藤黄酸联合盐酸阿霉素在制备抗T细胞淋巴瘤药物中的应用的制作方法

藤黄酸联合盐酸阿霉素在制备抗t细胞淋巴瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及藤黄酸联合盐酸阿霉素在制备抗t细胞淋巴瘤药物中的应用。


背景技术：

2.藤黄酸是从传统中药藤黄中分离得到的一种活性单体，研究表明藤黄酸具有潜在的抗肿瘤作用，能够抑制肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤以及白血病等多种人类常见肿瘤。藤黄酸主要通过诱导凋亡、阻滞细胞周期进展、抑制癌细胞转移和抑制血管生成等途径来实现抗实体瘤生长作用。除此以外研究还发现藤黄酸能直接与抗凋亡蛋白bcl-2家族的六种蛋白(bcl-xl，bcl-2，bcl-w，bcl-b，bfl-1和mcl-1)的bh3多肽结合位点结合，进而促进了人急性粒细胞白血病hl-60细胞和junkat细胞的凋亡。
3.盐酸阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成达到抗肿瘤作用。本品抗瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀灭作用。本发明中，拟采用藤黄酸联合低剂量的盐酸阿霉素发挥协同的抗肿瘤作用，为临床联合用药提供一种新的治疗策略。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供藤黄酸联合盐酸阿霉素在制备抗t细胞淋巴瘤药物中的应用。
5.本发明发现天然化合物藤黄酸(ga)联合低剂量的盐酸阿霉素能显著抑制t细胞淋巴瘤细胞的生长。进一步通过cck8实验验证了藤黄酸与低剂量的盐酸阿霉素联用可发挥协同抗t细胞淋巴瘤作用，提示这种联合给药抗t细胞淋巴瘤的应用潜力。
附图说明
6.图1为藤黄酸联合低剂量阿霉素对t细胞淋巴瘤细胞株hut-102生长的影响结果。
7.图2为藤黄酸对t细胞淋巴瘤细胞株hut-102生长的影响结果。
8.图3为阿霉素对t细胞淋巴瘤细胞株hut-102生长的影响结果。
9.图4为藤黄酸联合柔红霉素对t细胞淋巴瘤细胞株hut-102生长的影响结果。
具体实施方式
10.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
11.本发明采用的试剂如下：
12.1.试剂
13.(1)藤黄酸(c
38h44
o8，分子量：628.75)由中国药科大学提供，黄色粉末，纯度大于
97％，使用前用二甲亚砜(dmso)将药物粉末配制为0.01m浓度的母液，置于-80℃保存。
14.盐酸阿霉素(c
27h29
no
11
·
hcl，分子量579.99)由南京鼓楼医院提供，白色粉末，使用前用二甲亚砜(dmso)将药物粉末配制为1mm浓度的母液，置于-80℃避光保存。
15.所有试剂临用前用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液配成所需浓度。
16.(2)细胞培养试剂
17.①
培养液：rpmi-1640培养基，购自美国gibco公司。取rpmi-1640粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中，并加入2.0g nahco3，用1m盐酸调ph值至7.0，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素。
18.②
胎牛血清：美国gibco公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
19.③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po4.2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
20.(3)细胞生长活力抑制检测相关试剂
21.cck8试剂盒购自vazyme公司。
22.2.细胞株
23.人t细胞淋巴瘤细胞株hut-102购自上海中国科学院细胞所。hut-102细胞用含100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi1640培养液培养。
24.实施例1
25.藤黄酸联合盐酸阿霉素(doxorubicin，dox)对人t细胞淋巴瘤细胞生长的影响
26.cck-8细胞计数试剂盒(称为cck-8试剂盒)是依赖于于wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯))-2h-四唑单钠盐)而广泛用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速，高度灵敏的非放射性比色检测试剂盒。
27.wst-8在电子偶联载体-methoxy pms的作用下可被线粒体中的一些脱氢酶还原成高度水溶性的橙黄色甲臜产品(formazan)。产生的甲臜的颜色深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测量吸光度，该吸光度可以间接反映活细胞的数量，据此可以检测细胞的活力。
28.将细胞按照1*104个/ml细胞密度培养在96孔酶标板内，每孔内的细胞体积为100μl，同时在其中加入100μl指定浓度的藤黄酸和盐酸阿霉素；将给过药物的细胞继续置于孵箱培养24h后，每孔加入20μl cck8试剂；继续孵育4h后使用450nm波长检测其吸光度。
29.将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率：
[0030][0031]
采用联合作用指数(ci)判断两种药物的协同性。ci＝da/icx，a db/icx，b(a、b代表两种不同药物，icx，a和icx，b是两种药物单独使用使生长抑制率达x时的药物浓度，da和db是两药联用使生长抑制率达x时两种药物的浓度)。根据soriano等的判断方法，0.9≤ci≤1.1为叠加作用，0.8≤ci＜0.9为低度协同作用，0.6≤ci＜0.8为中度协同作用，0.4≤ci＜0.6为高度协同作用，0.2≤ci＜0.4为强协同作用。该结果均采用compusyn软件计算统计。
[0032]
通过cck8实验测定24h时间点天然化合物藤黄酸(ga)联合盐酸阿霉素
(doxorubicin，dox)对t细胞淋巴瘤细胞系hut-102生长的抑制作用。
[0033]
如图1-图3所示，相较于盐酸阿霉素单用组，藤黄酸联合盐酸阿霉素显著抑制t细胞淋巴瘤细胞系hut-102细胞的生长，该结果初步证实了藤黄酸联合化疗药抗t细胞淋巴瘤的作用。两药在不同浓度作用下的联合指数(ci)如表1所示，ci＜0.8即表明呈协同作用。
[0034]
表1藤黄酸联用盐酸阿霉素联合指数(ci)
[0035]
ga(μm)doxorubicin(μm)cl0.50.025.668650.50.040.490520.50.080.530520.50.160.529130.50.320.662060.50.640.786830.51.281.21209
[0036]
由以上结果可知，天然化合物藤黄酸(ga)联合低剂量的盐酸阿霉素能显著抑制t细胞淋巴瘤细胞的生长，通过cck8实验验证了藤黄酸与低剂量的盐酸阿霉素联用可发挥协同抗t细胞淋巴瘤作用，提示了这种联合给药抗t细胞淋巴瘤的应用潜力。
[0037]
此外，本发明同时对藤黄酸联合柔红霉素抗t细胞恶性肿瘤进行研究研究结果如表2、表3和图4所示。
[0038]
表2藤黄酸联用柔红霉素联合指数(cl)
[0039]
ga(μm)daunorubicin(μm)cl0.50.1655.9260.50.3214.09290.50.642.440710.51.280.780030.52.560.667410.55.121.307800.510.242.51019
[0040]
表3藤黄酸联用柔红霉素联合指数(cl)
[0041]
ga(μm)daunorubicin(μm)cl10.1659.234710.3215.213910.642.7488211.280.8976912.560.7448615.121.38689110.242.58885
[0042]
由以上结果可知，藤黄酸0.5μm和1μm联用蒽环类药物柔红霉素(daunorubicin)分别作用人t淋巴瘤细胞系hut-102无协同抗肿瘤作用。