一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法

1.本发明涉及生物催化技术领域，尤其是，本发明涉及一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法。


背景技术：

2.2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸（ppo）是不对称合成光学纯l-草铵膦（一种低毒、广谱、安全的有机磷除草剂）的重要酮酸中间体，其除草活性是外消旋草铵膦的两倍。ppo的不对称胺化，以转氨酶或谷氨酸脱氢酶为生物催化剂，生成l-ppt，具有最大理论收率100%的优势，成为工业化生产l-ppt的一种有前途的策略。考虑到严格的立体选择性、温和的反应条件、高的回收率和简单的分离纯化过程，外消旋草铵膦的daao脱氨基反应由于其严格的d-异构体对映选择性，保留了具有除草活性的l-异构体，将是一种理想的选择。
3.外消旋草铵膦的daao脱氨基反应是一个耗氧反应，催化过程中能否提供足够的溶氧量对反应进程有决定性影响，液质中溶氧量除了与液质本身性质有关之外，主要与氧传递的推动力（c*-c
l
）和体积氧传质系数（k
l
a）有关，结合实际条件，通常采取高功率通气与加速搅拌的手段来提高供氧效率。然而，工业生产中大型反应无法提供大功率通气与高速搅拌，这就限制了外消旋草铵膦的daao脱氨基反应在工业上的大规模应用。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法。
5.考虑到工业上大型反应器能方便地提供一定的密闭性和耐高压性，本发明从反应动力学的角度，提供一种在加压条件下、d氨基酸氧化酶催化的方法制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸（ppo）的方法。
6.为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法，包括以下步骤：以外消旋型草铵膦为底物，加入共表达重组大肠杆菌湿菌体、ph调节剂调控反应体系的ph在6.5~9.0，反应过程在密封、通风、加压的条件下进行；所述重组大肠杆菌可共表达d-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶；所述反应过程至少包括以下两个阶段：第一反应阶段，控制反应体系处于第一通气量和第一压力状态；第二反应阶段，控制反应体系处于第二通气量和第二压力状态；所述第一通气量大于所述第二通气量，所述第一压力大于所述第二压力。
7.优选地，所述反应过程的反应温度为25~45℃。
8.优选地，所述反应体系中还加有消泡剂。
9.更优选地，所述消泡剂的加入量占所述反应体系总体积的0.05~5%。
10.优选地，所述反应体系中所述外消旋型草铵膦的浓度为50~500 mmol/l，所述重组
大肠杆菌的加入量为5~20g/l。
11.优选地，所述ph调节剂为氨水。
12.优选地，所述第一通气量和所述第二通气量均控制在0.1~5vvm。
13.优选地，所述第一压力和所述第二压力均控制在0.02~1.5mpa。
14.更优选地，所述第一通气量和所述第二通气量均控制在0.1~2vvm，所述第一压力和所述第二压力均控制在0.02~0.1mpa。
15.优选地，所述反应过程中的搅拌速度控制为50~500rpm。
16.与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：本发明的一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法通过加压的方式提高反应过程中氧传递的推动力和体积氧传质系数，避免高功率通气和强搅拌的缺陷；在反应过程中，通过控制反应过程不同反应阶段的通气量和压力以使得反应体系中的d-氨基酸氧化酶保持较高的酶催化活性，缩短催化反应时间并提高酶催化转化效率。本发明的一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法具有工业大规模生产应用的前景。
17.本发明的附加优点、目的以及特征将在下面的描述中将部分地加以阐述，且将对于本领域普通技术人员在研究下文后部分地变得明显，或者可以根据本发明的实践而获知。
18.本领域技术人员将会理解的是，能够用本发明实现的目的和优点不限于以上具体所述，并且根据以下详细说明将更清楚地理解本发明能够实现的上述和其他目的。
附图说明
19.图1为本发明实施例提供的酶催化反应原理图；图2为本发明实施例提供的不同反应条件下d-氨基酸氧化酶的酶活性对比图。
具体实施方式
20.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
21.须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
22.此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
23.d氨基酸氧化酶的酶活容易被反应过程中产生的副产物过氧化氢h2o2氧化而损失活性，反应进程中的共表达菌株表达的过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧气。同时在气液界面上，酶与氧气长时间接触会损失一定活性，即连续曝气会对蛋白质结构（即酶活性）
产生负面影响。在具体酶促反应实验中，d-氨基酸氧化酶在实际反应过程中后期酶活会损失，导致底物被完全转化的时间拉长，所以本发明实施例提供一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法，包括以下步骤：以外消旋型草铵膦（d,l型草铵膦，d,l-ppt）为底物，加入共表达重组大肠杆菌湿菌体、ph调节剂调控反应体系的ph在6.5~9.0，反应过程在密封、通风、加压的条件下进行；其中，重组大肠杆菌可共表达d-氨基酸氧化酶（daao）和过氧化氢酶；且反应过程至少包括以下两个阶段：第一反应阶段，控制反应体系处于第一通气量和第一压力状态；第二反应阶段，控制反应体系处于第二通气量和第二压力状态；其中，第一通气量大于第二通气量，第一压力大于第二压力。
24.本发明的第一反应阶段指反应前期，第二反应阶段指反应后期，即在反应过程中控制反应前期的通气量和压力高于反应后期的通气量和压力。在反应过程中，结合反应动力学，采取逐步降低通气量和降低反应体系压力的手段来使得反应过程中d-氨基酸氧化酶始终保持在较高的酶活水平，以消除高压环境和高溶氧环境对d-氨基酸氧化酶的活性负面影响。
25.本发明的酶催化反应原理如图1所示。本发明的一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法通过加压的方式提高反应过程中氧传递的推动力和体积氧传质系数，避免高功率通气和强搅拌的缺陷；在反应过程中，通过控制反应过程不同反应阶段的通气量和压力以使得反应体系中的d-氨基酸氧化酶保持较高的酶催化活性，缩短催化反应时间并提高酶催化转化效率。本发明的一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法具有工业大规模生产应用的前景。
26.优选地，第一通气量和第二通气量均控制在0.1~5vvm。优选地，第一压力和第二压力均控制在0.02~1.5mpa。更优选地，第一通气量和第二通气量均控制在0.1~2vvm，即在30l反应体系中通气3~60 l/min。第一压力和第二压力均控制在0.02~0.1mpa。
27.在本发明的具体实施例中，按照反应进程的发展，将反应过程划分为三个阶段：第一反应阶段，即反应前期，控制反应体系处于第一通气量和第一压力状态；第二反应阶段，即反应中期，控制反应体系处于第二通气量和第二压力状态；第三反应阶段，即反应后期，控制反应体系处于第三通气量和第三压力状态。
28.其中，反应前期、反应中期、反应后期的通气量和压力按照递减的顺序设置。反应开始前，反应体系的溶氧量水平维持在7.4~8.0 mg/l。反应开始后，初始反应速率较快，反应体系中的溶氧值维持在较低水平，在0~1 mg/l之间；当反应体系溶氧值回升至3.0~9.0 mg/l左右时，可进行相应的减少通气量与减压手段，将通气量降低至原来的1/2~3/4，压力减少到原来的1/3~2/3，一方面降低能源消耗，另一方面可维持酶活性。
29.本发明实施例中的通气指的是通入空气，实施例中采用的重组大肠杆菌为课题组前期研究构建获得，为共表达d-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶突变体的重组大肠杆菌。（菌株制备过程公开于文献《journal of biotechnology 325(2021)372-379》）为使得催化反应酶处于较高的酶催化活性水平，优选地，反应过程的反应温度为25~45℃。
30.反应过程中的剪切搅拌会使反应体系中产生气泡，为消除气泡的影响，优选地，反
应体系中还加有消泡剂。更优选地，消泡剂的加入量占所述反应体系总体积的0.05~5%。进一步地，消泡剂的加入量占所述反应体系总体积的0.1~2.5%。优选地，反应过程中的搅拌速度控制为50~500rpm。进一步地，反应过程中的搅拌速度控制为200~400rpm。
31.优选地，反应体系中外消旋型草铵膦的浓度为50~500 mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为5~20g/l。更优选地，反应体系中外消旋型草铵膦的浓度为300~500 mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为10~15g/l。
32.优选地，本发明实施例使用氨水作为ph调节剂。
33.以下结合具体实施例做进一步说明。
34.实施例1：恒通气恒压条件在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。通气量为0.5 vvm，压力为0.05 mpa，搅拌速度为250 rpm。
35.反应12h时，底物d型草铵膦转化率为94.9 %。反应24h后底物转化率为98.7 %，最终产物收率可达到45.8 %。
36.实施例2：低通气恒压条件在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。通气量为0.25 vvm，压力为0.075 mpa，搅拌速度为250 rpm。
37.反应12h时，底物d型草铵膦转化率为96.8 %。反应24h后，底物转化率为99.3 %，最终产物收率可达到46.5 %。
38.实施例3：高通气恒压条件在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。通气量为1.0 vvm，压力为0.075 mpa，搅拌速度为250 rpm。
39.反应12h时，底物d型草铵膦转化率为96.1 %。反应24h后，底物转化率为99.1 %，最终产物收率可达到46.4%。
40.实施例4：变通气恒压条件在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。在反应0~4 h时通气量设置1.0 vvm；4~8 h通气量降低为0.5 vvm；8~12 h通气量降低为0.25 vvm，压力始终保持为0.075 mpa，搅拌速度为250 rpm。
41.反应12 h后底物d型草铵膦被完全转化，最终产物收率可达到46.9 %实施例5：变通气变压条件在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。在反应0~4 h时通气量设置1.0 vvm，压力为0.1mpa；4~8 h通气量降低为0.5 vvm，压力为0.075mpa；8~12 h通气量降低为0.25 vvm，压力为0.05 mpa，搅拌速度为250 rpm。
42.反应在10 h后底物底物d型草铵膦被完全转化，最终产物收率达到47.2 %。
43.对比例1：恒通气常压条件
在30l反应釜中进行酶催化反应，底物d,l型草铵膦的浓度为400mmol/l，共表达重组大肠杆菌的加入量为15g/l。ph调控在8.0，反应温度为30℃，消泡剂投量为0.1%。通气量为0.5 vvm，压力为常压，搅拌速度为250 rpm。
44.反应12h时，底物d型草铵膦转化率为90.1 %。反应24h后，底物转化率为92.4 %，最终产物收率可达到41.5 %。
45.实施例1和对比例1表明，相比于常规反应，即在常压条件下进行通气反应，加压条件下具有更快的反应转化率。
46.实施例1~实施例5对比相比，在反应过程中，采用变通气量变压力条件相比于恒通气量恒压力条件，反应在更短的时间内就可实现底物的完全转化。
47.对本发明实施例不同反应条件下的d氨基酸氧化酶的酶活性进行测试，选取恒通气常压条件下（对比例1）的d氨基酸氧化酶、恒通气恒压条件下（实施例1）的d氨基酸氧化酶和变通气变压条件下（实施例5）的d氨基酸氧化酶作为测试对象。
48.d-氨基酸氧化酶活性测定采用过氧化物酶-邻联茴香胺法（引自文献biochemica information i, boehringer manheim gmbh, biochemica, germany, 1973, pp. 41）。反应混合物包括缓冲-底物（d-蛋氨酸，10 m）溶液、磷酸钠钾缓冲液（ph 8.0， 0.2 m）、邻二茴香胺、悬浮于硫酸铵溶液（3.2 m）中的过氧化氢酶（300 u/cm3）和取样的含d-氨基酸氧化酶反应溶液，最终体积为1 cm3。不含酶的混合物在30℃预孵育，通过加入含d-氨基酸氧化酶（100 μl）反应液开始反应10 min，d-氨基酸氧化酶氧化底物d-蛋氨酸，生成副产物过氧化氢和产物2-氧代-4-甲基硫代丁酸。过氧化氢和邻二茴香胺（10 m）反应形成的棕色通过分光光度计在436 nm处测定。测试结果如图2所示。
49.在同样的体系下，重组大肠杆菌湿菌体的比酶活初始值为120 u/g dcw左右。从图2中看到，恒通气常压下酶活损失最小，在12 h仍残余81.0 u/g dcw；恒通气恒压模式（0.5 vvm，0.05mpa）下，酶活损失较大，在12时仅有37.9 u/g dcw；变通气变压模式下，酶活在12 h有59.6 u/g dcw。表明本发明在反应过程中采用变通气变压模式（相比于恒通气恒压）可以降低d-氨基酸氧化酶的酶活损失，使得d-氨基酸氧化酶在整个反应过程中始终维持较高酶催化活性，进而可以在更短的反应时间内将反应底物完全催化转化。
50.本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。