基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法

基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定cat活度的方法
技术领域
1.本发明涉及cat活度检测领域，具体涉及一种基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定cat活度的方法。


背景技术：

2.过氧化氢酶(cat)广泛存在于生物组织细胞中，适时分解糖代谢中间产物h2o2，在抗衰老、防病变等方面发挥重要生理作用。自1811年首次被发现cat以来，关于其活性测定方法的研究从未停止，相继出现了滴定法、紫外分光度法、显色光度法。目前，研究的热点主要集中于催化光度法。
3.荧光光度法集稳定性、高灵敏性、低成本等于一体，罗丹明b(rhodamine b，rhb)结构中的苯环之间有“氧桥”相连，具有刚性平面结构，能够吸收辐射光的能量而产生荧光，当其醌式结构遭到破坏，分子失去平面刚性结构而发生荧光猝灭；荧光探针罗丹明b在微量分析领域得到广泛应用，碘-罗丹明b缔合物荧光探针用于测定鱼肝提取液中cat活度，有效避免共存还原性物质干扰，实用效果显著。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定cat活度的方法。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定cat活度的方法，该方法基于h2o
2-rhb-fe
2
荧光猝灭体系实现过氧化氢酶(cat)活度的测定，荧光物质罗丹明b于585 nm处有特征荧光峰，fenton试剂(h2o2/fe
2
)作用致其荧光猝灭，cat实现h2o2的分解，基于cat加入前后荧光变化
△
f确定cat活度，具体的，包括如下步骤：在50ml的容量瓶中加入25~100 μl血清和2.80ml h2o2，30 o
c水浴反应20 min，然后依次加入罗丹明b 4.00 ml 、缓冲溶液 2.50 ml 和fe
2 0.40 ml ，室温反应15 min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度f；同步测定酶空白体系f0，测定时，在50ml的容量瓶中加入25~100 μl血清，依次加入罗丹明b 4.00 ml 、缓冲溶液 2.50 ml 和fe
2 0.40 ml，振荡0.5min使酶失活后，加入2.80ml h2o2，室温反应15min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度f0；由
△
f确定cat活度e (1 ml cat溶液所消耗h2o2物质的量(μmol))，其中，
△
f = f
ꢀ‑
f0)，
△
f =-3.466 1472e(u/ml)，r=0.9954。
6.本发明的方法具有良好的抗干扰能力、重现性和准确性，对cat活度的线性检测范围为 0～0.056 u/ml，最低检出量可达到2.6
×
10-5
u/ml，明显优于显色和褪色光度法；成功用于人体血清cat活度测定，临床应用前景看好，具有临床引领和示范作用。
附图说明
7.图1为罗丹明b在不同体系中荧光光谱。
8.图2为fe
2
和fe
3
的催化作用比较图。
9.图3为罗丹明b荧光强度随溶液体积的变化情况图。
10.图4为罗丹明b体系荧光信号受ph影响程度图。
11.图5 为罗丹明b氧化反应时间影响图。
12.图6为fe
2
体积取量影响图。
13.图7为底液h2o2用量的影响图。
14.图8为酶促反应时间影响图。
15.图9为 cat活度工作曲线图。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
17.试验资料1.1 仪器与试剂荧光光度计(930n，上海精科)。
18.h2o2(ar 30%，国药集团化学试剂有限公司)溶液：1
×
10-3
mol/l。将30%双氧水稀释500倍，化学分析法测其浓度，逐级稀释。
19.cat(生物试剂，阿拉丁，≥3000 u
·
mg-1
)标准液：1 u/ml。称取0.0050g cat，蒸馏水溶解， 100 ml容量瓶定容，化学分析法测活度(e=100 u
·
ml-1
)，二次稀释即可。
20.罗丹明b (ar，福晨化学试剂有限公司)溶液：1
×
10-4
mol/l。分析天平称取0.0250 g rhb，蒸馏水溶解，500 ml容量瓶定容，根据准确浓度二次稀释即可。
21.0.01 mol/l fe
2
( feso4)。醋酸-醋酸钠缓冲溶液(c
总
=0.1 mol/l， ph=4.2)。
22.测定方法在50ml的容量瓶中加入血清(25~100 μl)和h2o2(2.80ml)，30 o
c水浴反应20min，然后依次加入罗丹明b (4.00 ml)、缓冲溶液(2.50 ml)和fe
2
(0.40 ml)，室温反应15min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度f。同步测定酶空白体系f0(在血清中先加入罗丹明b、缓冲溶液和fe
2
，振荡0.5min使酶失活，再加h2o2室温反应15min)。 cat活度e (1 ml cat溶液所消耗h2o2物质的量(μmol))由
△
f(
△
f = f
‑ꢀ
f0)确定。
23.k：cat活性工作曲线斜率，k=1472v：血清样品体积（μl），v=25~100 μl2 结果2.1 光谱分析罗丹明b在不同体系中荧光强度不同(图1)。在585 nm处，罗丹明b有一个最大荧光峰(图1中的曲线1)；在催化剂fe
2
的作用下，罗丹明b被h2o2氧化导致其荧光猝灭，荧光强度
f减小(图1中的曲线2)；若体系中加入cat，cat会分解h2o2，罗丹明b荧光猝灭程度减弱(图1中的曲线3)，荧光恢复程度与cat活度有关系。本实验确定罗丹明b荧光发射波长为585 nm。
24.2.2 荧光猝灭条件考察2.2.1 催化剂考察本文选择fe
2
和fe
3
作催化剂并对催化性能作比较。结果发现：罗丹明b和rhb h2o2两体系荧光光谱保持一致(图2中的曲线1) ，说明在无催化剂情况下，h2o2不能氧化rhb；加入h2o2，同时加入fe
2
或fe
3
后，均出现罗丹明b荧光猝灭(图2中的曲线2和3)，fe
2
使罗丹明b猝灭程度更大(图2中的曲线2)；不加h2o2时，fe
2
、fe
3
和罗丹明b混合，fe
2
对罗丹明b无猝灭现象，而fe
3
亦可实现罗丹明b荧光等效猝灭(图2中的曲线4)。由此说明，fe
3
不是催化剂而是氧化剂；fe
2
是催化剂，它能有效降低h2o2的分解活化能，产生氧化能力更强的羟基自由基(
•
oh)，本实验选择荧光猝灭反应的催化剂为fe
2
。
25.罗丹明b用量酶活性的测定范围与罗丹明b的用量有着密切的关系，若罗丹明b的用量偏小，酶活性的测定范围变窄；若用量偏大，分子之间的缔合作用导致体系的稳定性变差，测定准确度降低。在醋酸-醋酸钠缓冲 (ph4.0)介质中，考察罗丹明b荧光强度随溶液体积的变化情况(图3)。体系的荧光强度f值随着溶液体积的增大而逐渐增大，当罗丹明b在0.00～5.00 ml范围内时，荧光强度与体积有线性关系，因此罗丹明b的最佳用量确定为5.00 ml，此时罗丹明b反应液浓度为1.0
×
10-5 mol/l。
26.溶液ph考察0.05 mol/l硫酸代替缓冲溶液，改变硫酸体积，分别考察罗丹明b和rhb h2o2 fe
2
体系荧光变化情况。结果表明，酸性环境对荧光猝灭反应影响不大，在ph=2.0～4.5范围内，rhb h2o2 fe
2
体系荧光强度基本恒定；但罗丹明b体系荧光信号受ph影响程度较大(图4)，高酸度环境下质子化效应导致罗丹明b产生分子内猝灭现象，在ph=2.18～3.15范围内f随ph线性增大，当不加硫酸时，ph=5.53，f有最大值；为避免fe(oh)2沉淀，故选取hac-naac缓冲液(ph=4.2)作猝灭反应介质，最佳用量确定为2.50 ml。
27.2.2.3 罗丹明b氧化反应时间氧化反应即荧光猝灭反应。其它条件不变，考察氧化反应时间对h2o2 rhb fe
2
体系荧光强度的影响。结果表明，在催化剂fe
2
的作用下，罗丹明b被h2o2氧化的速率较快，荧光强度在5 min内迅速下降，15 min后荧光强度降到最低且基本恒定(见图5)。因此氧化反应时间确定为15 min。
28.2.2.4 fe
2
体积取量其它条件不变，改变fe
2
体积用量，测定加入不同体积fe
2
时的h2o2 rhb fe
2
体系荧光强度。结果可知，当v(fe
2
)=0.00 ml时，罗丹明b与h2o2几乎不反应；在0.00~0.20 ml范围内，荧光猝灭反应程度直接取决于fe
2
用量；当v(fe
2
)》0.60 ml时，荧光猝灭反应受抑制，这缘于高浓度fe
2
将促使h2o2内分解。因此，荧光猝灭反应时催化剂fe
2
最佳取量确定为0.40 ml。
29.酶促反应条件优化2.3.1 底物h2o2体积优化针对酶空白体系(v(cat)=0.00 ml)，在最佳猝灭反应条件下，改变h2o2体积用量，
测定荧光强度。结果显示荧光强度随h2o2体积增加而减小，在0.00~2.80 ml范围内有明显的猝灭现象，且荧光强度和h2o2体积有良好的线性关系，当h2o2体积大于2.80 ml时，线性斜率变差，为了增大酶活性测定范围，减小系统误差，取1
×
10-3 mol/l h2o2溶液2.80 ml作酶反应底物。
30.酶促反应时间影响取cat标准溶液1.00 ml，仅改变酶促反应时间，测定
△
f。由图8可知：酶促反应速度较快，在开始0～5 min内，
△
f与时间成正比，具有一级反应特征；10 min后，
△
f趋于恒定。因此确定酶促反应时间为10 min。
31.酶促反应终止剂的选择设定反应液cat活度为0.02u/ml，进一步考察酶促反应的终止方式。实验证实，改变温度和调节ph值均可实现cat失活，温度承受下限为65 o
c，失活最高ph值为4.5。为简化测定程序，选择hac-naac缓冲溶液作为酶促反应终止剂。
32.活度工作曲线针对cat h2o2 rhb fe
2
体系，在0.00～3.50 ml体积范围内改变cat标准液，在最佳条件下完成f、f0测定、计算δf并绘制工作曲线。结果显示：cat的加入促使罗丹明b荧光重现（图9），荧光强度增幅δf与cat活度e在0～0.056 u/ml活度范围内具有良好的线性关系（图9内插图）：δf=-3.466 1472e(u/ml)，r=0.9954，平行测定酶空白10次，斜率除3倍的标准偏差求得检测限为2.6
×
10-5 u/ml。
33.干扰性考察实验重点考察了血清样品中广泛存在的vc和葡萄糖两种物质的干扰情况。结果表明，上述两种物质均可被底物h2o2氧化，但当浓度控制在10 mmol/l以内时，可通过酶灭活空白实验克服其对酶活度度测定的影响。
34.血清酶活度分析对6份血清(由甘肃医学院附属医院体检中心提供，属于正常个体)样本cat活度按“1.2测定方法
”ꢀ
进行测定，并和碘量法作对比，结果见表1。
35.表1：样品分析及回收率实验结果(n=6)血清cat活度测定值在28~31 u/ml范围内，结果与碘量法基本保持一致；加标回收率和标准偏差计算进一步证明该方法具有良好的准确度和较高的精密度。
36.综上所述，罗丹明b在fenton试剂的作用下可快速发生荧光猝灭，而cat可有效抑制fenton试剂对罗丹明b的荧光猝灭，荧光重现程度与cat活度在0～0.056 u/ml范围内具有良好的线性关系，最低检出量可达到2.6
×
10-5
u/ml，明显优于显色和褪色光度法；fenton-rhb荧光猝灭反应成功用于人体血清cat活度测定，临床应用前景看好，具有临床引
领和示范作用。。
37.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。