一种基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶及其制备方法和应用

1.本发明属于医药领域与生物技术领域，尤其是涉及一种铁蛋白-铜催化内源性rsno生成no的纳米酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.一氧化氮是细胞内重要的信号分子，其不仅在心血管系统中发挥着重要的作用，而且在免疫调节、组织损伤修复等生理过程中均扮演着重要的角色，因此基于no的疾病治疗受到人们的广泛关注。目前，提高no的方式主要包括调控一氧化氮合成酶的表达或者活性的方式调控细胞内或体内的no水平，另外就是以血液中的一氧化氮供体s-亚硝基硫醇(rsno)主要包括亚硝基谷胱甘肽(gsno)、亚硝基半胱氨酸(cysno)、亚硝基白蛋白(albsno)等，在一定催化剂的作用下引起rsno的分解生成no，提高no生成水平。
3.铁蛋白是广泛存在于自然界中的一种通用的天然铁储存蛋白质。其具有12nm的外部直径及8nm的空腔，其内部可负载药物、成像分子，具有仿生生物矿化的能力。通过内部装载不同的金属颗粒可以产生不同的纳米酶活性。以基因重组的人源重链铁蛋白作为形成纳米颗粒的骨架，原位矿化形成铜纳米颗粒，是可以获得具有可控尺寸、优异生物相容性的no生成催化剂。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在提出一种基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶，该纳米酶可以发挥高效催化内源性rsno分解生成no的作用，发挥促进内皮细胞成管以及促进血管舒张的作用，能够适用于no治疗的相关心血管疾病应用。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶，该纳米酶包括铁蛋白和位于所述铁蛋白笼内的铜纳米团簇。
7.优选的，所述铁蛋白笼的铁蛋白来源于基因重组的人源重链铁蛋白，序列为seq id no:1，序列同源性在90％以上。
8.优选的，所述纳米酶为棕色溶液，铜纳米团簇的尺寸小于8nm，优选为2-5nm。
9.本发明的另一目的在于提供一种基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶的制备方法，将纯化的人源重链铁蛋白(ftn)与cucl2孵育后，使用nabh4还原即可制备得到包载铜纳米颗粒的铁蛋白-铜纳米酶(ftn-cu)。
10.优选的，所述基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)人源重链铁蛋白(ftn)的制备：将人源重链铁蛋白基因连接到pet-21a载体中构建pet21a-ftn原核表达载体，并构建ftn原核表达菌株，再用iptg对ftn原核表达菌株进行诱导表达，诱导表达完成后加热、离心去除部分杂蛋白，将上清液超滤浓缩后用色谱柱进行分离纯化即得ftn；
12.(2)人源重链铁蛋白(ftn)与cucl2孵育：将确定浓度的ftn的ph调节至8-9之间，配置一定浓度的cucl2溶液按照一定量的ftn和金属铜离子的摩尔比逐滴加入cucl2溶液，在加入cucl2溶液过程中时刻控制ph在8-9之间，加完后继续在搅拌器上搅拌反应使金属铜离子与ftn孵育结合，离心除去沉淀，过柱子除去游离在ftn外的金属铜离子；
13.(3)使用nabh4还原：将步骤(2)得到的纯化后的溶液调节ph大于7，加入5-10mg/ml的nabh4对金属铜离子进行还原，并继续冰浴搅拌30-60分钟，使金属铜离子充分还原，最后将溶液在超滤管中离心浓缩，测定所得到的ftn-cu纳米酶的浓度。
14.优选的，所述步骤(1)中当菌液od600为0.6-0.8，用iptg诱导表达3-5小时。
15.优选的，所述步骤(2)中ftn的ph为8.5，铁蛋白和金属铜离子的摩尔比为1:500-1000。
16.优选的，所述ftn与cucl2在25℃-65℃条件下孵育30-60min，
17.最优的，所述ftn与cucl2在60℃-65℃条件下孵育45-60min。
18.优选的，所述纳米酶可以高效催化内源性rsno分解生成no，具体操作步骤如下：
19.(1)pbs溶液中加入一氧化氮供体(gsno、cysno或albsno)和gsh；
20.(2)随后分别加入不同浓度的纳米酶，反应一定时间后取样测试；
21.(3)采用griess试剂方法检测溶液中产生的no含量，分别从溶液中取一定量的溶液后一次加入50μl的griessi和50μl的griess ii并在540nm波长下检测吸光度值。
22.优选的，步骤(1)中一氧化氮供体为10-1000μm gsno和10-1000μm gsh。
23.优选的，步骤(1)中一氧化氮供体为为100μm gsno和100μm gsh。
24.优选的，步骤(3)取样体积为50μl。
25.本发明的第三目的在于提供一种基因重组的人源重链铁蛋白-铜纳米酶在心血管疾病的应用。
26.优选的，所述纳米酶可发挥高效催化内源性rsno分解生成no应用于心血管疾病，包括血管新生(内皮细胞增殖，内皮细胞迁移，内皮细胞成管)、促进血管舒张以及促血管内皮化等。
27.更优选的，所述纳米酶促进血管舒张具体操作步骤如下：
28.(1)利用离体组织水浴装置对主动脉环的生理响应进行评价：首先将sd大鼠的胸主动脉取出，切成4mm的小段，并对其表面的脂肪和结缔组织进行剥离，注意不要损伤血管，将血管环套在传感器上，并浸没在37℃恒温并充有95％氧气和5％二氧化碳的krebs溶液中；
29.(2)首先对拉力进行平衡，使拉力维持在2g平衡1小时，随后加入60mm kcl溶液，血管出现明显的收缩，拉力值表现为不断增大；
30.(3)待拉力平衡后，将60μg/mlftn-cu纳米酶和一氧化氮供体同时加入，将纯的ftn-cu纳米酶溶液作为对照，由力学传感器记录不同刺激下的力学响应，计算公式为：relaxation rate(g/min)＝(f
0-f
t
)/t，式中，f0、f
t
分别为no生成体系刺激前后测得的主动脉环张力，t为no生成体系刺激前后过程中记录的时间。
31.相对于现有技术，本发明的有益效果为：
32.(1)本发明所采用的材料相比于其他的纳米颗粒的合成制备工艺简单，产率高，重复性好，得到的材料尺寸均一，活性好。
33.(2)本发明以基因重组的人源重链铁蛋白为基本单元，提高了金属结合能力和纳米酶的稳定性以及在缺血和肿瘤相关疾病中的定位和累积，促进其在特定部位发挥作用。
34.(3)以人源重链铁蛋白为基本单元可以用于很多材料表面修饰，包括人工血管、金属支架等材料表面修饰，应用于心血管疾病中的治疗。
附图说明
35.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
36.图1是人源重链铁蛋白的质粒图谱；
37.图2是铁蛋白-铜纳米酶，其中，a是铁蛋白-铜纳米酶的合成示意图；b是ftn加入cucl2后，nabh4还原前后颜色变化；c是人源重链铁蛋白的电镜表征图(左)以及铁蛋白-铜纳米酶(ftn-cu)的电镜图(右)；
38.图3是ftn-cu的xps(左)和aes(右)图谱；
39.图4是no电极传感器实时监测内源性一氧化氮供体(gsno、cysno和albsno)在不同浓度的ftn-cu纳米酶催化产生no的过程；
40.图5是heatmap图像显示内源性一氧化氮供体(gsno、cysno和albsno)在含有不同金属的ftn纳米酶催化下生成no的能力；
41.图6是ftn-cu纳米酶催化一氧化氮供体(100μm gsno和100μm gsh)生成no的可重复性测试；
42.图7是在存在或不存在no供体以及ftn-cu的情况下内皮细胞的成管实验，其中，a是示意图；b是代表性的共聚焦图像；c是成管数量统计结果；
43.图8是ftn-cu纳米酶催化一氧化氮供体(gsno)生成no引起血管舒张的力学-时间曲线,其中，a是示意图；b是no生成体系引起血管的力学-时间变化曲线；c是统计力学变化速率分析。
具体实施方式
44.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
45.实施例1：基因重组人源铁蛋白重链的制备
46.如图1所示，将基因重组人源铁蛋白重链基因连接到pet-21a载体中，构建pet21a-ftn原核表达载体，该表达载体为本实验室前期构建保存，将含有人源铁蛋白重链基因(human ferritin heavy chain 1)geneid:2495的pet21a-ftn原核表达载体转化至感受态大肠杆菌bl21(de3)中，并将转化的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素(amp)抗性的平板中，37℃恒温培养箱内倒置培养10～14小时，筛选得到ftn原核表达菌株。挑取单菌落加入到含有amp的5ml lb培养基中，180rpm，37℃条件下培养过夜。过夜培养菌液转接到含有amp的1l烧瓶中继续扩增，约4小时后，经分光光度计测定，当菌液od600约为0.6-0.8时，用1mm的iptg继续诱导蛋白表达4小时。结束后4000rpm，离心10分钟收集沉淀。用pbs清洗沉淀2次，最后重悬在pbs中进行超声破碎，控制功率120w冰浴超声20分钟至菌液澄清。12000rpm离心10分钟收集上清，除去细菌沉淀。将上清液置于65℃水浴中加热10分钟，之后12000rpm离心10分钟收集上清，以去除绝大部分杂蛋白。最后将全部上清液超滤浓缩至一定的体积，用
superose6色谱柱经akta层析系统进行分离纯化即得基因重组的人源重链铁蛋白(ftn)。
47.实施例2：ftn-cu纳米酶的制备
48.取2mgftn用氢氧化钠调ph至8.5-9；以ftn与金属摩尔比1:500的比例向ftn溶液中加入cucl2溶液，25℃搅拌反应一个小时。3000rpm离心5分钟除去沉淀后采用pd-10柱子除去游离在ftn外的金属离子，纯化后的溶液调节ph大于7，以金属与nabh4为1:5的摩尔比向溶液中滴加5mg/mlnabh4对金属离子进行还原，冰浴搅拌反应30min，使金属充分还原，颜色变化如图2b所示。最后将溶液在30kda的超滤管中离心浓缩，记为ftn-cu，如图2c显示铁蛋白笼内部以铜纳米团簇的形式存在，结果如图3(xps和aes)显示制备的ftn-cu纳米酶内部铜的价态主要为 1价，ftn-cu纳米酶以已知浓度的ftn作为标准品进行sds-page跑胶定浓度。
49.实施例3：与实施例2的ftn-cu纳米酶的制备基本一致
50.取2mgftn用氢氧化钠调ph至8.5-9；以ftn与金属摩尔比1:1000的比例向溶液中加入cucl2水溶液，60℃搅拌反应一个小时，采用pd-10柱子去除未包载的金属离子，纯化后的溶液调节ph大于7，以金属与nabh4的摩尔比为1:5的比例向溶液中滴加5mg/mlnabh4，冰浴搅拌反应60min。进一步纯化后，记为ftn-cu。
51.实施例4：ftn-cu催化rsno分解生成一氧化氮
52.对本发明实施例制备的样品进行催化rsno分解生成no功能测试，测试方法为：pbs溶液中加入一氧化氮供体(终浓度为100μmrsno和100μmgsh)，随后分别加入10种不同的纳米酶，反应一定时间后取样测试，采用griess试剂盒检测溶液中产生的no含量。分别从反应溶液中取50μl的体系后加入50μl的griessi和50μl的griess ii并在540nm波长下检测吸光度值。结果如图5所示，ftn-cu对三种供体表现出最高的催化作用，同等条件下生成最多的no，且ftn-cu纳米酶具有催化可重复性，当回收ftn-cu纳米酶且更换新的一氧化氮供体后其保持着基本相同的催化效率(如图6所示)。
53.实施例5：ftn-cu催化rsno分解生成一氧化氮
54.对本发明实施例制备的ftn-cu样品采用no电极法测试rsno分解生成no的能力，测试方法为：pbs溶液中加入一氧化氮供体(终浓度为100μmrsno和100μm gsh)，将电极置于反应液中，浸没深度为2-3mm，待电极稳定后，向反应液中加入一定浓度的ftn-cu(1，2.5，5，10μg/ml),记录电流变化来判断ftn-cu的催化效果，结果如图4所示，ftn-cu对三种供体均表现出明显的催化分解生成no的作用，且ftn-cu的催化活性具有浓度依赖性，浓度越高，催化效率越高，表明ftn-cu纳米酶对于三种内源性一氧化氮供体的催化表现出了相同的趋势。
55.实施例6：ftn-cu催化rsno分解生成一氧化氮促进内皮细胞成管
56.使用内皮细胞成管实验在体外对材料的促血管生成潜力进行评估，将100μl matrigel加入到48孔板的孔中，37℃孵育30分钟固化，接下来，将1
×
104内皮细胞铺在matrigel上。为了评价一氧化氮诱导的血管生成，我们用不同浓度的ftn-cu添加一氧化氮供体(终浓度为10μm gsno和10μm gsh)处理内皮细胞，并以无血清1640培养基作为对照。共培养12小时后，用pbs洗2次，然后用4％多聚甲醛固定，细胞用fitc标记鬼闭环肽染色，并用共聚焦显微镜观察。对形成的毛细血管样结构使用imagej进行定量。结果如图7所示，与未处理细胞相比，在补充no供体时经ftn-cu纳米酶处理的内皮细胞成管能力显著提高。
57.实施例7：ftn-cu催化rsno分解生成一氧化氮促进血管舒张
58.利用离体组织水浴装置对主动脉环的生理响应进行评价。首先将sd大鼠的胸主动脉取出，切成4mm的小段，并对其表面的脂肪和结缔组织进行剥离，注意不要损伤血管，将血管环套在传感器上，并浸没在37℃恒温并充有95％氧气和5％二氧化碳的krebs溶液中，首先对拉力进行平衡，使拉力维持在2g平衡1小时，随后加入60mm kcl溶液，血管出现明显的收缩，拉力值表现为不断增大，待拉力平衡后，将60μg/mlftn-cu纳米酶和一氧化氮供体(100μμgsno)分别加入，将纯的ftn-cu纳米酶溶液作为对照，由力学传感器记录不同刺激下的力学响应。计算公式为：relaxation rate(g/min)＝(f
0-f
t
)/t。式中，f0、f
t
分别为no生成体系刺激前后测得的环张力，t为过程中记录的时间，结果如图8所示与仅添加ftn-cu相比，同时加入ftn-cu和no供体的血管环发生了明显的血管舒张，舒张力学变化速率增加了约180倍(p《0.001)。结果显示，制备的ftn-cu能即时催化no供体释放no引起血管舒张反应。
59.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。