准曲线为y＝0.771x 26.203(r2＝0.99)，甘油酸标准曲线为y＝0.7783x 3.8083(r2＝0.99)。
[0126]
结果如图3所示，根据峰面积和标准曲线，低酰基三赞胶的乙酰基和甘油酰基含量分别为5.83
±
0.32％和4.08
±
0.28％，相比原始高酰基三赞胶，分别降低了约19.48％和28.55％。
[0127]
实施例7
[0128]
酰基含量的差异显著影响多糖的质构和流变学特性。本实施例首先测定低酰基三赞胶和原始高酰基三赞胶的质构性能
[0129]
以上述5组微生物多糖微材料，分别配制1％浓度的低酰基三赞胶、原始高酰基三赞胶和高酰基结冷胶(购自美国cp keclo公司)，溶于蒸馏水中，涡旋震荡至充分溶解。在80～100℃之间加热10～30分钟，冷却至室温，待形成凝胶后，用tpa方法测定生物多糖凝胶的内聚性、弹性和恢复性。采用英国sms公司的ta.xt plus质构仪进行测定，数据采集频率为200pps；p/0.5的12.7厘米的柱形探头；tpa测试的程序为：
[0130]
测试前速度：2.00mm/sec
[0131]
测试速度：1.00mm/sec
[0132]
测试后速度：1.00mm/sec
[0133]
目标模式：压缩
[0134]
压缩率：50％
[0135]
两次压缩时间间隔：1.00sec
[0136]
触发类型：自动(力)
[0137]
触发力：5.00g
[0138]
每项测试重复5次，室温下测定。
[0139]
经过分析鞘氨醇单胞菌突变菌株产生的低酰基三赞胶具有比原始菌株产物高酰基三赞胶更好的弹性、回复性及内聚性，具有比高酰基结冷胶更高的内聚性。具体结果如表2所示。以t-4产生低酰基三赞胶为例，结果如图4所示。
[0140]
表2四株工程菌株产生低酰基三赞胶、原始菌株nxdp产生高酰基三赞胶及高酰基
结冷胶的质构性能
[0141][0142]
实施例8
[0143]
低酰基三赞胶的流变学性能测定
[0144]
微生物多糖的流变学特性通过ta流变仪测定。以t-4菌株产生低酰基三赞胶为例，溶解1.0g多糖样品至100ml超纯水中，室温搅拌30分钟，溶解后备用，以原始高酰基三赞胶和高酰基结冷胶(hg)为对照。频率扫描条件为25℃，应变2％，频率为0.1～100rad/s。温度扫描条件为：25℃，1hz，升/降温速度为3℃/min。测定结果如图5所示。由图5可知，相比原始高酰基三赞胶和hg，低酰基三赞胶具有更低的损耗因子(损耗模量与储能模量的比值)和更低的构象转变温度。图5中显示，在0.2％的多糖浓度时，低酰基三赞胶的凝胶温度和溶胶温度分别为42.0℃和38.5℃，而原始高酰基三赞胶为53.5℃和50.0℃，高酰基结冷胶则具有更高的凝胶和溶胶温度66.0℃和60.0℃。由此说明，新型多糖低酰基三赞胶具有比原始多糖更高的弹性，更低的构象转变温度；具有比高酰基结冷胶更低的构象转变温度。因此新型多糖低酰基三赞胶未来在食品、医疗、化工、建筑、采油等行业具有广泛的应用前景。
[0145]
实施例9
[0146]
低酰基三赞胶产品的分子标记及其鉴定方法
[0147]
根据低酰基三赞胶产品的生产菌株中是对wzyc酪氨酸激酶功能的关键活性位点进行突变获得的，依次以wzyc酪氨酸激酶功能为分子标记(seq id no:1所示)进行鉴定；鉴别引物对为gt1(seq id no：6，cggaagcctatcagtcgat)和gt2(seq id no：7，cgcggtttccatattcgta)所示的核苷酸序列或为所述引物序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。具体方法如下所示：
[0148]
(1)提取低酰基三赞胶生产菌株或者低酰基三赞胶或其中轻度加工产品的基因组，作为pcr模板；
[0149]
(2)pcr扩增体系为：10～50ng/μl的dna模板：0.5μl，20μm的引物对(gt1/gt2)：0.4μl，premix taq聚合酶：12.5μl，dmso：2μl，加水至25μl；
[0150]
(3)pcr反应条件为：95℃预变性10min；94℃：45s，55℃：45s，72℃：60s，35个循环；72℃延伸10min；
[0151]
(4)电泳检测，胶回收目的片段。送至测序公司测序验证。
[0152]
当测序结果与分子标记序列完全一致时，即为原始高酰基三赞胶相关产品或其生产菌株(sphingomonas sp.nxdp(cgmcc no.15406)或者sphingomonas sp.t-3(cgmcc no.10150))；当测序结果为分子标记的任一关键位点出现突变时，即为低酰基三赞胶产品
或其生产菌株。也就是说，低酰基三赞胶产品及其生产菌株的分子标记为所述核苷酸序列seq id no：1关键活性位点的任一突变序列。主要的突变检测位点包括t-4菌株及其它三株工程菌株构建过程中所描述的包含碱基缺失、定点突变等一切失活wzyc酪氨酸激酶功能的位点。
[0153]
因此，当获得分子标记与seq id no：1所示的完全一致的核苷酸序列时检测为原始高酰基三赞胶相关产品或其生产菌株；当获得分子标记为seq id no：1所示的关键活性位点(见图6)任一位点突变的核苷酸序列时，检测为低酰基三赞胶相关产品或其生产菌株。
[0154]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。