一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用

1.本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种葡聚糖内切印迹酶制备方法及其在纤维多糖类物质降解转化中的应用。


背景技术：

2.随着现代工业的快速发展，对能源的需求日益增加。以不可再生的化石能源为主导的消费结构难以为继，生物质能的开发和大规模应用是解决人类未来能源需求的可行途径。植物每年储存的能量相当于全球主要燃料能耗的10倍，而生物质能的利用率还不到其总量的1%。纤维素的降解是纤维素生物质有效利用的关键环节。利用纤维素酶降解纤维素具有催化效率高、专一性强、反应条件温和及反应过程无污染等优点。但大多数天然纤维素酶的提纯困难、生产成本高、耐受性差、不易储存、难以回收和重复利用。通过对产酶菌株进行遗传改良虽然能在一定程度上提高酶的活性和产量，但幅度有限，难以彻底解决上述问题。
3.分子印迹技术（molecular imprinting technology，mit）的出现及其在抗体模拟方面取得的突破性进展为高效模拟酶的研究和开发提供了新的思路。mit是从仿生学的角度，采用人工方法制备对模板分子具有专一性识别作用的聚合物制备技术。它的显著特点是具有构效的预定性、识别的特异性和制备的便捷性。应用mit可以简便地获得特异性强、稳定性好和催化效率高的生物模拟物，即分子印迹模拟酶（molecularly imprinted catalyst，mic）。mic内可以形成一个与模板分子在空间结构上完全匹配的三维空穴，具有可同生物酶相媲美的选择性识别能力，能够催化手性及区域选择性的反应。结合生物酶的催化过程和机理，基于mit的特性，高保真设计和构建高活性模拟酶，已成为破解生物质能开发和应用难题最具前景的技术途径。目前，mic在酯类水解、肽链水解、diels-alder环加成、消除、氧化和还原等反应中均显示了良好的催化作用。
4.在纤维素酶系中，葡聚糖内切酶是纤维素水解中的关键酶类，许多产酶菌株的产量较高，在纤维素降解和利用过程中起着重要作用，其活性区域结构和催化机制也较为明确。


技术实现要素：

5.为了构建耐受性好、特异性强和催化效率高人工模拟酶，本发明通过对里氏木霉纤维素内切酶ⅰ的活性中心进行分析，结合生物信息学手段，筛选出该酶的活性位点，设计相应生物源性交联功能单体，构建高活性mic，并用于纤维素底物的生物转化与利用。
6.本发明采用的具体方案如下：本发明的目的一在于提供一种葡聚糖内切印迹模拟酶的制备方法，包括以下步骤：（1）生物源性交联功能单体的制备：所述生物源性交联功能单体为甲基丙烯酸基氨基酸甲酯；
所述甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入氨基醇、二氯甲烷和三乙胺，0 ℃下缓慢滴加甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，产物用乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液萃取，所得有机相加入无水硫酸钠脱水干燥12 h，产物真空抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，采用柱层析方法进行产物的分离和纯化；（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将10 g-20 g纳米级二氧化硅微球用50 ml-100 ml 浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球；将所述活化二氧化硅微球1 g、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷750
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l、氨基苯硼酸0.5 g和三乙胺250
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l加入25 ml的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/l碳酸氢钠和1 mol/l盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液ph为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60 o
c干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球；（3）mic微球的高通量制备：在96孔板上进行mic的高通量制备，将1 mmol的模板分子和交联功能单体、可聚合离子液体和n，n-亚甲基双丙烯酰胺溶于20 ml-100 ml ph 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，与步骤（2）所得芳香硼酸化纳米硅胶微球的乙醇溶液混合，震荡混匀，在氮气的保护下加入10%过硫酸铵溶液和5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150
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l-200
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l置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h，制得mic微球；所述交联功能单体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，离子液体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，n，n-亚甲基双丙烯酰胺的添加量为模板分子摩尔量的8-20倍；10%过硫酸铵溶液和5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液的加入量分别为200
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l-300
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l和200
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l-500
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l；芳香硼酸化纳米硅胶微球的添加量为溶液总质量的5%-15%；（4）mic微球的洗脱：将步骤（3）所得mic微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 mol l-1
的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止，制得葡聚糖内切印迹模拟酶。
7.作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（1）中，所述氨基醇采用如下方法进行制备：在四口烧瓶中加入无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入四氢铝锂，搅拌0.5 h-1 h后加入氨基酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 o
c干燥至恒重，得氨基醇。
8.优选地，在氨基醇的制备中，所述氨基酸的种类为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种，且构型为l型。
9.优选地，在氨基醇的制备中，所述四氢呋喃的添加量为100 ml-200 ml，氨基酸的添加量为30 mmol-50 mmol，四氢铝锂的添加量为200 mmol-250 mmol。
10.作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（1），在甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备中，氨基醇的添加量为10 mmol-50 mmol，二氯甲烷的添加量为10 ml-50 ml，三乙胺的添加量为10 ml-50 ml，甲基丙烯酰氯的添加量为3 ml-10 ml；其中，乙酸乙酯萃取液的用量为
每次15 ml-50 ml，连续萃取3次，合并有机层，有机层依次用10 ml-50 ml饱和碳酸氢钠和10 ml-50 ml饱和氯化钠水溶液液液萃取1次，最后用10 g-50 g无水硫酸钠脱水干燥12 h，所得产物干燥后，过3 cm*300 cm的硅胶层析柱，用v/v为3-8︰1的石油醚-乙酸乙混合溶剂进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
11.作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（3）中，所用离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐、1，6-己基-3，3
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二-1-乙烯基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑、3-（3-氨丙基）-1-乙烯基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙酸乙酯基咪唑氯盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐和1-乙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
12.作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（3）中，所述模板分子为麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖中的一种。
13.本发明的目的二在于提供采用上述制备方法制得的葡聚糖内切印迹模拟酶。
14.本发明的目的三在于提供所述葡聚糖内切印迹模拟酶在纤维素底物的生物转化与利用方面的应用。
15.本发明的目的四在于提供利用上述葡聚糖内切印迹模拟酶催化分解羧甲基纤维素的方法，所述方法的具体操作如下：以羧甲基纤维素为底物，将葡聚糖内切印迹模拟酶的mic微球加入羧甲基纤维素溶液中，在ph值为4.5、反应温度为35 ℃条件下孵育0.5 h-24 h；所述mic微球的添加量为羧甲基纤维素溶液总质量的5%-15%；羧甲基纤维素溶液的浓度为5%-15%，体积为10 ml-50 ml。
16.本发明相比于现有技术，具有以下技术效果：1. 与常规生物源性葡聚糖内切印迹酶相比，本发明的mic能够在短时间内实现底物的温和、绿色和高效催化，具有操作简便、耐受性好和经济实用等特点。
17.2. 基于多种新型功能单体和离子液体的mic能够实现多重识别，实现不同识别模式共存与协同，对底物及其类似物的识别效果更好，催化效率更高。
18.3. 本发明采用表面接枝共聚法制备mic 微球，具有聚合效率高，分散性好，形态和规格均一，反应可控性强，模板分子易洗脱，结合容量高，识别效果好等优点。
19.4. 本发明与常规生物源性葡聚糖内切印迹酶相比，mic具有稳定的理化性质，对极端环境耐受能力强，能够在常规条件下保存较长时间。
附图说明
20.图1是本发明中分子印迹模拟酶的制备技术流程图；图2是利用本发明所述葡聚糖内切印迹模拟酶以纤维素为底物的催化分解示意图。
具体实施方式
21.本发明通过分析生物源葡聚糖内切酶的结构和活性机理，结合化学仿生学方法，构建高活性mic，探索和推动生物质能的开发和应用新途径。本发明的成果具有重要的理论
价值和广阔的应用前景，所得mic作为一种高保真的仿生模拟酶，可用于纤维素及其结构类似物的降解与回收利用，将产生显著的经济和生态效益，并为贯彻循环经济理念，构建资源节约型和环境友好型社会提供有效支撑。
22.本发明采用分子印迹技术，借鉴生物酶的催化过程和机理，基于生物源交联功能单体和可聚合离子液体，应用表面接枝共聚合法，在芳香硼酸化纳米硅胶微球表面仿生设计和构建高活性印迹模拟酶，通过高通量筛选，研制葡聚糖内切印迹酶。
23.本发明采用接枝共聚法在硅胶微球表面进行印迹模拟酶的构建与识别。具体的制备步骤如下。
24.（1）生物源性交联功能单体的制备：氨基醇的制备：在四口烧瓶中加入无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入四氢铝锂，搅拌0.5 h-1 h后加入氨基酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得氨基醇。
25.甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入氨基醇、二氯甲烷和三乙胺，0 ℃下缓慢滴加甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，产物用乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液萃取，所得有机相加入无水硫酸钠脱水干燥12 h，产物真空抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，采用柱层析方法进行产物的分离和纯化。
26.（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将10 g-20 g纳米级二氧化硅微球用50 ml-100 ml 浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。将活化二氧化硅微球（1 g）、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（750
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l）、氨基苯硼酸（0.5 g）和三乙胺（250
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l）加入25 ml的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/l碳酸氢钠和1 mol/l盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液ph为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60 ℃干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
27.（3）mic微球的高通量制备：在96孔板上进行mic的高通量制备，将1 mmol的模板分子和一定比例的交联功能单体、可聚合离子液体和n，n-亚甲基双丙烯酰胺溶于20 ml-100 ml ph 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，与纳米硅胶微球的乙醇溶液混合，震荡混匀，在氮气的保护下加入10%过硫酸铵溶液和5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150
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l-200
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l置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
28.（4）mic微球的洗脱：所得mic微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 mol l-1
的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止。空白微球的制备除不加模板分子外，方法同上。
29.（5）mic微球催化活性分析以羧甲基纤维素为底物，将mic微球加入羧甲基纤维素溶液中，孵育0.5 h-24 h，分析不同反应温度、ph值和金属离子等条件下mic的催化活性，计算米氏常数，了解催化动力学过程和特征。
30.所述步骤（1）中氨基酸的种类为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、
天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种，且构型为l型。
31.所述步骤（1）氨基醇的制备中四氢呋喃的添加量为100 ml-200 ml，氨基酸的添加量为30 mmol-50 mmol，四氢铝锂的添加量为200 mmol-250 mmol。
32.所述步骤（1）甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备中氨基醇的添加量为10 mmol-50 mmol，二氯甲烷的添加量为10 ml-50 ml，三乙胺的添加量为10 ml-50 ml，甲基丙烯酰氯的添加量为3 ml-10 ml。其中，乙酸乙酯萃取液的用量为每次15 ml-50 ml，连续萃取3次，合并有机层，有机层依次用10 ml-50 ml饱和碳酸氢钠和10 ml-50 ml饱和氯化钠水溶液液液萃取1次，最后用10 g-50 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙混合溶剂（v/v，3-8︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
33.所述步骤（3）中所用离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐、1，6-己基-3，3
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二-1-乙烯基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑、3-（3-氨丙基）-1-乙烯基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙酸乙酯基咪唑氯盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐和1-乙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
34.所述步骤（3）中模板分子为麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖中的一种。交联功能单体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，离子液体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，n，n-亚甲基双丙烯酰胺的添加量为模板分子摩尔量的8-20倍。10%过硫酸铵溶液和5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液的加入量分别为200
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l-300
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l和200
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l，纳米硅胶微球的添加量为溶液总质量的5%-15%。
35.所述步骤（5）中mic微球的添加量为底物溶液总质量的5%-15%，羧甲基纤维素溶液的浓度为5%-15%，体积为10 ml-50 ml。
36.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
37.实施例1（1）生物源性交联功能单体的制备缬氨醇的制备：在四口烧瓶中加入120 ml无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入220 mmol四氢铝锂，搅拌0.5 h后加入30 mmol缬氨酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，展开剂为甲醇-二氯甲烷混合溶剂（v/v，1︰2），将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得缬氨醇。
38.甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入20 mmol缬氨醇、25 ml二氯甲烷和20 ml三乙胺，0 ℃下缓慢滴加4 ml甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，展开剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，10︰1），产物用20 ml乙酸乙酯连续萃取3次，合并有机相，依次用20 ml饱和碳酸氢钠和20 ml饱和氯化钠水溶液萃取1次，最后用20 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，4︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40℃真空干燥至恒重。
39.（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将10 g纳米级二氧化硅微球用50 ml浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，
mmol n，n-亚甲基双丙烯酰胺溶于50 ml ph 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，加入纳米硅胶微球的乙醇溶液，加入量为溶液总质量的10%，震荡混匀后，在氮气的保护下加入250
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l 10%过硫酸铵溶液和350
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l 5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150
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l置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
47.（4）mic微球的洗脱：方法同实施例1。
48.（5）mic微球催化活性分析：以羧甲基纤维素为底物，将mic微球加入15 ml 10%的羧甲基纤维素溶液中，孵育5 h，mic的添加量为底物溶液总质量12%，催化反应的ph值为4.5，反应温度为35 ℃，采用dns法，测定反应前后还原糖的生成量，据此筛选测定模拟酶微球的催化性能，对还原糖生成量比较高的样本应用高效液相色谱-串联质谱方法进行确证分析，详细分析产物种类和反应体系的变化。结果显示酶活力为11.23 u ml-1
，米氏常数为3.8 mg ml-1
，对空白微球催化性能测定和分析结果显示，催化活性仅为印迹模拟酶的7%。
49.实施例3（1）生物源性交联功能单体的制备：组氨醇的制备：在四口烧瓶中加入200 ml无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入250 mmol四氢铝锂，搅拌50 min后加入50 mmol组氨酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，展开剂为甲醇-二氯甲烷混合溶剂（v/v，4︰1），将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得组氨醇。
50.甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入50 mmol组氨醇、45 ml二氯甲烷和40 ml三乙胺，0 ℃下缓慢滴加9 ml甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，展开剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，6︰4），产物用45 ml乙酸乙酯连续萃取3次，合并有机相，依次用45 ml饱和碳酸氢钠和45 ml饱和氯化钠水溶液萃取1次，最后用45 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，4︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
51.（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将20 g纳米级二氧化硅微球用90 ml浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。其余步骤同实施例1，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
52.（3）mic微球的高通量制备：在96孔板上进行mic的高通量制备，将1 mmol模板分子纤维三糖和5 mmol交联功能单体、5 mmol可聚合离子液体1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐和20 mmol n，n-亚甲基双丙烯酰胺溶于85 ml ph 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，加入纳米硅胶微球的乙醇溶液，加入量为溶液总质量的15%，震荡混匀后，在氮气的保护下加入280
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l 10%过硫酸铵溶液和430
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l 5% n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150
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l置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
53.（4）mic微球的洗脱：方法同实施例1。
54.（5）mic微球催化活性分析：以羧甲基纤维素为底物，将mic微球加入25 ml 15%的羧甲基纤维素溶液中，孵育3 h，mic的添加量为底物溶液总质量15%，催化反应的ph值为4.5，反应温度为35 ℃，采用dns法，测定反应前后还原糖的生成量，据此筛选测定模拟酶微球的催化性能，对还原糖生成量比较高的样本应用高效液相色谱-串联质谱方法进行确证
分析，详细分析产物种类和反应体系的变化。结果显示酶活力为10.74 u ml-1
，米氏常数为3.7 mg ml-1
，对空白微球催化性能测定和分析结果显示，催化活性仅为印迹模拟酶的6%。
55.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。