一种用于LPIN1基因突变检测的引物、探针及检测方法

r734_f2:5
’‑
gatggcggacatgacgta-3’r734_r:5
’‑
ctgaacaggctcacagatgga-3’一种检测lpin1基因i683和r734位点突变的特异性探针，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有淬灭基团标记，其序列分别为：i683_probe:5
’‑
fam-taccaggtaggtcctgctgacttggg-bhq1-3’r734_probe:5
’‑
hex-tacctgcactgggtcaacgagagg-bhq1-3’本发明还包含以下步骤：1.从唾液或血液中提取人基因组dna作为模板dna；2.进行实时荧光定量pcr扩增，每个样本的检测分2管进行，每管加入相同的qpcr混合反应液，taqman探针、下游引物和模板dna，每管中分别加入野生型arms引物和突变型arms引物中的一种，进行lpin1基因i683或r734位点基因突变的qpcr检测；所述qpcr反应体系中，各组分的终浓度分别为:pcr缓冲液为1x；dntps为0.1-1.5mm；mgcl2为0.5-5mm；taq酶为0.05-0.1u/μl；下游引物为0.1-0.4μm；taqman探针为0.1-0.5μm；arms引物为0.1-0.4μm；模板dna为10-20ng/μl；3.所述步骤2中，进行实时荧光定量pcr扩增反应的条件为，95℃预变性3min，95℃变性3s，56℃延伸30s，40个循环；4.结果判定依据扩增曲线和δct值判定结果计算样本用野生型和突变型突变检测反应的δct值，δct值=突变型ct值-野生型ct值。
7.若扩增曲线显示野生型和突变型检测体系均有扩增信号，依据δct值=突变型ct值-野生型ct值公式计算δct值；若δct＞8，则判定为野生型；若-1＜δct＜1，则判定为杂合型；若δct＜-8，则判定为突变型；若扩增曲线显示野生型有扩增信号，突变型无扩增信号，则判定为野生型；若扩增曲线显示突变型有扩增信号，野生型无扩增信号，则判定为突变型。
8.本发明提供了一种lpin1基因复合杂合突变的arms-qpcr检测方法，本检测方法可以快速、准确、便宜、高通量给lpin1基因进行分型，其灵敏度高，特异性强，适用于常见样本如血液、唾液等，本发明操作快速简单，且检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性，减少了不必要的工作和其他费用。且荧光定量pcr采用ct值表达扩增效率，有灵敏度高，判读结果可靠等优势。
附图说明
9.图1为本发明检测某样本的lpin1基因i683位点的扩增曲线，表明此样本的基因型为i683_aa型，该样本经测序证实为野生型；图2为本发明检测某样本的lpin1基因i683位点的扩增曲线，表明此样本的基因型为i683_ac型，该样本经测序证实为杂合型；图3为本发明检测某样本的lpin1基因r734位点的扩增曲线，表明此样品的基因型为r734_gg型，该样本经测序证实为野生型；图4为本发明检测某样本的lpin1基因r734位点的扩增曲线，表明此样本的基因型
为r734_ga型，该样本经测序证实为杂合型。
具体实施方式
10.为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
11.以下实例中使用amrs引物和taqman探针检测lpin1基因i683和r734位点复合杂合突变。
12.1.arms引物设计实验设计了野生型arms引物、突变型arms引物以及共用下游引物。arms引物的3’末端碱基位于待测位点处并野生型和突变型基因相匹配，为提高引物特异性，在arms引物的3’末端第二个碱基处引入一个错配碱基，所设计的arms引物的引物序列如下：上游arms引物i683_f1:5
’‑
atttctgatattgatgggacga-3’i683_f2:5
’‑
atttctgatattgatgggacgc-3’r734_f1:5
’‑
gatggcggacatgacgtg-3’r734_f2:5
’‑
gatggcggacatgacgta-3’共用下游引物i683_r:5
’‑
agctccaactgcaccagaatt-3’r734_r:5
’‑
ctgaacaggctcacagatgga-3’2.探针设计在arms引物扩增片段内设计探针，序列要求保守，gc值为40%-70%，尽量靠近上游arms引物3’端，在探针5’端添加fam和hex荧光基团，在探针3’端添加bhq-1淬灭基团，探针序列如下：i683_probe:5
’‑
fam-taccaggtaggtcctgctgacttggg-bhq1-3’r734_probe:5
’‑
hex-tacctgcactgggtcaacgagagg-bhq1-3’3.准备pcr反应预混液pcr反应预混液各组分的终浓度分别为:pcr缓冲液为1x；dntps为0.1-1.5mm；mgcl2为0.5-5mm；taq酶为0.05-0.1u/μl；4.反应体系的优化：退火温度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，进行梯度pcr(55℃-65℃)，通过实验结果的分析确定最佳温度为56℃。对引物浓度和探针浓度进行优化后，最终的反应体系为20μl，其具体组分如下：
pcr反应程序为：95℃ 3min；40个循环：95℃ 3s，56℃ 30s（收集荧光）。所用仪器为abi viia
tm
7荧光定量pcr仪。
13.实验结果如图1所示，针对突变型的arms引物和针对野生型的arms引物的δct=8.266证明样品为野生型。如图2所示，针对突变型的arms引物和针对野生型的arms引物的δct=0.502，证明样品为杂合型。如图3所示，针对突变型的arms引物和针对野生型的arms引物的δct=10.041，证明样品为野生型。如图4所示，针对突变型的arms引物和针对野生型的arms引物的δct=-0.402，证明样品为杂合型。经dna直接测序验证，样品序列完全与arms-qpcr结果一致。经dna直接测序验证，完全与arms-qpcr结果一致。
14.上述实施例仅为本发明的优选实施例，说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种用于lpin1基因复合杂合突变检测的引物探针组合物，其特征在于包括用于扩增lpin1基因i683位点的2条arms引物和1条共用下游引物，其序列分别为：i683_f1:5
’‑
atttctgatattgatgggacga-3’i683_f2:5
’‑
atttctgatattgatgggacgc-3’i683_r:5
’‑
agctccaactgcaccagaatt-3’用于扩增lpin1基因r734位点的2条arms引物和1条共用下游引物，其序列分别为：r734_f1:5
’‑
gatggcggacatgacgtg-3’r734_f2:5
’‑
gatggcggacatgacgta-3’r734_r:5
’‑
ctgaacaggctcacagatgga-3’一种检测lpin1基因i683和r734位点突变的特异性探针，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有淬灭基团标记，其序列分别为：i683_probe:5
’‑
fam-taccaggtaggtcctgctgacttggg-bhq1-3’r734_probe:5
’‑
hex-tacctgcactgggtcaacgagagg-bhq1-3’。2.一种用于lpin1基因复合杂合突变检测的试剂盒，其特征在于包括权利要求1用于lpin1基因复合杂合突变检测的引物探针组合物。

技术总结
本发明公开了一种用于检测人类LPIN1基因复合杂合突变检测的引物、探针及检测方法，所述引物包含用于扩增LPIN1基因突变位点I683的2种ARMS引物和1种通用下游引物以及用于扩增LPIN1基因突变位点R734的2种ARMS引物和1种通用下游引物，所述探针包含2条分别用于检测LPIN1基因多态位点I683和R734的特异性探针，每一条探针包含20-30个碱基的序列，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。本发明提供的引物探针具有灵敏度高，特异性强，步骤简单，操作便捷等特点，可用于为成人肌无力患者提供分子诊断依据。提供分子诊断依据。


技术研发人员：田静 朱宏杰 张东伟
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：2021.11.25
技术公布日：2022/5/30