一种禽β-防御素9工业化发酵工艺

一种禽
β-防御素9工业化发酵工艺
技术领域
1.本发明属于基因技术领域，具体提供了一种禽β-防御素9工业化发酵工艺。


背景技术：

2.防御素是一种广泛存在于动植物体内的小分子抗菌肽，分子内由6～8个半胱氨酸残基构成3～4对分子内二硫键，成熟肽大约有38～42个氨基酸，分子量约为3ku～4ku。它具有抗革兰氏阴性菌(g-)、革兰氏阳性菌(g

)、原生动物、某些真菌以及被膜病毒(例如疱疹类病毒)的特性，在机体的获得性免疫和天然免疫中都发挥着十分重要的作用。根据其来源、表达位置的不同、分子内特征可分为无脊椎动物防御素、植物防御素。其中，脊椎动物防御素又分为：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。
3.β-防御素由63～71个氨基酸残基组成，而成熟肽则由38～42个氨基酸残基组成，分子中的6个半胱氨酸通常以cys-1c～ys-5、cys-2～cys-4、cys-3～cys-6式形成3对分子内二硫键。β-防御素是由1个内含子和2个外显子构成，防御素的信号肽和一部分前片段序列由外显子编码，而外显子则负责编码部分前片段和成熟肽序列。β-防御素根据其同源性、大小及基因的结构，可分为三类：第一类是具有短的前原序列(63～64个氨基酸)和短的内含子(＜1.6kbp)；第二类是具有长的前原序列(68～69个氨基酸)和长的内含子(＞6.5kbp)；第三类即是禽类的β-防御素(avbds)，它们在氨基酸和核苷酸序列上有很高的相似性。由于之前对于禽β-防御素的命名较为混乱，2007年国际上对已经发现的禽β-防御素重新进行了统一的命名，所有来源的禽抗菌肽均被命名为禽β-防御素(avian-defensin，avbd)。
4.avbd9基因的cdna全长为231bp，共编码76个氨基酸，avbd9在鸡组织中表达中非常广泛，但会因为鸡的品种不同而存在一些差异，广泛分布于皮肤、消化道及呼吸道黏膜，在气管、食道、肝、肾高水平表达，是鸡天然免疫的重要组成部分。
5.1988年，alv-j(avian leukosis virus subgroup j，alv-j)在英国首次从肉鸡中分离得到j亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup j，alv-j)属于反转录病毒科，甲型反转录病毒属。研究表明，alv-j是一种由禽外源性alv和内源性反转录病毒囊膜(e51)重组而成的禽白血病亚群。alv-j主要引起包括成红细胞瘤、血管瘤、髓细胞瘤、肾瘤和肉瘤等肿瘤，死亡率一般为1％～5％，高峰期可达到50％。自1998年起，从鸡中首次分离以来，alv-j在全世界广泛流行，并且成为了困扰我国养禽业发展的主要疫病之一。在过去20年里，alv-j一直是引发我国各类鸡群白血病流行的主要亚群，与alv-j相关的各种疾病已成为我国养禽业面临的最大挑战之一。本病几乎危害到所有商品鸡群，但出现临床症状的病鸡数量比较少，很多感染鸡群出现生产性能的下降，尤其是产蛋率及蛋的品质下降和其导致的免疫抑制所带来的风险隐患，已经成为危害世界商品鸡产业的重要疫病之一，给全球养禽业带来了非常严重的经济损失。
6.因此如何更好的利用防御素防治alv-j成为本领域技术人员亟待解决的问题之一。


技术实现要素：

7.本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种禽β-防御素9工业化发酵工艺，发明人首先提供了一种pet22b-his-avbd9重组表达系统，并通过优化发酵罐的发酵条件，提高了avbd9在大肠杆菌的表达量，在1l发酵的大肠杆菌菌液中最终表达量可以得到4～5mg avbd9，用于大规模工业化生产avbd9。avbd9在体外可以有效的抑制alv-j的转录和翻译，为今后alv-j的控制提供了一种新的策略。
8.本发明的具体思路是：
9.通过构建含有avbd9的基因片段，将avbd9的基因克隆至pet22b(载体自带his标签)原核表达载体，再将重组表达载体转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，制备大量的含有原核表达载体的大肠杆菌，提取足够量的含有avbd9的基因片段的质粒，再将其转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，构建出pet22b-his-avbd9重组表达系统，经过一系列表达及其蛋白纯化条件的摸索，利用发酵罐发酵的方式制备出avbd9。
10.本发明的具体技术方案是：
11.发明人首先获得了avbd9核苷酸序列，如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；在此基础上，发明人构建了pet22b-his-avbd9重组质粒，发明人进一步对其进行了原核表达及蛋白纯化，具体步骤如下：
12.将上述avbd9重组表达质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，通过含有氨苄霉素的lb固体培养基中筛选出具有阳性质粒的大肠杆菌，通过测序筛选出含有avbd9重组表达质粒的大肠杆菌；再从上述含有avbd9表达质粒的大肠杆菌中提取质粒，将其转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中，通过含有氨苄霉素的lb固体培养基中筛选出具有阳性质粒的大肠杆菌，通过测序筛选出能够表达avbd9的大肠杆菌。
13.avbd9原核表达蛋白制备工艺的建立：用1l的锥形瓶分别探索适合能够表达avbd9的大肠杆菌生长的最佳条件，最终确定的最佳发酵条件包括最佳温度(37℃)、最佳加入诱导剂iptg时间(大肠杆菌od 600为0.8)、最佳诱导剂iptg浓度(1mmol/l)等条件。
14.我们可以同比例扩大到发酵罐(10l)的培养，其培养条件如下:首先是制备种子液，取500ml锥形瓶分别加入100ml lb液体培养基、100μl amp(氨苄)、1ml能够表达avbd9的大肠杆菌于37℃220r/min的摇床上培养12h得到种子液；
15.然后将10l lb液体培养基、100ml上述的种子液以及10ml amp(氨苄)加入到发酵罐中，保持37℃220r/min发酵条件，等到发酵罐中培养基od 600为0.8时，加入47.6mliptg，继续发酵培养6h结束。
16.利用发酵罐在上述最佳培养条件下大规模发酵生产大肠杆菌，从而高产表达avbd9，建立avbd9原核表达小肽工艺。
17.avbd9原核表达小肽纯化工艺的建立：收集诱导表达的菌液，离心去除上清后加pbs重悬菌体，用超声破碎仪进行超声破碎裂解蛋白，离心收集破碎后的包涵体，使用使蛋白变性的、含有8m尿素的le buffer 4℃过夜溶解包涵体次日离心去除沉淀后，使用镍离子层析柱纯化溶解包涵体后的蛋白，最终利用尿素设置浓度梯度配制蛋白复性液对蛋白进行复性，使其恢复生物学活性。经检测，从1l上述发酵获得的大肠杆菌菌液中可以得到4-5mg avbd9。
18.上述获得的重组avbd9可以抑制alv-j，具体通过以下方法检测验证：
19.首先，进行细胞毒性检测(cck-8),主要是为了确定重组avbd9浓度对df-1细胞的影响，筛选出avbd9对df-1细胞的最小影响浓度，并以此浓度设立浓度梯度，确定avbd9对alv-j的最小抑制浓度。
20.将纯化复性后的avbd9进行df-1细胞实验，将df-1细胞传至12孔板中，待细胞密度70％-80％时接入alv-j，感染1h后换成1％dmem培养基进行维持。维持24h，再向其中接种不同浓度的avbd9，分别维持到24h、48h、72h后收集细胞。
21.将不同组收集到的细胞提取rna并逆转录成dna和裂解蛋白，分别用real-time pcr和western blot检测，结果证明重组avbd9在体外可以有效地抑制alv-j的转录和翻译。
22.与现有技术相比，本发明的有益成果是，本发明构建了avbd9原核表达系统，并通过优化发酵罐的发酵条件，提高了avbd9在大肠杆菌的表达量。利用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后采用不同浓度的尿素对变性的蛋白进行透析复性，使变性的蛋白重新折叠，恢复其生物活性，最终得到的纯度≧90％的avbd9。经过优化后的发酵条件，1l发酵的大肠杆菌菌液最终可以得到4～5mg avbd9。本发明所确定的avbd9表达、纯化及复性条件均可以线性扩大，用于大规模工业化生产avbd9。avbd9体外抑制alv-j试验表明，avbd9在体外可以有效的抑制alv-j的转录和翻译，为今后alv-j的控制提供了一种新的策略。
附图说明
23.图1为本发明构建的pet22b-his-avbd9重组表达质粒模式图，
24.图2为本发明重组avbd9与pet22b-his-avbd9重组表达质粒序列对比图，如图2所示，构建的pet22b-his-avbd9重组质粒中的序列与avbd9序列符合一致。
25.图3为本发明重组avbd9纯化后sds-page检测图，如图3所示，重组avbd9纯化效果良好，仅有单一条带；
26.图4为本发明重组avbd9纯化后western blot检测图，如图4所示，重组avbd9纯化效果良好；
27.图5为本发明bca定量检测试剂盒绘制的标准曲线，如图5所示，根据标准曲线可以计算出avbd9浓度为1429μg/ml；
28.图6为本发明复性后重组avbd9对细胞毒性cck-8检测图，如图6所示，重组avbd9浓度为1μg/ml时对细胞的影响最小；
29.图7为本发明24h、48h、72h复性后不同浓度的重组avbd9在df-1细胞上对alv-j转录的影响实时荧光定量pcr检测结果图，如图7所示，48h时，不同浓度的重组avbd9可以抑制alv-j转录。
30.图8为本发明48h复性后不同浓度的重组avbd9在df-1细胞上对alv-j转录的影响western blot检测图，如图8所示，48h时，不同浓度的重组avbd9可以抑制alv-j翻译。
具体实施方式
31.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中的均采用常规现有技术完成。
32.实施例1重组质粒的获得和转化
33.发明人首先获得了avbd9核苷酸序列，如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；在此基础上，发明人通过艾伯森公司构建了获得了pet22b-his-avbd9重组质粒；
34.将上述avbd9重组表达质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，通过含有氨苄霉素的lb固体培养基中筛选出具有阳性质粒的大肠杆菌，通过测序筛选出含有avbd9重组表达质粒的大肠杆菌，具体转化步骤如下所示：将大肠杆菌dh5α感受态细胞置于冰上融化，向100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中加入5μl pet22b-his-avbd9重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30min。将离心管置于42℃水浴中放置60～90s，然后快速转移到冰浴中放置2～3min，注意不要摇动离心管；向离心管中加入500μl无菌无抗的lb培养基，37℃摇床培养1h。取适量已转化的感受态细胞涂布到含有amp抗性的lb平板中，37℃倒置培养12～16小时，挑取单一菌落进行大量培养。
35.再从上述含有avbd9表达质粒的大肠杆菌中提取质粒，将其转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中，转化步骤参照上述步骤进行即可。通过含有氨苄霉素的lb固体培养基中筛选出具有阳性质粒的大肠杆菌，通过测序筛选出能够表达avbd9的大肠杆菌，序列对比如图2所示，剩余菌液保存至-80℃冰箱备用。
36.实施例2 avbd9的表达、纯化及复性
37.2.1 avbd9的表达
38.将通过鉴定为阳性的菌液按照amp：阳性菌液：lb液体培养基＝1:10:1000(体积比)的比例混合，于37℃摇床上摇菌制备种子液，具体过程如下：
39.取500ml锥形瓶分别加入100ml lb液体培养基、100μl amp(氨苄)、1ml能够表达avbd9的大肠杆菌于37℃220r/min的摇床上培养12h得到种子液；
40.然后是将10l lb液体培养基、100ml上述的种子液以及10ml amp(氨苄)加入到发酵罐中，保持37℃220r/min发酵条件，等到发酵罐中培养基od 600为0.8时，加入47.6mliptg，继续发酵培养6h结束。
41.发酵液体离心后取沉淀，用pbs重悬沉淀后用超声破碎仪破碎，破碎3s，间隔4s，重复99次为一个循环，破碎菌体至溶液透光即可。4℃、12000r/min离心15min，弃去上清，加pbs重悬沉淀后使用相同方法离心，清洗沉淀。经检测，如果发酵条件改动，将会降低最终avbd9的产量，因此上述发酵条件为最佳发酵条件。
42.2.2 avbd9的纯化
43.用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，加入足量的le buffer重悬沉淀，置于4℃冰箱中过夜溶解包涵体并使蛋白变性，将过夜溶解后的包涵体4℃、12000r/min离心5min，弃掉沉淀，将溶液加入层析柱，控制流速载3～5s/滴，收集流出液，如有必要，可以使流出液多次上样，提高收率。
44.上样结束后使用2倍柱体积的洗涤缓冲液(其中含有较低浓度的imidazole可以将杂蛋白洗掉从而只保留目的蛋白)洗涤层析柱，使用2ml的洗脱缓冲液加入层析柱中，将流出的洗脱液反复上样5-10次，最终得到的洗脱液中含有纯化后的avbd9，可使用sds-page检测纯化效率。
45.上述过程中采用的各种试剂如下：
46.lysis(le buffer)：100mm na2hpo4、10mm tris
·
cl、8m urea、ph＝8.0；
47.洗涤缓冲液：100mm na2hpo4、10mm tris
·
cl、10mm imidazole、8m urea、ph＝8.0；
48.洗脱缓冲液：100mm na2hpo4、10mm tris
·
cl、250mm imidazole、8m urea、ph＝8.0；
49.2.3纯化后avbd9的检测(sds-page、western blot)
50.2.3.1 sds-page检测纯化后avbd9，步骤如下：
51.1)首先配制12％分离胶，用底座的夹子固定洗干净的玻璃板(垂直放置)，先加入蒸馏水检查固定板是否完全固定。然后倒掉蒸馏水后将按照比例配好的凝胶用1ml的移液枪快速注入到两个玻璃板之间，在分离胶的上端加入一定量的蒸馏水进行封闭，以确保分离胶平整凝固。等35min待分离胶完全凝固之后，倒掉分离胶上层的水，残留的水分用滤纸尽量吸干。然后加入配置好的上层浓缩胶，最后插入孔径大小适合的梳子(1mm)，这个过程中注意防止气泡的产生，等待其完全凝固后即可使用(约30min)。
52.2)取纯化后avbd9加入1/5体积的5x蛋白上样缓冲液于pe管中，蒸馏水煮沸5min。
53.3)拔掉浓缩胶的梳子，向电泳槽中加入提前配好的1xtris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液，使电泳缓冲液完全淹没加样孔，用10μl移液器上样，20μl/孔加样。将电泳槽正负极和电泳仪正确连接，打开电源。先用80v电压进行电泳，待样品在浓缩胶上浓缩成一条直线到达浓缩胶底部快进入分离胶时，调高电压至100v，样品至分离胶的底部时停止电泳。
54.4)染色：电泳完毕，用刀片小心切下凝胶，放到加有考马斯亮蓝染色液的培养皿中，染色40min。
55.5)脱色：染色结束以后，将凝胶置于脱色液中，在摇床上缓慢摇动，定时更换2次以上脱色液至到凝胶蓝色背景完全脱去后，放入蒸馏水中终止脱色并拍照保存。
56.将纯化后的avbd9用sds-page检测，结果如图3所示，蛋白纯化效果良好。
57.2.3.2 western blot检测纯化后avbd9，步骤如下：
58.1)首先配制12％分离胶，用底座的夹子固定洗干净的玻璃板(垂直放置)，先加入蒸馏水检查固定板是否完全固定。然后倒掉蒸馏水后将按照比例配好的凝胶用1ml的移液枪快速注入到两个玻璃板之间，在分离胶的上端加入一定量的蒸馏水进行封闭，以确保分离胶平整凝固。等35min待分离胶完全凝固之后，倒掉分离胶上层的水，残留的水分用滤纸尽量吸干。然后加入配置好的上层浓缩胶，最后插入孔径大小适合的梳子(1mm)，这个过程中注意防止气泡的产生，等待其完全凝固后即可使用(约30min)。
59.2)取纯化后avbd9加入1/5体积的5x蛋白上样缓冲液于pe管中，蒸馏水煮沸5min。
60.3)拔掉浓缩胶的梳子，向电泳槽中加入提前配好的1xtris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液，使电泳缓冲液完全淹没加样孔，用10μl移液器上样，20μl/孔加样。将电泳槽正负极和电泳仪正确连接，打开电源。先用80v电压进行电泳，待样品在浓缩胶上浓缩成一条直线到达浓缩胶底部快进入分离胶时，调高电压至100v，样品至分离胶的底部时停止电泳。
61.4)染色：电泳完毕，用刀片小心切下凝胶，按照切割的凝胶大小裁剪一张大小相同的pvdf膜，并用甲醇溶液浸泡，同时用转膜的缓冲液把纤维垫和裁剪的滤纸浸透。
62.5)按照三明治法组装转膜材料，由下到上依次为负极夹、纤维垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、纤维垫、正极夹，保证pvdf膜对着正极面，凝胶对着负极面，并且材料之间不要有气泡和间隙出现。将组装完成的转膜装置放入到电泳槽中，再缓慢加入转膜缓冲液，400ma
电流电泳0.5h。转膜结束后，将pdf膜用配好的pbst清洗3次，5min/次。
63.5)清洗后浸入蛋白封闭液内(0.05g/ml脱脂奶粉)，置于37℃恒温箱孵育1.5h。
64.6)之后用tbst洗涤pdf膜3次，15min/次。使用gst标签抗体为一抗孵育pdf膜，4℃过夜。
65.7)第二天上午，tbst洗膜5min/次，洗5次。
66.8)将hrp标记的羊抗鼠二抗与pdf膜孵育37℃1h，用tbst洗膜5min/次，洗5次。
67.9)之后用dab显色试剂盒避光显色，在western blot显影仪中显影拍照保存。
68.结果如图4所示，western blot结果在10kda左右处出现一条明显的条带，说明纯化后的蛋白和标签结合良好，具有良好的特异性和反应性。
69.2.4 avbd9的复性
70.采用不同浓度的尿素对变性的蛋白进行透析复性，具体步骤如下：
71.使用分子截流量合适的(分子量约为5kda)透析袋装取纯化后的avbd9(2.2步骤得到的avbd9)分别置于复性液1-4(按照复性液1-4的顺序)中，每种复性液中停留3-4h，最后置于pbs中过夜，使变性的蛋白重新折叠，恢复其生物活性，从而表达出具有生物活性的avbd9。经bca蛋白定量检测试剂盒绘制标准曲线，如图5所示，检测小肽浓度为1429μg/ml，经计算每升菌液可以最终得到4～5mg avbd9小肽。
72.所采用的复兴液组成如下：
73.复性液1：500mm tris
·
cl、100mm nacl、4m urea、ph＝8.0
74.复性液2：500mm tris
·
cl、100mm nacl、3m urea、ph＝8.0
75.复性液3：500mm tris
·
cl、100mm nacl、2m urea、ph＝8.0
76.复性液4：500mm tris
·
cl、100mm nacl、1m urea、ph＝8.0。
77.实施例3重组avbd9体外抗j亚群禽白血病病毒实验
78.3.1重组avbd9对细胞的增殖-毒性检测
79.在细胞上做重组avbd9抗alv-j实验之前，先通过cell counting kie-8(cck-8)检测一个avbd9对df-1细胞毒性影响最小的最适浓度。
80.ccck-8细胞增殖-毒性检测实验步骤:
81.在96孔板里配制100μl的df-1细胞悬液，将96孔板在细胞培养箱里培养24h；向96孔板孔里依次加入10μl不同浓度的avbd9(蛋白浓度依次是200μg/ml；100μg/ml；50μg/ml；25μg/ml；12.5μg/ml；6.25μg/ml；3.13μg/ml；1.56μg/ml；0.78μg/ml；0.39μg/ml；0.19μg/ml；0.09μg/ml；)；将96孔板在细胞培养箱里孵育24h；向每孔中加入10μl cck-8溶液；将96孔板在细胞培养箱里孵育4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如图6所示，avbd9浓度在1μg/ml左右时对df-1细胞的毒性影响最小。
82.为了确定avbd9能否体外抑制alv-j以及avbd9体外抑制alv-j的最低有效浓度，后续实验将选取5个不同的浓度进行检测，分别是alv-j接毒组、alv-j 0.5μg/ml avbd9、alv-j 1μg/ml avbd9、alv-j 2μg/ml avbd9、alv-j 4μg/ml avbd9。
83.3.2alv-j病毒实时荧光定量pcr引物设计和合成
84.根据已经发表的alv-j基因序列，合成实时荧光定量pcr引物，由华大公司合成。
85.alv-j荧光定量引物序列为：
86.f:5
′‑
tgcgtgcgtggttattatttc-3
′
，
87.r:5
′‑
aatggtgaggtcgctgactgt-3
′
。
88.禽内参基因gapdh的引物序列为：
89.f:5
’‑
gaacatcatcccagcgtcca-3’，
90.r:5
’‑
cggcaggtcaggtcaacaac-3’,
91.上述引物的核苷酸序列顺次为seq id no.3-6所示。
92.3.3重组avbd9体外抗alv-j实时荧光定量pcr检测
93.将纯化复性后的重组avbd9进行df-1细胞实验，将df-1细胞传至12孔板中，待细胞密度70％～80％时接入alv-j，感染1h后换成1％dmem培养基进行维持。维持24h，再向其中接种不同浓度的avbd9(3.1中设置的5个组)，继续维持到24h、48h、72h后分别收集细胞。使用细胞rna总提试剂盒(qiagen,america)提取细胞总rna，继续维持到24h、48h、72h后分别收集细胞。使用细胞rna总提试剂盒(qiagen,america)提取细胞总rna,然后将rna逆转录为cdna。进行实时荧光定量pcr检测，如图7所示：
94.实时荧光定量pcr检测结果显示，在48h、加入avbd9浓度为1μg/ml时，重组avbd9体外抗alv-j具有明显的效果，同时也可以确定重组avbd9体外抗alv-j的最低浓度为1μg/ml。
95.3.4重组avbd9体外抗alv-j western blot检测
96.将纯化复性后的重组avbd9进行df-1细胞实验，将df-1细胞传至12孔板中，待细胞密度70％～80％时接入alv-j，感染1h后换成1％dmem培养基进行维持。维持24h，再向其中接种不同浓度的重组avbd9(3.1中设置的5个组)，继续维持到48h后收集细胞。使用含1％pmsf的ripa裂解液4℃2h裂解蛋白，通过bca蛋白定量检测试剂盒确定蛋白浓度，从而确定western blot蛋白上样量，如图8所示：western blot检测结果同实时荧光定量pcr检测结果相符合。
97.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但是应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制，仍以本发明权利要求书的内容为准。凡根据本发明实质所做的修饰或变换，均落入本发明的保护范围。