基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法

基于臧红t荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法
技术领域
1.本发明涉及过氧化氢酶活度检测领域，具体涉及一种基于臧红t荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法。


背景技术：

2.过氧化氢酶(catalase，cat)广泛存在于人体内，被作为与抗肿瘤，抗衰老有密切关系的酶学指标拉入临床常规检测。在过氧化氢酶活度测定文献报道中有紫外-可见光度法、滴定法等。近年来，显色光度法和褪色光度法备受关注，然而显色剂溶液的保存是一大障碍，随用随配难于满足临床检验要求；褪色光度法的准确度相对不高。荧光检测因其背景信号小、灵敏度及准确度高等优异性能已应用在活度分析。


技术实现要素：

3.为解决上述问题，本发明提供了一种基于臧红t荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，操作简便、快速、灵敏度高，可成功用于健康人体血清过氧化氢酶活度分析，有较好的临床应用前景。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：基于臧红t荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，该方法基于h2o2/fe
2
作用下的臧红t荧光猝灭体系实现过氧化氢酶活度测定，荧光试剂臧红t于575 nm处有最大发射波长，fe
2
催化h2o2氧化臧红t导致其荧光猝灭，过氧化氢酶分解h2o2引起荧光回位，通过过氧化氢酶加入前后荧光猝灭值
△
f获取过氧化氢酶的活度，其中，
△
f=0.7527 1807e(u/ml)，r=0.9980，最低检测限达到3.81
×
10-5 u/ml。
5.本发明所述的基于臧红t荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法包括如下步骤：取人体血清25~100 μl置于容量瓶中，加入1.00 ml h2o2底液，恒温30 o
c下反应10 min后，立即加入0.80 ml fe
2
、3.00 ml 臧红t，室温反应15 min后定容，臧红t空白作参比，在1 cm吸收池中测定575 nm发射波长处荧光强度f；测定酶空白体系f0，测定时，在h2o2之前加入fe
2
完成酶失活，后续方法同前；过氧化氢酶活度e由
△
f确定，其中，
△
f = f
‑ꢀ
f0，
△
f=0.7527 1807e(u/ml)，r=0.9980。
6.本发明利用过氧化氢酶对h2o2氧化臧红t反应具有抑制作用的原理，提出了测定过氧化氢酶活度的荧光猝灭法。研究结果表明，该方法的灵敏性、准确性及稳定性更具优势，无需繁杂的处理程序，可直接用于人体血清过氧化氢酶活度分析，最低检出量可达到3.81
×
10-5 u/ml，明显优于显色和褪色光度法；荧光值的大小仅取决于猝灭反应程度，与溶液的浊度、色度及组成成分无关；采用显酸性的fe
2
作为酶样失活剂(酶促反应终止剂)，将有效克服血清中其余还原性物质的干扰。
附图说明
7.图1为臧红t不同体系荧光谱图。
8.图2为催化剂催化作用比较。
9.图3 为臧红t用量的影响图。
10.图4为硫酸用量的影响图；图中：a.臧红t；b.h2o2 臧红t fe
2
。
11.图5为底液h2o2用量的影响图。
12.图6为酶促反应时间的影响图。
13.图7为过氧化氢酶活度工作曲线。
具体实施方式
14.为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.以下试验用μmol/ml (u/ml)表示酶活度，即1ml酶液所能分解过氧化氢物质的量(μmol)。
16.试验资料1.1 试剂与仪器30%的双氧水(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢酶固体(生物试剂，标示量≥3000 u/mg)购自如吉生物科技发展有限公司；臧红t固体(生物试剂)购自天津市大茂化学试剂厂；feso4·
7h2o固体(分析纯)购自福晨化学试剂有限公司；930n荧光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。
17.溶液配制h2o2底液：将0.50 ml 30%的双氧水稀释成250 ml，高锰酸钾法测定其浓度，根据测定值二次稀释为1 mmol/l (即1 μmol/ml)；过氧化氢酶标准溶液：1 u/ml。称过氧化氢酶固体5 mg，蒸馏水定容至100 ml，高锰酸钾法测定其活度(e=100 u/ml)，根据测定结果二次稀释为1 u/ml；2 mmol/l 臧红t：称0.7016 g臧红t固体，蒸馏水定容至1000 ml；0.01 mol/l fe
2
：称0.6950 g feso4·
7h2o固体，配制成250 ml溶液。
18.过氧化氢酶活度测定方法取人体血清25~100 μl置于容量瓶(50 ml)中，加1.00 ml h2o2底液，恒温30 o
c下反应10 min后立即加入0.80 ml fe
2
、3.00 ml 臧红t，室温反应15 min后定容，臧红t空白作参比，在1 cm吸收池中测定575 nm发射波长处荧光强度f。同步测定酶空白体系f0(在h2o2之前加入fe
2
完成酶失活，后续方法同前)，过氧化氢酶活度e由
△
f (
△
f = f
‑ꢀ
f0)确定。
19.荧光猝灭反应条件优化1.4.1 荧光猝灭反应催化剂的选择取50 ml容量瓶4只，1号瓶中加入臧红t；2号瓶中加入臧红t、h2o2；3号瓶中加入臧红t、h2o2和fe
3
；4号瓶中加入臧红t、h2o2和fe
2
。蒸馏水定容，室温反应15 min后定容，按1.3项方法测定f。
20.臧红t用量的选择
在50 ml容量瓶中加入不同体积(1-7 ml)臧红t，蒸馏水定容后，按1.3项方法测定f。
21.荧光猝灭反应溶液ph考察按1.3项方法完成荧光猝灭反应，与此同时加入不同体积硫酸(0-1 ml)，蒸馏水定容后，测定f。
22.荧光猝灭反应时间考察在50 ml容量瓶依次加入h2o2、臧红t和fe
2
，改变混合反应时间，蒸馏水定容后，按1.3项方法测定f。
23.1.4.5 荧光猝灭反应催化剂fe
2
用量选择在50 ml容量瓶依次加入h2o2、臧红t，再加入不同体积fe
2 (0.00~1.20 ml)，蒸馏水定容，按1.3项方法测定f。
24.1.5 酶促反应条件选择1.5.1 酶促反应底物h2o2用量的设定在50 ml容量瓶中加入不同体积h2o
2 (0.00~3.00 ml)，然后依次加入臧红t、fe
2
，室温反应15 min，蒸馏水定容，按1.3项方法进行检测。
25.酶促反应时间的选择取50 ml容量瓶1只，加入过氧化氢酶标准溶液1.00 ml、h2o2底液1.00 ml，30 ℃恒温反应(1~30 min)，蒸馏水定容，按1.3项方法测定f。
26.标准曲线取过氧化氢酶标准溶液0、125、250、375、500、750、1000 μl，按1.3项方法完成f、f0及
△
f测定，以酶活度e(u/ml)为横坐标，
△
f为纵坐标，绘制标准曲线。
27.干扰试验取50 ml容量瓶1只，加入1.00 ml过氧化氢酶标准溶液，按1.3项方法检测活度；另取1.00 ml过氧化氢酶标准溶液，加入浓度小于h2o2底液二分之一的共存还原性物质，按1.3项方法检测活度。
28.血清过氧化氢酶活度检测随机取6例不同年龄、不同性别健康人体血清样品作测试液，按1.3项方法检测活度，计算并完成回收试验。
29.结果2.1 光谱分析图1为臧红t不同体系荧光谱图。在激发波长λ
ex
=365 nm时，臧红t于575 nm处有一最大荧光峰(图1曲线a)；受fe
2
催化，h2o2氧化作用导致臧红t荧光强度f下降(图1曲线b)；过氧化氢酶分解h2o2，荧光猝灭受抑制，荧光强度恢复程度与过氧化氢酶活度有关联(图1曲线c)。本实验荧光发射波长认定为575 nm。
30.荧光猝灭条件考察2.2.1 催化剂考察结果表明：在臧红t基础上(图2a)单纯加入h2o2，反应不明显，荧光强度下降幅度仅为5%(图2c)；fe
3
对h2o2氧化臧红t无催化作用，荧光强度保持不变(图2d)；加入fe
2
后，臧红t荧光猝灭，猝灭率达到70%(图2d)，fe
2
有效降低过氧化氢的分解活化能，产生更具氧化功
能的羟自由基。fe
2
成为荧光猝灭反应的催化剂，过氧化氢酶活度与过氧化氢酶加入前后体系荧光强度变化值有关联。因此实验选择fe
2
作催化剂。
31.臧红t用量在不存在h2o2和fe
2
的情况下，单纯考察臧红t溶液体积改变引起荧光变化情况。结果显示：体系的f值随着臧红t体积的增大而逐渐增大，2 mmol/l臧红t溶液在0.00~3.00 ml范围内与荧光强度有线性关系(图3)，因此臧红t体积确定为在3.00 ml，此时臧红t反应液浓度为1.2
×
10-4 mol/l。
32.溶液ph考察结果表明，高酸度导致臧红t质子化效应增强，荧光强度减弱(图4曲线a)；臧红t猝灭反应体系受h2so4影响较小(图4曲线b)，荧光强度基本保持恒定，即h2so4取0.00 ml时，臧红t溶液ph=4.82，反应体系ph=4.11，相对荧光强度变化量达到最大，因此，荧光猝灭反应在ph=4.11～4.82环境下进行。
33.2.2.4 荧光猝灭时间实验结果显示，h2o2氧化反应速度较快，f随时间推移而快速下降，在2.5~10 min内，二者有线性关系，说明该褪色反应在一定阶段具备一级反应特性，15 min后f降到最低并趋于恒定，60 min内f保持不变。因此猝灭反应时间确定为15 min。
34.2.2.5 fe
2
用量考察实验结果显示，当v(fe
2
)=0.00 ml时，臧红t与h2o2几乎不反应；在0.10~0.80 ml范围内，荧光猝灭反应程度直接取决于fe
2
用量；当v(fe
2
)》0.80 ml时，荧光猝灭反应受抑制，这缘于高浓度fe
2
将促使h2o2内分解。因此，荧光猝灭反应时催化剂fe
2
最佳取量确定为0.80 ml。
35.酶促反应条件优化2.3.1 底物h2o2体积优化实验结果显示，体系f值随h2o2加入而减小，在0.00~1.00 ml区间范围内二者有良好的线性关系，当v(h2o2)》1.50 ml时，荧光猝灭程度降低(图5)。故取1 mmol/l h2o2溶液1.00 ml作酶反应底物。
36.酶促反应时间影响由图6可知：酶促反应速度较快，在开始0~5 min内，
△
f与时间成正比，具有一级反应特征；10 min后，
△
f趋于恒定。因此确定酶促反应时间为10 min。
37.过氧化氢酶活度工作曲线在最佳条件下测定
△
f并绘制工作曲线。图7显示，e与
△
f具有良好的线性关系：
△
f=0.7527 1807e(u/ml)，r=0.9980，平行测定酶空白10次，斜率除3倍的标准偏差得到检测限为3.81
×
10-5 u/ml。
38.还原性物质的干扰性考察实验重点考察vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖五种物质的干扰情况。结果表明，当样品中干扰物的浓度控制在10 mmol/l以内时，通过空白实验可有效克服对酶度测定值的影响。
39.血清酶活度分析随机取6例不同年龄、不同性别健康人体血样品作测试，回收率试验结果见表1。
40.表1：回收率试验结果(n=6)由上表可知，正常人血清过氧化氢酶活度值与年龄有相关性，测定值在35.1~62.3 u/ml范围内，加标回收率和标准差计算进一步证明该方法具有良好的准确性和较高的精密度。
41.综上所述，基于fenton试剂可以快速使臧红t发生荧光猝灭，而过氧化氢酶对fenton-臧红t荧光猝灭体系有抑制效应，能够完成过氧化氢酶活度检测，最低检出量可达到3.81
×
10-5 u/ml，明显优于显色和褪色光度法；fenton-臧红t荧光猝灭反应成功用于人体血清过氧化氢酶活度测定，临床应用前景看好，具有临床引领和示范作用。
42.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。