一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物的制备及定量分析方法与流程

技术特征：
1.一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin的分离制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)蓝藻藻体的收集和预处理：在蓝藻采集地收集表层湖水中的蓝藻团聚体，将样品运到实验室后在低温条件下进行离心处理，舍弃上清液，将获得的藻细胞固体冻存备用；(2)蓝藻多肽的提取和纯化方法将藻细胞固体反复冻融，最后一次融化后加入甲醇进行超声提取，然后进行旋转蒸发获得粗提物；粗提物再采用乙酸乙酯萃取2次后合并水层得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物采用中压c18柱分离获得含有目标分子量的组分，旋转蒸发后将提取物重溶于甲醇溶液，再采用葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分离，获得含目标分子量的组分，继续旋转蒸发后将组分提取物固体重溶于甲醇，然后采用高效制备液相进行制备，获得两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62固体，均为蓝藻多肽类代谢产物microginin；(3)蓝藻多肽标准品分子结构和定量分析方法确定：利用agilent 6545q-tof lc/ms系统对步骤(2)获得的两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62进行分析，得到精确分子质量和碎片离子组成后，根据已报道的碎片离子信息和结构信息，推断两份代谢产物中包含的microginin类分子的组成和结构，得到蓝藻多肽类代谢产物microginin的流份信息。2.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(1)中，具体操作为：在采集地收集100l表层湖水中的蓝藻团聚体，在4-6℃的低温条件下、4小时内将样品运送到实验室，将样品在10℃下进行离心处理，转速为7000rpm，离心时间为5-20钟，将离心后的上清液舍弃，将获得的约15kg藻细胞固体在-20℃下冻存。3.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反复冻融时，先将冻结的藻细胞固体在室温下融化、在-20℃下冻结，然后再将冻结的藻细胞固体在室温下融化、在-20℃下冻结；如此重复两次后再次在室温下融化，融化后按照1:3-1:8的质量比加入甲醇进行超声提取，超声提取时，超声波的频率为20khz-50khz、提取时间为5-20min；将粗提物固体采用乙酸乙酯萃取2次，每一次萃取时乙酸乙酯的质量用量为粗提物固体的1.5-2倍，获得乙酸乙酯萃取物。4.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乙酸乙酯萃取物与300-400目硅胶拌样，二者的质量比为1:1-1:2，采用中压c18柱进行分离，分离方法：柱长900mm、柱直径49mm，柱压5-15mpa；采用sephadex lh-20进行分离，分离方法：将旋转蒸发产生的提取物溶于10ml的100％甲醇，加入sephadex lh-20柱内，柱长500mm、柱直径25mm，使用自动收集器收集，经质谱检测目标分子后，对目标流分进行旋转蒸发，获得组分提取物固体。5.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，组分提取物固体溶解于3ml 100％甲醇，再采用高效制备液相进行制备，制备方法：采用waters pre150系统，x bride c18制备柱，4.6
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100mm，5μm；在280nm波长检测目标物，进样量100-250ul，流速15-20ml/min；对收集的流份进行质谱检测，对含有目标物的流份进行旋转蒸发，得到两份蓝藻多肽类代谢产物lf60和lf62，其中，lf60包含两种代谢产物，lf62包含一种代谢产物。6.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，涉及到的所有的旋转
蒸发，操作条件均为：温度55-65℃、压力2-5kpa、时间根据液体体积调整，蒸发量约5l/小时。7.一种经过权利要求1-6任一项所述的分离制备方法获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin，其特征在于，所述的的蓝藻多肽类代谢产物microginin为两种，分别为lf60和lf62，其中：lf60包含两种代谢产物：microginin713和microginin747，lf62包含一种代谢产物，为microginin781。8.一种经过权利要求1-6任一项所述的分离制备方法获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品对自然水体中的蓝藻代谢产物进行定量分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：i、将获得的蓝藻多肽类代谢产物microginin作为标准品，与(常见的)蓝藻毒素标准品混合，制成混合标准品，混合标准品稀释后得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；ii、从自然水体中采集水样，经过固相萃取富集后得到待测样品；iii、将步骤i中得到的混合标准品进行色谱分离、质谱测定分析，得到混合标准品的色谱图，母离子组成、离子对信息和保留时间；再将混合标准溶液系列中得到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列也进行色谱分离、质谱测定分析，每个浓度测定3次，以特征离子的峰面积y对其质量浓度x进行线性回归绘制标准曲线；iv、将步骤ii中的待测样品按照步骤iii中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到待测样品的峰面积，根据由标准曲线中得到的关系方程和固相萃取时富集的水样体积，计算待测样品中各类microginin化合物和蓝藻毒素的含量。9.根据权利要求所述的量分析的方法，其特征在于，步骤i中，所述的常见蓝藻毒素标准品包括：微囊藻毒素(mc-lr和mc-rr)、节球藻毒素(nodularin_r)、anatoxin a、拟柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，cyn)；将每种标准品称取相同的质量后用1ml含有0.1％甲酸的100％甲醇溶解后得到的标准品混合液，取100μl标准品混合液至于2ml色谱进样瓶中，加入900μl含0.1％甲酸的100％甲醇定容至1ml，得到质量浓度为10000ng/ml的混合标准品，采用含0.1％甲酸的100％甲醇溶液对10000ng/ml的混合标准品逐级稀释后得到浓度为1ppb、5ppb、25ppb、50ppb、100ppb共5个浓度梯度的混合标准溶液系列。10.根据权利要求所述的量分析的方法，其特征在于，步骤ii中，固相萃取富集的操作为：取水库中的水样50-200ml，经过固相萃取柱(oasis hlb 3cc)富集后，用1ml含0.1％甲酸的70％甲醇溶液洗脱至2ml的色谱样品瓶中，-20℃保存。

技术总结
本发明公开了一种高纯度蓝藻多肽类代谢产物的制备及定量分析方法，获得两种microginin类化合物，并以这些化合物作为标准品，定量分析环境样品中microginin的含量。本发明提供的方法制备的microginin纯度可达到90.0％以上，纯度符合化学对照品要求，同时提供了microginin化学对照品完整的基础化学依据、化学信息和定量分析方法，本发明采用乙酸乙酯萃取结合色谱制备高纯度蓝藻多肽类代谢产物microginin，对蓝藻代谢产物有较好的代表性，也适用于此类代谢产物的定性和定量分析，能够用于对自然水体，特别是饮用水源水体中蓝藻产生的microginin类化合物进行定量监测，保障饮用水源安全，具有良好的社会效益。具有良好的社会效益。具有良好的社会效益。


技术研发人员：陆羚子 高寒 刘婷 倪鲁波 吴俣
受保护的技术使用者：舟山市食品药品检验检测研究院
技术研发日：2022.03.09
技术公布日：2022/5/30