一种利用筛选的微生物或酶转化蓝草增产靛蓝和靛玉红的方法

1.本发明涉及化合物的提取方法，特别涉及一种利用筛选的微生物或酶转化蓝草增产靛蓝和靛玉红的方法。


背景技术：

2.蓝草是一类用以生产靛蓝染料植物的总称，凡是可以制取靛蓝的植物均可称作为“蓝”(周江波，邓小红.天然靛蓝植物生化及分子生物学研究进展[j].北方园艺，2018(01)：160-166.)，靛蓝染料的制作工艺已流传上千年，常用于制靛的植物包括爵床科(acanthacea)的马蓝(baphicacanthuscusia(nees)bremek.)、十字花科(cruciferae)的菘蓝(isatisindigotica fortune)、豆科(leguminosae)的木蓝(indigoferatinctoria linn)以及蓼科(polygonaceae)的蓼蓝(polygonumtinctoriumait.)等，发明人在对蓝草高效生物转化靛蓝和靛玉红的同时，开发了以蓝草为原料产黑色素的方法(一种利用蓝草或蓝草加工剩余物制备黑色素的方法，cn2021106832815，2021-06-18.)。
[0003]
马蓝(baphicacanthuscusia(nees)bremek.)为爵床科(acanthacea)板蓝属(baphicacanthus)多年生草本植物，与十字花科(cruciferae)菘蓝属(isatis)植物菘蓝(isatisindigotica fortune)分别称为北板蓝和南板蓝，其茎和叶是制作中药青黛的主要原材料。图1为马蓝(左)和菘蓝(右)。
[0004]
马蓝主要分布于中国华南、西南等地区，福建省野生马蓝资源丰富且栽培历史悠久，以福建马蓝为原料制成的中药“建青黛”，因其高品质而相当著名(周心怡.建青黛加工工艺及质量标准研究[d].华侨大学，2019.)。青黛具有清热解毒、凉血消斑、泻火定惊等功效，其主要活性物质为靛蓝(indigo)和靛玉红(indirubin)。图2为靛蓝和靛玉红的分子结构。
[0005]
木蓝(indigoferatinctoria linn)为豆科木蓝属植物，又名槐蓝、野青靛。具有清热解毒，凉血止血之功效。主治乙型脑炎，腮腺炎，急性咽喉炎，淋巴结炎，目赤，口疮，痈肿疮疖，丹毒，疥癣，虫蛇咬伤，吐血。
[0006]
蓼蓝(polygonumtinctoriumait.)是蓼科蓼属一年生草本植物。蓼蓝喜温暖和湿润的气候，对土壤要求不严。是主要的天然蓝色植物染料的原材料之一，蓼蓝还是常用的药用植物，叶有清热解毒之效。
[0007]
靛蓝(indigo)是一种古老的色素类物质，广泛应用于食品、医药和印染工业中，靛玉红(indirubin)在临床上常用于治疗慢性粒细胞白血病等恶性肿瘤(王雪，孙长岗.青黛作用于急性幼粒细胞白血病的可视化“药靶蛋白模型”分析[j].世界中医药，2020，15(12)：1692-1698 1704.)。靛蓝和靛玉红作为一对同分异构体，其在天然物料中的形成途径存在差异，蓝草鲜叶中存在生成靛蓝与靛玉红的吲哚类前体物质吲哚苷。其叶片在浸泡发酵过程中，苷类在酶解作用下形成吲哚酚(indoxyl)阴离子，吲哚酚阴离子在体系中不稳定易被氧化形成吲哚酚，两分子吲哚酚缩合形成对称的靛蓝，吲哚酚进一步氧化形成吲哚醌
(isatin)，一分子吲哚醌则与一分子吲哚酚缩合形成靛玉红。(杨明，刘泽玉，苏柘僮，邹文铨.“蓝”类植物中的前体物质转化为“靛”的机制探讨[j].中国中药杂志，2010，35(07)：928-931)
[0008]
目前常用的的靛玉红合成方法是碱催法，即利用吲哚醌和吲哚乙酸酯缩合反应(姬长安，于健，严国兵.靛玉红及其衍生物的合成与研究进展[j].广州化工，2020，48(20)：16-19)。工业上利用靛蓝还原制成吲哚醌，在酸性条件下与吲哚酚钾溶液反应合成靛玉红，其过程如图3所示。人工化学合成靛玉红的方法收率较高，但其副产物多且有机溶剂消耗大，生产安全性低，产生大量的工业废弃物对环境不友好，不利于环境的可持续性发展。中国蓝草资源丰富，广泛分布于中国华南、西南等地区，其马蓝、蓼蓝、菘蓝和大青叶等均是能有效生产靛蓝和靛玉红的天然绿色物料。蓝草的人工栽培历史悠久，传统方法利用丰富的蓝草资源发酵制备靛蓝和靛玉红，不仅安全、副产物少、毒性低而且废料排放率低对环境友好，是一条具有发展前景的可持续性绿色道路。图3为靛玉红人工合成反应。
[0009]
为了提高蓝草制备靛蓝和靛玉红的效率，近年来不少学者提出了创新的方法，发明专利(一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法，cn201911138091.4，2019-11-20)利用马蓝鲜叶定向生成靛玉红，将马蓝鲜叶在ph为7的水中边通氧边搅拌48h，加碱后加热至60℃并通气搅拌1h。为了实现连续加热通氧搅拌工作，发明人还开发了可持续加热浸泡并搅拌的装置(一种用于马蓝鲜叶靛提取用加热浸泡装置，cn 201922098119.8，2019-11-29)和发酵液过滤装置(一种用于马蓝鲜叶浸泡发酵用过滤装置，cn 201922098511.2，2019-11-29)。吲哚酚在氧气充足条件下氧化成吲哚醌，吲哚醌与吲哚酚缩合形成靛玉红，然而在定向生成靛蓝的工艺中，靛玉红的生成不利于靛蓝的显色，是降低以靛蓝色素为目标物品质的副产物。
[0010]
一种靛蓝的提取方法(cn202110063213.9)为了提高靛蓝的品质，提出在蓝草浸泡过程中通入氮气或二氧化碳，以降低溶解氧，调节滤液ph为酸性至靛蓝沉淀，从而减少靛玉红的产生。通过改变氧气含量与通氧时机在靛蓝和靛玉红的定向生成中起着重要作用，本质上是在改变吲哚酚的去向路径，并没有提高发酵液中前体物质的含量，虽然有助于改变靛蓝和靛玉红的相对含量，但是忽略了蓝草物料中未析出的大部分前体物质，浸泡后直接将滤渣丢弃，不仅造成原料浪费，而且产生大量废渣。滤液中吲哚苷水解成为吲哚酚阴离子过程中，去糖基反应不完全，会造成物料的浪费。
[0011]
一种青黛的制备方法(cn201811208405.9)提出提高蓝草浸泡的温度至90℃，并在滤液中添加盐酸进行水解，以氢氧化钠或氨水代替石灰，避免传统工艺中“水飞”步骤，以提升青黛的靛蓝和靛玉红纯度。发明专利(马蓝鲜叶制备靛蓝的方法，cn 201911132336.2)为了利用马蓝鲜叶定向生成靛蓝，也提出将马蓝鲜叶在酸性溶液下浸泡，滤液用氢氧化钠代替石灰，在80℃条件下边通氧边搅拌。发明专利(采用马蓝鲜叶制备靛蓝、靛玉红的方法，cn201911138109.0)提出了利用马蓝鲜叶在酸性环境下边通气边搅拌48h，加碱调节ph值，以吸附树脂代替石灰。传统工艺添加石灰的目的是为吲哚酚与吲哚醌的缩合反应提供碱性环境，以及作为靛蓝和靛玉红的附着剂，但青黛成品中含有大量石灰，会降低青黛的治疗效果，以氢氧化钠或吸附树脂代替石灰，确实提高了靛蓝和靛玉红的纯度，但是本质上靛蓝的靛玉红的来源和添加石灰的来源相同，与提高靛蓝和靛玉红的得率无关。另一方面，利用高温和酸性环境促进蓝草中前体物质的析出和吲哚苷的去糖基反应，以提升靛蓝和靛玉红的
得率，盐酸、氢氧化钠溶液在高温下反应均存在较大的安全隐患，工序复杂不利于生产。
[0012]
有学者认为，蓝草鲜叶中本身存在原生靛，与浸泡发酵过程中产生的转化靛共同构成产物中靛蓝和靛玉红的组成部分，原生靛中的靛蓝、靛玉红、色胺酮、吲哚等成分对部分微生物具有抑制和杀灭作用，塑造微生物初态。(杨明，张定堃，贺亚男等.青黛产业高质量发展的挑战与策略[j].中国中药杂志，2021，46(13)：3171-3179)。
[0013]
青黛炮制过程中，不仅是内源酶与氧气的作用，微生物也是促进转化的动力源之一。蓝草的传统制靛发酵工艺中，微生物来源于自然环境，用于分解蓝草叶片释放前体物质和内源性酶类。变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门是发酵初期的主要优势群落，随着发酵的进行，微生物结构不断变化，变形菌门随着发酵时间增加，相对丰度逐渐降低，打靛后降至最低；厚壁菌门相对丰度升高，拟杆菌门先下降后升高(贺亚男，马乐乐，吴意等.青黛炮制浸泡发酵环节微生物群落结构与吲哚类成分转化研究[j].中国中药杂志，2021，46(13)：3180-3187)；部分微生物为改善其生存状态，会分泌降解或合成靛类物质的酶，进一步促进体系中前体物质的转化。
[0014]
发明专利(一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法，cn201911138113.7，2019-11-20)提出预先浸泡马蓝叶柄、老枝得到菌液，加入至马蓝鲜叶中以缩短浸泡时间，但附着于叶柄和老枝上的微生物来源于空气、土壤和水源等自然环境，微生物品种复杂多样，与不同品种蓝草的生长地域、环境和季节等外界条件有关，增产效果不稳定。


技术实现要素：

[0015]
发明目的：本发明提供了一种利用筛选的微生物或酶转化蓝草增产靛蓝和靛玉红的方法。
[0016]
技术方案：本发明所述的利用筛选的微生物或酶转化蓝草增产靛蓝和靛玉红的方法，将蓝草直接使用或经冷冻处理、研磨处理、微波处理、揉捻处理、杀青处理等前处理后，接入筛选培养后的微生物或加入这些微生物所产酶液进行转化，使蓝草中生成靛蓝和靛玉红的前体物质转化成靛蓝和靛玉红。
[0017]
将蓝草直接使用或经前处理后，接入筛选培养后的微生物或加入这些微生物所产酶液进行转化，使蓝草中生成靛蓝和靛玉红的前体物质转化成靛蓝和靛玉红。
[0018]
所述蓝草为爵床科(acanthaceae)植物马蓝(baphicacanthuscusia(nees)bremek.)、十字花科(brassicaceae)植物菘蓝(isatisindigotica fortune)、豆科(leguminosae)植物木蓝(indigoferatinctorialinn)、蓼科(polygonaceae)植物蓼蓝(polygonumtinctorium ait.)、马鞭草科(verbenaceae)植物大青(clerodendrumcyrtophyllum turcz.)或夹竹桃科(apocynaceae)植物蓝树(wrightialaevis hook)中的一种或多种。
[0019]
进一步地，所述前处理是蓝草经冷冻处理后迅速回温并研磨处理。
[0020]
进一步地，所述前处理是蓝草物料经微波处理后加揉捻处理或杀青处理。
[0021]
进一步地，所述微生物为酵母菌(saccharomyces)。
[0022]
进一步地，所述微生物为绿杆菌(bacillus aerius)及其所产酶。
[0023]
进一步地，所述微生物为气味拟杆菌(paenibacillusodorifer)及其所产酶。
[0024]
进一步地，所述微生物为根霉(rhizopus)及其所产酶。
[0025]
进一步地，所述微生物为瑞氏假单胞菌(pseudomonas reidholzensis)及其所产酶。
[0026]
进一步地，所述微生物为普通变形菌(proteus vulgaris)及其所产酶。
[0027]
针对制备靛蓝和靛玉红方法中对环境污染大、蓝草前体物质析出利用不充分、生产安全性低、工艺复杂和成本昂贵等问题，本发明提出了将蓝草物料进行冷冻处理、研磨处理、微波处理、揉捻处理、杀青处理等前处理方法，有利于前体物质和内源酶的快速充分析出，大大提高蓝草物料的利用率。
[0028]
马蓝鲜叶经过微波揉捻处理和冷冻研磨处理后，未经前处理对照组发酵液中吲哚苷量随浸泡时间的延长而逐渐增多，而经冷冻研磨处理或微波揉捻处理后吲哚苷含量在浸泡初期就远高于对照组(图4)。
[0029]
另一方面，微生物发酵是条件温和，与化学处理相比更绿色环保。本发明利用筛选的优选功能微生物接种至蓝草物料中发酵，促进吲哚苷转化为吲哚酚阴离子，增加吲哚苷前体物的利用率，以增产靛蓝和靛玉红量，避免大量酸碱溶液和有机溶剂的使用，提高生产安全性，减少工业废弃物的排放。
[0030]
本发明通过筛选对蓝草发酵更优的微生物，分离纯化后重新接种至蓝草鲜叶中发酵，对能提升靛蓝和靛玉红含量的菌株进行扩培、复壮和鉴定，得到转化效果稳定、可持续性利用的菌株。
[0031]
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
[0032]
1、利用简单的前处理，通过将蓝草物料进行冷冻、研磨、微波、揉捻、杀青等方法，利于前体物质和内源酶的快速析出，增加蓝草物料的利用率。
[0033]
2、利用优选的功能微生物接种至蓝草物料中发酵，促进了吲哚苷转化为吲哚酚阴离子，增加吲哚苷前体物的利用率，以增产靛蓝或靛玉红量，避免大量酸碱溶液和有机溶剂的使用，提高生产安全性，减少工业废弃物的排放。
附图说明
[0034]
图1为马蓝(左)和菘蓝(右)；
[0035]
图2为靛蓝和靛玉红的分子结构；
[0036]
图3靛玉红合成反应流程简图；
[0037]
图4处理前后马蓝发酵液中吲哚苷含量的对比；
[0038]
图5为不同前处理及传统法得到靛泥的tlc图；
[0039]
图6不同菌株发酵马蓝产靛玉红tlc图；
[0040]
图7不同菌株发酵马蓝产靛蓝和靛玉红量；
[0041]
图8功能菌发酵马蓝产靛蓝和靛玉红的hplc分析。
具体实施方式
[0042]
实施例1
[0043]
取马蓝新鲜叶1.0kg经微波处理后，趁热揉捻出浆，加水处理15d后过滤，滤液加预制石灰水，通入空气30min，静置沉淀去上清，下层泥状物即为含靛蓝和靛玉红的蓝靛泥。低温烘干至恒重，研磨成粉末状，得靛蓝和靛玉红产品35.2g.
[0044]
实施例2
[0045]
取马蓝冻藏叶1.0kg，快速回温，研钵研磨成匀浆，加水10d，料液中加预制石灰水，通入空气30min，静置沉淀，去上清液，下层泥状物即为含靛蓝和靛玉红的蓝靛泥粗品。低温烘干至恒重，研磨成粉末状，得产品45.8g.
[0046]
实施例3
[0047]
取马蓝鲜叶1.0kg进行杀青处理，加水转化15d，发酵液中加预制石灰水，通入空气30min，静置沉淀，去上清液，下层泥状物即为含靛蓝和靛玉红的蓝靛泥粗品。低温烘干至恒重，研磨成粉末状，得产品47.2g.
[0048]
实施例4
[0049]
将绿杆菌接种至常规培养基中培养，取马蓝新鲜叶1kg，按照实施例1的前处理方式得到出浆的马蓝物料，按0.1％接种量接入酵母发酵6d，发酵液加预制石灰水，通入空气30min，静置沉淀，去上清液，低温烘干下层泥状物至恒重，研磨成粉末状，得产品66.3g.
[0050]
实施例5
[0051]
将厚壁菌接种至常规液体或固体培养基中培养，取马蓝新鲜叶，按照实施例2的前处理方式，加入菌液或菌粉发酵转化5d，发酵液加入预制石灰水，通氧，静置沉淀，得靛泥产品得产品68.9g.
[0052]
实施例6
[0053]
将变形菌接种至培养基中培养，取马蓝新鲜叶1kg，按照实施例3的前处理方式，加入菌液或菌粉恒温发酵转化6d，发酵液加入预制石灰水，通氧，静置沉淀，得产品77.3g.
[0054]
实施例7
[0055]
将实施例6中的菌株更换为气味拟杆菌，其他条件保持不变。得产品65.8g.
[0056]
实施例8
[0057]
将实施例6中的菌株更换为瑞氏假单胞菌，其他条件保持不变。得产品72.0g.
[0058]
实施例9
[0059]
将实施例6中的菌株更换为高温酵母菌，培养得菌液，在50度转化2天。得产品90.1g
[0060]
实施例10
[0061]
将实施例4中的菌株更换为根霉，培养得菌液，其他条件保持不变。得产品93.0g.
[0062]
实施例11
[0063]
将实施例5中的蓝草物料换为菘蓝。
[0064]
实施例12
[0065]
将实施例6中的蓝草物料换为木蓝。
[0066]
实施例13
[0067]
将实施例4中的蓝草物料换为蓼蓝。
[0068]
实施例14
[0069]
将实施例4中的蓝草物料换为大青。
[0070]
实施例15
[0071]
将实施例4中的蓝草物料换为蓝树。
[0072]
实施例16
[0073]
将实施例5中的菌换为其所产酶。
[0074]
实施例17
[0075]
将实施例6中的菌换为其所产酶。
[0076]
实施例18
[0077]
将实施例7中的菌换为其所产酶。
[0078]
性能测试：
[0079]
实验1：不同前处理对马蓝生成靛蓝和靛玉红的影响
[0080]
先按传统法得到蓝靛泥。然后在传统法的基础上，对马蓝鲜叶进行不同前处理，方法见表1。
[0081]
表1不同前处理方法
[0082][0083]
经薄层色谱法(tlc)分析，分别将靛蓝和靛玉红混合标准品和各组供试样品点样进行tlc检验，得到展开图5，图5中点样顺序从左至右分别为靛蓝靛玉红混合标准品(hl)、剪碎法(q1)、研磨法(q2)、破壁法(q3)、微波揉捻法(q4)、冻融研磨法(q5)、传统法(q6)。
[0084]
由图5可见，靛蓝和靛玉红标准品在硅胶薄层板上有明显条带，蓝色(上)条带为靛蓝，红色(下)条带为靛玉红，说明本实验使用的tlc条件能有效的将两者分离开；对比6组样品条带结果可知，经5天时间的发酵，均有靛蓝产生，微波揉捻法和冻融研磨法有明显靛玉红条带出现，说明这两种前处理有利于靛玉红的生成。
[0085]
本发明提供的对马蓝原料的前处理方法，微波揉捻和冻融研磨处理马蓝原料的料液中吲哚苷含量在转化初期大幅度析出，其中吲哚苷含量在4h内升至高至最大值，4～10h吲哚苷浓度处于稳定水平，第11h开始，吲哚苷含量开始大幅度下降，前体物转化反应开始发生。而传统法处理马蓝原料在0～6h几乎无吲哚苷析出，吲哚苷含量保持在低水平，7～11h内液中吲哚苷含量随发酵时间的延长而逐渐升高，12h后吲哚苷含量逐渐下降，前体物进入转化反应。
[0086]
实验2：将从蓝草发酵液中筛选出的菌分别标记为fs-1、fs-2、by和sy组，分别接入研磨后得马蓝鲜叶中，无菌水作为空白对照(ck)，28℃恒温转化5d。tlc检测，展开结果见图6，hplc结果见图7。
[0087]
由图7可知，4株菌接种至马蓝鲜叶中转化发酵，与对照组相比较，靛蓝峰面积低于对照组，靛玉红峰面积均高于对照组，其中fs-1、fs-2和sy三组的靛玉红得率均明显高于对照组，与tlc结果相符，证实优选菌的加入可大大增加靛玉红的产量。图8为加入fs-1菌处理所得料液的hplc分析图。