一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物的制备及定量分析方法与流程

1.本发明涉及一种蓝藻多肽的分离制备及定量分析方法，具体涉及一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin的分离制备及定量定性分析方法，属于天然产物分离和定量分析应用技术领域。


背景技术：

2.目前，关于蓝藻毒素的研究更多的侧重于对常见蓝藻毒素类物质的研究(如微囊藻毒素)。然而，蓝藻还能够合成上千种具有生物活性的代谢产物。蓝藻链状多肽类代谢产物microginins由非核糖体合成酶/聚酮合酶途经合成，目前已从纯种铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)或蓝藻藻华环境样品中发现超过28种此类物质。microginins是血管紧张素转化酶(ace)和氨基肽酶的抑制剂。ace抑制剂是治疗高血压和充血性心脏衰竭的有效治疗方法。因此，microginins也成为一些降压药的候选物质。同时，microginins也表现出对肝细胞和水生生物的毒性。
3.现行的高效液相色谱法(hplc)、液相色谱/质谱法(lc-ms)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)已经普遍用于检测水体中的藻类代谢产物。蓝藻多肽的结构多样而标准品缺乏，这限制了microginin等蓝藻多肽的定量分析。其中，lc-ms/ms由于选择性好，灵敏度高，定量相对准确，应用较为广泛。因此，获得microginin的标准品并应用于自然水体中microginin的质谱定量分析能够增进对其环境效应的认知，为保障饮用水水质的安全提供数据支持。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin的分离制备及定量定性分析方法，本发明的方法以蓝藻藻华藻细胞为原料，制备得到纯度高于90％的蓝藻多肽类代谢产物microginin，作为质谱检测的标准品，从而满足蓝藻多肽类代谢产物microginin的定量分析的要求。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的目的之一是提供一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin的分离制备方法，获得一种或几种microginin类化合物，并以这种化合物作为标准品，定量分析环境样品中microginin的含量，主要包含以下步骤：
7.(1)蓝藻藻体的收集和预处理：
8.在蓝藻采集地收集表层湖水中的蓝藻团聚体，将样品运到实验室后在低温条件下进行离心处理，舍弃上清液，将获得的藻细胞固体冻存备用；
9.(2)蓝藻多肽的提取和纯化方法
10.将藻细胞固体反复冻融，最后一次融化后加入甲醇进行超声提取，然后进行旋转蒸发获得粗提物；粗提物再采用乙酸乙酯萃取2次后合并水层得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物采用中压c18柱分离获得含有目标分子量的组分，旋转蒸发后将提取物重溶于甲
醇溶液，再采用葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分离，获得含目标分子量的组分，继续旋转蒸发后将组分提取物固体重溶于甲醇，然后采用高效制备液相进行制备，获得两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62固体，均为蓝藻多肽类代谢产物microginin；
11.(3)蓝藻多肽标准品分子结构和定量分析方法确定：
12.利用agilent 6545q-tof lc/ms系统对步骤(2)获得的两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62进行分析，得到精确分子质量和碎片离子组成后，根据已报道的碎片离子信息和结构信息，推断两份代谢产物中包含的microginin类分子的组成和结构，得到蓝藻多肽类代谢产物microginin的流份信息。
13.上述技术方案中，步骤(1)中，具体操作为：在采集地收集100l表层湖水中的蓝藻团聚体，在4-6℃的低温条件下、4小时内将样品运送到实验室，将样品在10℃下进行离心处理，将离心后的上清液舍弃，将获得的约15kg藻细胞固体在-20℃下冻存。
14.上述技术方案中，步骤(1)中，所述的离心处理，转速为7000rpm，离心时间为5-20钟。
15.上述技术方案中，步骤(2)中，反复冻融时，先将冻结的藻细胞固体在室温下融化、在-20℃下冻结，然后再将冻结的藻细胞固体在室温下融化、在-20℃下冻结；如此重复两次后再次在室温下融化，融化后再加入甲醇进行超声提取。
16.上述技术方案中，步骤(2)中，按照1:3-1:8的质量比加入甲醇进行超声提取，质量比优选为1:5；超声提取时，超声波的频率为20khz-50khz、提取时间为5-20min。
17.上述技术方案中，步骤(2)中，将粗提物固体采用乙酸乙酯萃取2次，每一次萃取时乙酸乙酯的质量用量为粗提物固体的1.5-2倍，获得乙酸乙酯萃取物。
18.上述技术方案中，步骤(2)中，乙酸乙酯萃取物与300-400目硅胶拌样，二者的质量比为1:1-1:2，采用中压c18柱进行分离，分离方法：柱长900mm、柱直径49mm，柱压5-15mpa。
19.上述技术方案中，步骤(2)中，采用sephadex lh-20进行分离，分离方法：将上一步操作(旋转蒸发)产生的提取物溶于10ml的100％甲醇，加入sephadex lh-20柱内(柱长500mm、柱直径25mm)，使用自动收集器收集，经质谱检测目标分子后，对目标流分进行旋转蒸发，获得组分提取物固体。
20.上述技术方案中，步骤(2)中，组分提取物固体溶解于3ml 100％甲醇，再采用高效制备液相进行制备，制备方法：采用waters pre150系统，x bride c18制备柱(4.6
×
100mm，5μm)，在280nm波长检测目标物，进样量100-250ul，流速15-20ml/min；对收集的流份进行质谱检测，对含有目标物的流份进行旋转蒸发，得到两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62，其中，lf60包含两种代谢产物，lf62包含一种代谢产物。
21.上述技术方案中，步骤(2)中，涉及到的所有的旋转蒸发，操作条件均为：温度55-65℃、压力2-5kpa、时间根据液体体积调整，蒸发量约5l/小时。
22.上述技术方案中，步骤(3)中，利用agilent 6545q-tof lc/ms系统对步骤(2)获得的蓝藻多肽类代谢产物组分lf60和lf62进行分析，质谱检测模式：esi-negative/esi-positive ion mode；esi源参数见下表：
23.飞行时间质谱仪参数
[0024][0025]
本发明的目的之二是提供一种经过上述分离制备方法获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin，分别为lf60和lf62，其中：lf60包含两种代谢产物：microginin713和microginin747，lf62包含一种代谢产物，为microginin781。
[0026]
本发明还提供一种所述的蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品对自然水体中的蓝藻代谢产物进行定量分析的方法，包括以下步骤：
[0027]
i、将获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品，与(常见的)蓝藻毒素标准品混合，制成混合标准品，混合标准品稀释后得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；
[0028]
ii、从自然水体中采集水样，经过固相萃取富集后得到待测样品；
[0029]
iii、将步骤i中得到的混合标准品进行色谱分离、质谱测定分析，得到混合标准品的色谱图，母离子组成、离子对信息和保留时间；再将混合标准溶液系列中得到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列也进行色谱分离、质谱测定分析，每个浓度测定3次，以特征离子的峰面积y对其质量浓度x进行线性回归绘制标准曲线；
[0030]
iv、将步骤ii中的待测样品按照步骤iii中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到待测样品的峰面积，根据由标准曲线中得到的关系方程和固相萃取时富集的水样体积，计算待测样品中各类microginin化合物和蓝藻毒素的含量。
[0031]
上述技术方案中，步骤i中，所述的常见蓝藻毒素标准品包括：微囊藻毒素(mc-lr和mc-rr)、节球藻毒素(nodularin_r)、anatoxin a、拟柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，cyn)。
[0032]
上述技术方案中，步骤i中，将每种标准品称取相同的质量后用1ml含有0.1％甲酸的100％甲醇溶解后得到的标准品混合液，取100μl标准品混合液至于2ml色谱进样瓶中，加入900μl含0.1％甲酸的100％甲醇定容至1ml，得到质量浓度为10000ng/ml的混合标准品，采用含0.1％甲酸的100％甲醇溶液对10000ng/ml的混合标准品逐级稀释后得到浓度为1ppb、5ppb、25ppb、50ppb、100ppb共5个浓度梯度的混合标准溶液系列。
[0033]
上述技术方案中，步骤ii中，固相萃取富集的操作为：取水库中的水样50-200ml，经过固相萃取柱(oasis hlb 3cc)富集后，用1ml的70％甲醇溶液(含0.1％甲酸)洗脱至2ml的色谱样品瓶中，-20℃保存。
[0034]
上述技术方案中，步骤iii和iv中，色谱分离时采用beh c18色谱柱，2.1
×
100mm，1.7μm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为甲醇(含0.2％甲酸)，流速0.4ml min-1
，色谱
分离条件如下表所示：
[0035]
液相色谱条件
[0036][0037][0038]
上述技术方案中，步骤iii和iv中，质谱测定分析时，采用rxionlc
tm sciex qtrap 6500

分析，质谱条件如下表所示：
[0039]
定量分析方法中的质谱条件
[0040][0041]
与现有技术相比，具有以下特点：
[0042]
本发明提供的方法制备的microginin纯度可达到90.0％以上，纯度符合化学对照品要求，同时提供了microginin化学对照品完整的基础化学依据、化学信息和定量分析方法，本发明采用乙酸乙酯萃取结合色谱制备高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin，对蓝藻代谢产物有较好的代表性，也适用于此类代谢产物的定性和定量分析，能够用于对自然水体，特别是饮用水源水体中蓝藻产生的microginin类化合物进行定量监测，保障饮用水源安全，具有良好的社会效益。
附图说明
[0043]
图1为lf60和lf62分离前的ms1谱图(dad1-a:sig＝280.0,4.0ref＝off20211019-jj9735-ts20ci29-lf59-pos.d平滑)；
[0044]
图2为lf60峰形图(vwd1 a,wavelength＝280nm(e:\数据\ydy\发酵产物\lf59-高压制备\lf59-2.d)；
[0045]
图3为lf62峰形图(vwd1 a,wavelength＝280nm(e:\数据\ydy\发酵产物\lf59-高压制备\lf59-3.d)；
[0046]
图4-1为lf60-峰1的ms1谱图( esi scan(rt:7.046min)frag＝140.0v 20211209-ts20c129-lf60-pos.d)；
[0047]
图4-2为lf60-峰1的ms2谱图( esi product ion(rt:7.154min)frag＝140.0vcid@40.0(748.3704{z＝1}-＞8**)2021 1209-ts20c129-lf60-pos.d)；
[0048]
图5-1为jj9735-ts20c129-lf60-峰2的ms1谱图( esi scan(rt:7.538min)frag＝140.0v 2021 1209-ts20c129-lf60-pos.d)；
[0049]
图5-2为jj9735-ts20c129-lf60-峰2的ms2谱图( esi product ion(rt:7.419min)frag＝140.0v cid@40.0(714.4091{z＝1}-＞**)2021 1209-ts20c129-lf60-pos.d)；
[0050]
图6-1为jj9735-ts20c129-lf62-峰3ms1谱图( esi scan(rt:9.596min)frag＝140.0v2021 1209-ts20c129-lf62-pos.d)；
[0051]
图6-2为jj9735-ts20c129-lf62-峰3ms2谱图( esi product ion(rt:9.465min)frag＝140.0v cid@40.0(782.3301{z＝1}-＞**)2021 1209-ts20c129-lf62-pos.d)；
[0052]
图7-1mc-rr标准品(100ppb)主要子离子色谱图(mc_rr 519.9/135.1)；
[0053]
图7-2nod-r标准品(100ppb)主要子离子色谱图(nodularin_r825.5/781.5)；
[0054]
图7-3atx-a标准品(100ppb)主要子离子色谱图(anatoxin_a 166.4/149.3)；
[0055]
图7-4microginin 747b标准品(100ppb)主要子离子色谱图(microginin747b748.5/567.3)；
[0056]
图7-5microginin 713标准品(100ppb)主要子离子色谱图(microginin713714.4/533.6)；
[0057]
图7-6microginin 781标准品(100ppb)主要子离子色谱图(mc_lr498.3/135.1)；
[0058]
图7-7mc-lr标准品(100ppb)主要子离子色谱图(cyn 416.1/336.1)；
[0059]
图7-8cyn-1标准品(100ppb)主要子离子色谱图；
[0060]
图8-1为利用不同浓度的mc-rr标准品建立的标准曲线y＝44481x-29566r2＝0.9998；
[0061]
图8-2为利用不同浓度的nod-r标准品建立的标准曲线y＝11420x-22062r2＝0.9989
[0062]
图8-3为利用不同浓度的atx-a标准品建立的标准曲线y＝45737x-21104r2＝0.9996；
[0063]
图8-4为利用不同浓度的microginin 747b标准品建立的标准曲线y＝35996x-13209r2＝0.9996；
[0064]
图8-5为利用不同浓度的microginin 713标准品建立的标准曲线y＝61303x-5952.9r2＝0.9991；
[0065]
图8-6为利用不同浓度的microginin 781标准品建立的标准曲线y＝24662x 6157.7r2＝0.9992；
[0066]
图8-7为利用不同浓度的mc-lr标准品建立的标准曲线y＝15744x 10558r2＝0.9973；
[0067]
图8-8为利用不同浓度的cyn-1标准品建立的标准曲线y＝8875.2x-8181.8r2＝0.9996；
[0068]
图9-1为实施例2水样中三种microginin类化合物的浓度(ppt代表microginin713；代表microginin747b；代表microginin781)；
[0069]
图9-2为实施例2水样中三种microginin类化合物的比例(％)。
具体实施方式
[0070]
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内
容：
[0071]
实施例1：
[0072]
一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin的分离制备方法，包括以下步骤：
[0073]
(1)蓝藻藻体的收集和预处理：
[0074]
使用聚乙烯桶在太湖竺山湖岸边收集100l表层湖水中的蓝藻团聚体，在低温条件下(温度6℃)、4小时内将样品运送到实验室，将样品在10℃下进行离心处理，转速为7000rpm，离心时间为10分钟；将离心后的上清液舍弃，将获得的约15kg藻细胞固体在-20℃下冻存备用。
[0075]
(2)蓝藻多肽的提取和纯化方法
[0076]
将步骤(1)获得的藻细胞固体反复冻融两次(冻结时温度-20℃)，最后一次融化后按照1:5的质量比加入甲醇进行超声提取，超声波的频率为40khz、提取时间为20min；然后进行旋转蒸发获得粗提物固体，旋转蒸发的温度60℃、压力4kpa、时间7小时；将粗提物固体采用乙酸乙酯萃取2次后合并水层，每一次萃取时乙酸乙酯的质量用量为粗提物固体的1.5倍；将水层采用c18色谱柱(柱长900mm，柱内径49mm)中压分离(柱压10mpa)，获得含目标分子量的组分(2.15g固体)后，采用sephadex lh-20分离，将上一步的产物溶于10ml的100％甲醇，加入sephadex lh-20柱内(柱长50cm、柱直径2.5cm)，使用自动收集器收集，经质谱检测目标分子后，对目标流分进行旋转蒸发(条件同上所述)，获得组分120mg。
[0077]
对上一步获得的含目标分子的组分(120mg)溶解于3ml 100％甲醇，进行质谱检测，共检测出三种蓝藻多肽类代谢产物(图1)。之后再采用高效制备液相进行制备，制备方法：采用waters pre150系统，x bride c18制备柱(4.6
×
100mm，5μm)，在280nm波长检测目标物，进样量250ul，流速20ml/min。对收集的流份进行质谱检测，对含有目标物的流份进行旋转蒸发(条件同上所述)，得到两份蓝藻多肽类代谢产物lf60(8.98mg)和lf62(2.12mg)。其中，lf60包含两种代谢产物，lf62包含一种代谢产物。
[0078]
采用分析型高效液相色谱(agilent 1290uplc)对三种代谢产物进行hplc分析，测定收集的lf60和lf62的纯度：色谱柱：hydrosphere c18，4.6
×
250mm,5μm，进样量10μl，流速1.0ml/min，面积归一法定量，流动相a为0.2％磷酸水，流动相b为乙腈，系统条件如表1所示：
[0079]
hplc分析型高效液相系统条件
[0080][0081]
峰形图如图2-图3所示，结果表明：由图2可知，峰1hplc 56.43％，峰2hplc 34.33％lf60，共9.87mg；由图3可知，峰3hplc 65.22％，lf62，2.12mg；
[0082]
(3)蓝藻多肽标准品分子结构和纯度确定：
[0083]
利用agilent 6545q-tof lc-ms分析获得的蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62的精
确分子质量和碎片离子组成，并根据已报道的质谱分析结果，推断其分子组成和结构；
[0084]
质谱条件：仪器：sciex tripletof 4600lc/ms；检测模式：esi-negative/esi-positive ion mode；esi源参数：见表2：
[0085]
表2.sciex triple飞行时间质谱仪参数
[0086][0087]
lf60-峰1的ms1和ms2谱图如图4-1和图4-2所示，jj9735-ts20c129-lf60-峰2的ms1和ms2谱图如图5-1和5-2所示；jj9735-ts20c129-lf62-峰3ms1和ms2谱图如图6-1和6-2所示；结合hplc分析结果，从蓝藻样品中分离的三种蓝藻多肽流分信息如下：
[0088]
表3.蓝藻分离的的lf60和lf62中流份信息
[0089][0090]
本发明提供的方法制备的microginin纯度可达到90.0％以上，纯度符合化学对照品要求，同时提供了microginin化学对照品完整的基础化学依据、化学信息和定量分析方法，本发明采用乙酸乙酯萃取结合色谱制备高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin，对蓝藻代谢产物有较好的代表性，也适用于此类代谢产物的定性和定量分析，能够用于对自然水体，特别是饮用水源水体中蓝藻产生的microginin类化合物进行定量监测，保障饮用水源安全，具有良好的社会效益。
[0091]
实施例2：
[0092]
以实施例1中获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品，对自然水体中的蓝藻代谢产物进行定量分析的方法，包括以下步骤：
[0093]
i、将本发明获得的三种蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品，与(常见的)蓝藻毒素标准品混合后，含0.1％甲酸的100％甲醇溶解后得到的标准品混合液，取100μl标准品混合液至于2ml色谱进样瓶中，加入900μl含0.1％甲酸的100％甲醇定容至1ml，得到质量浓度为10000ng/ml的混合标准品，采用含0.1％甲酸的100％甲醇溶液对10000ng/ml的混合标准品逐级稀释后得到浓度为1ppb、5ppb、25ppb、50ppb、100ppb共5个浓度梯度的混合标准溶液系列(其中microginin 713最高浓度为60ppb)；
[0094]
ii、取太湖梅梁湾和贡湖水域共7个采样点，以及舟山市内陈岙、高云和铜岙三个水库的水样50-200ml，经过固相萃取柱(oasis hlb 3cc)富集后，用1ml的70％甲醇溶液洗脱至2ml的色谱样品瓶中，-20℃保存。
[0095]
iii、将步骤i中得到的混合标准品进行色谱分离、质谱测定分析，色谱分离时采用beh c18色谱柱，2.1
×
100mm，1.7μm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为甲醇(含0.2％甲酸)，流速0.4ml min-1
，色谱分离条件如表4所示：
[0096]
表4液相色谱条件
[0097][0098][0099]
质谱测定分析时，采用rxionlc
tm sciex qtrap 6500

分析，质谱条件如表5所示：
[0100]
表5定量分析方法中的质谱条件
[0101][0102]
分析后得到混合标准品的色谱图(如图7-1～图7-7)，母离子组成、离子对信息和保留时间，如表6所示：
[0103]
表6.混合标准品的组成、离子对信息和系统条件
[0104][0105]
在rxionlc
tm sciex qtrap 6500

lc-ms/ms系统上，采用已建立的串联质谱方法，再将混合标准溶液系列中得到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列也进行色谱分离、质谱测定分析，每个浓度测定3次，以特征离子的峰面积y对其质量浓度x进行线性回归绘制标准曲线(如图8-1～图8-7)；
[0106]
iv、将步骤ii中的待测样品按照步骤iii中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到待测样品的峰面积，根据标准曲线中峰面积和浓度的关系方程，再通过对环境水样中的microginin类化合物和常见的蓝藻毒素的离子对进行测定，获得对应的峰面积，根据由标准曲线中得到的关系方程和固相萃取时富集的水样体积，计算水体中各类microginin化合物和蓝藻毒素的含量。
[0107]
本发明在rxionlc
tm sciex qtrap 6500

lc-ms/ms系统上，采用已建立的串联质谱方法，对标准品和采集自太湖、舟山水库的环境样品进行分析，建立用于定量的标准曲线，并根据标准曲线中峰面积和浓度的关系方程，再通过对环境水样中的microginin类化合物和常见的蓝藻毒素的离子对进行测定，获得对应的峰面积，根据由标准曲线中得到的关系方程和固相萃取时富集的水样体积，计算水体中各类microginin化合物和蓝藻毒素的含量。
[0108]
如图9-1和9-2所示，通过对太湖和舟山水库样品的分析，在样品中都发现了一定量的microginin类化合物，说明水体中的蓝藻代谢产物对水质的影响。
[0109]
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。