一种具有抗衰老作用的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种具有抗衰老作用的组合物及其应用。


背景技术：

2.裂褶菌是一种珍贵的可食用菌，其子实体、菌丝体以及发酵液中存在的主要活性物质是裂褶多糖。研究表明其具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等药理活性。
3.在口服健康食品中被应用的主要是裂褶菌子实体提取物。但因为野生裂褶菌珍贵，人工培养子实体产量有限，直接影响其应用广泛度。同时，裂褶菌提取物颜色深，应用于口服产品会有限制。虽然裂褶菌发酵物(裂褶多糖)在化妆品中有应用，但未见裂褶菌发酵物在口服美容产品中的应用。
4.cn113337545a公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。具体而言，涉及一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产物，得到的发酵产物在抗氧化和清除自由基方面体现了积极的效果。
5.cn107320541a公开了一种裂褶菌酸枣仁糖浆及其制作工艺，所述的糖浆由裂褶菌发酵液、酸枣仁提取液、甜味剂、酸味剂、去离子水和稳定剂组成，各组分的重量份数及加入比例为：裂褶菌发酵液35-40份、酸枣仁提取液25-30份、甜味剂5-8份、酸味剂0.5-1份、去离子水330-350份和稳定剂1-2份。该发明采用裂褶菌发酵液和酸枣仁提取液直接配制产品，避免了有机溶剂的残留的毒副作用，对于患者来说，服用糖浆比专门吃药更容易接受，可以在享受美食的同时达到治疗的效果，具有很大的经济价值和开发潜力。
6.cn106173661a公开了一种复合菌种混合发酵功能饮料及其制备方法，每1000ml纯净水中包含：茯苓9～15g、竹荪10～30g、金耳6～12g、灰树花10～20g、猴头菌10～30g、蜜环菌30～60g、裂褶菌9～16g，甜味剂1～5g，酸度调节剂0.1～0.5g，增稠剂和稳定剂0.1～0.5g。固形物含量不低于10％，总酸《1.0％，色泽呈黄褐色，均匀一致，久置不易发生沉淀，具有发酵特有的香气和滋味，甘苦适宜，细腻协调，口感丰满，风格独特纯正。
7.因此，开发一种裂褶菌发酵物应用在口服的美容产品是本领域的研究重点。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗衰老作用的组合物及其应用。所述组合物对衰老皮肤作用的机制，发现其能够提升皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量，提高小鼠机体抗氧化酶活力，对炎性细胞因子分泌有抑制作用。
9.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物包括：裂褶菌发酵物、植物提取物和胶原蛋白肽。
11.在本发明中，所述裂褶菌发酵物、植物提取物和胶原蛋白肽相互配合，具有协同增效的作用，对皮肤具有抗衰老作用，能够明显提升皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量，提高小鼠机体抗氧化酶活力，对炎性细胞因子分泌有抑制作用。
12.优选地，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：裂褶菌发酵物20-40份、植物提取物3-10份和胶原蛋白肽7-16份。
13.在所述组合物中，所述裂褶菌发酵物含量为20-40份，例如可以是20份、22份、24份、26份、28份、30份、32份、34份、36份、38份、40份等。
14.在所述组合物中，所述植物提取物含量为3-10份，例如可以是3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份等。
15.在所述组合物中，所述胶原蛋白肽含量为7-16份，例如可以是7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份等。
16.优选地，所述裂褶菌发酵物为通过在含葛根的培养基中培养裂褶菌得到的裂褶菌发酵物。
17.其中，所述裂褶菌发酵物cn113337545a公开的制备方法制备得到。其在在抗氧化和清除自由基方面体现了积极的效果。提供的裂褶菌发酵产物含有活性成分裂褶多糖，并结合葛根基质的抗氧化能力，在清除过量自由基和抑制相关酶活性方面都体现了较佳的能力。
18.其中，所述裂褶菌发酵物原料来源及制备方法如下所示：
19.①
裂褶菌培养基：葛根粉末(≤40目)2-8g/l、酵母浸膏0.1-0.5wt％、硫酸镁0.01-0.15wt％、磷酸二氢钾0.05-0.2wt％、葡萄糖1-4wt％，余量为水。
20.在所述裂褶菌培养基中，葛根粉末的粒径≤40目，例如可以是40目、35目、30目、25目、20目、15目、10目、5目、2目、1目等。
21.在所述裂褶菌培养基中，葛根粉末的含量为2-8g/l，例如可以是2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l、6g/l、6.5g/l、7g/l、7.5g/l、8g/l等。
22.在所述裂褶菌培养基中，酵母浸膏的含量为0.1-0.5wt％，例如可以是0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％等。
23.在所述裂褶菌培养基中，硫酸镁的含量为0.01-0.15wt％，例如可以是0.01wt％、0.02wt％、0.04wt％、0.06wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.12wt％、0.14wt％、0.15wt％等。
24.在所述裂褶菌培养基中，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2wt％，例如可以是0.05wt％、0.06wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.12wt％、0.14wt％、0.16wt％、0.18wt％、0.2wt％等。
25.在所述裂褶菌培养基中，葡萄糖的含量为1-4wt％，例如可以是1wt％、2wt％、3wt％、4wt％等。
26.②
发酵培养：将裂褶菌菌种(广东省微生物研究所提供的gim5.43)通过活化培养，得到的裂褶菌；再将10％裂褶菌(v/v，裂褶菌种子液/接入种子液后培养基总体积)接入培养基中，在28-30℃(例如可以是28℃、29℃、30℃等)，140-170r/min(例如可以是140r/min、150r/min、160r/min、170r/min等)条件下发酵培养100-150h(例如可以是100h、110h、120h、130h、140h、150h等)。
27.③
制备发酵液：终止将发酵产物进行离心处理，将菌体和发酵液分离，得到的上清
液为发酵液。
28.优选地，所述植物提取物包括橄榄提取物、刺梨提取物、余甘子提取物、蓝莓提取物、蔓越莓提取物或黑果腺肋花楸提取物中任意一种或至少两种的组合。
29.优选地，所述植物提取物为通过pef萃取法得到。
30.优选地，所述植物提取物由以下制备方法制备得到：
31.(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对植物原料进行萃取，得到植物提取液；
32.(b)将步骤(a)得到的植物提取液过滤、浓缩，得到浸膏；
33.(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述植物提取物。
34.优选地，步骤(a)中，所述植物原料和水的质量体积比为1:(10-30)g/ml，例如植物原料的质量和水的比可以是1g/10ml、1g/15ml、1g/20ml、1g/25ml、1g/30ml等。
35.优选地，步骤(a)中，所述萃取的场强为10-30kv/cm，例如可以是10kv/cm、15kv/cm、20kv/cm、25kv/cm、30kv/cm等，所述萃取的脉冲次数为4-12次，例如可以是4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次等。
36.优选地，步骤(b)中，所述过滤采用200-300目滤膜，例如可以是200目、220目、240目、260目、280目、300目等。
37.优选地，步骤(b)中，所述浓缩的温度为70-90℃，例如可以是70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等。
38.优选地，步骤(c)中，所述浸膏和麦芽糊精的质量比为1:(0.05-0.4)，例如可以是1:0.05、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4等。
39.优选地，步骤(c)中，所述喷雾干燥的进风温度为85-120℃，例如可以是85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃等，出风温度65-90℃，例如可以是65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等。
40.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述具有抗衰老作用的组合物在制备保健食品中的应用。
41.优选地，所述保健食品包括固体饮料和/或液体饮料。
42.第三方面，本发明提供一种固体饮料，所述固体饮料包括如第一方面所述具有抗衰老作用的组合物。
43.优选地，所述固体饮料按重量份数计包括：所述具有抗衰老作用的组合物20-40份、调味剂0-1份、食用香精0-4.5份和麦芽糊精15-30份。
44.在所述固体饮料中，所述具有抗衰老作用的组合物的含量为20-40份，例如可以是20份、22份、24份、26份、28份、30份、32份、34份、36份、38份、40份等。
45.在所述固体饮料中，所述调味剂的含量为0-1份，例如可以是0份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。
46.在所述固体饮料中，所述食用香精的含量为0-4.5份，例如可以是0份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份等。
47.在所述固体饮料中，所述麦芽糊精的含量为15-30份，例如可以是15份、16份、18份、20份、22份、24份、26份、28份、30份等。
48.第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的固体饮料的制备方法，所述固体饮
料的制备方法具体包括以下步骤：
49.(1)将植物提取物和麦芽糊精混合，再与裂褶菌发酵物混合，进行制粒，得到颗粒混合物；
50.(2)将步骤(1)得到的颗粒混合物干燥后，再与胶原蛋白肽、任选的调味剂、任选的食用香精进行总混，得到所述固体饮料。
51.优选地，步骤(1)中，所述制粒在高效湿法制粒机中进行，所述制粒中混合搅拌转速为500-1000r/min，例如可以是500r/min、600r/min、700r/min、800r/min、900r/min、1000r/min等，混合的时间为3-5min，例如可以是3min、3.5min、4min、4.5min、5min等。
52.优选地，步骤(2)中，所述干燥的温度为65-75℃，例如可以是65℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、75℃等。
53.优选地，步骤(2)中，所述总混在三维混合机中进行，且所述总混后还包括采用多列式分装机进行分装。
54.第五方面，本发明提供一种液体饮料，所述液体饮料包括如第一方面所述具有抗衰老作用的组合物。
55.优选地，所述液体饮料按重量份数计包括：所述具有抗衰老作用的组合物10-30份、水果浓缩汁6-15份、食用香精0.01-0.5份、调味剂0.01-1份和水20-40份。
56.在所述液体饮料中，所述具有抗衰老作用的组合物的含量为10-30份，例如可以是10份、12份、14份、16份、18份、20份、22份、24份、26份、28份、30份等。
57.在所述液体饮料中，水果浓缩汁的含量为6-15份，例如可以是6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份等。
58.在所述液体饮料中，食用香精的含量为0.01-0.5份，例如可以是0.01份、0.05份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。
59.在所述液体饮料中，调味剂的含量为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.05份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.8份、1份等。
60.在所述液体饮料中，水的含量为20-40份，例如可以是20份、22份、24份、26份、28份、30份、32份、34份、36份、38份、40份等。
61.第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的液体饮料的制备方法，所述液体饮料的制备方法具体包括以下步骤：
62.(i)将所述具有抗衰老作用的组合物、水果浓缩汁、食用香精、调味剂和水混合后，过筛网，得到料体；
63.(ii)将步骤(i)得到的料体灭菌后，灌装，得到所述液体饮料。
64.优选地，步骤(i)中，所述混合的温度为65-75℃，例如可以是65℃、66℃、68℃、70℃、72℃、75℃等，时间为10-20min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
65.优选地，步骤(i)中，所述筛网的孔径为200-300目，例如可以是200目、220目、240目、260目、280目、300目等。
66.优选地，步骤(ii)中，所述灭菌采用超高温瞬时灭菌uht技术进行；
67.优选地，步骤(ii)中，所述灌装采用的包装瓶需采用负离子清洗技术清洗；所述灌装采用全自动灌装机进行。
68.本产品制备饮料采用uht灭菌，不同于常规的加热灭菌，可以保证原料的主要活性成分，并且能够保证产品在货架期内原汁原味的口感。
69.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
70.(1)本发明提供了裂褶菌发酵物新的应用，使用拥有专利技术的发酵工艺制备得到裂褶菌发酵物，将其应用在口服美容产品中。此组合物有明显的抗衰作用；
71.(2)本发明首次研究了含裂褶菌发酵物组合物的对衰老皮肤作用的机制，发现其能够提升皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量，提高小鼠机体抗氧化酶活力，对炎性细胞因子分泌有抑制作用。具有明显的协同增效作用。
具体实施方式
72.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
73.以下各实施例和对比例各组分来源如下所示：
[0074][0075][0076]
制备例1
[0077]
本制备例提供一种裂褶菌发酵物，所述裂褶菌发酵物由以下制备方法得到：
[0078]
(a)按照以下质量百分比制备裂褶菌培养基：5g/l的葛根粉末、0.3％酵母浸膏、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、3％葡萄糖以及余量的水。
[0079]
(b)将10％裂褶菌(v/v，裂褶菌种子液/接入种子液后培养基总体积)接入上述培养基中，于28℃，150r/min条件下进行发酵。发酵120h后，将发酵产物进行离心处理，除去菌体及葛根粉末，得到发酵产物。
[0080]
制备例2
[0081]
本制备例提供一种橄榄提取物，所述橄榄提取物由以下制备方法制备得到：
[0082]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对橄榄原料进行萃取，得到橄榄提取液；其中，橄榄原料的质量和水的体积比为1g:20ml，萃取的场强为20kv/cm，脉冲次数为8次；
[0083]
(b)将步骤(a)得到的橄榄提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用200目滤膜，浓缩的温度为80℃；
[0084]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述橄榄提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.2，喷雾干燥的进风温度为100℃，出风温度70℃。
[0085]
制备例3
[0086]
本制备例提供一种刺梨提取物，所述刺梨提取物由以下制备方法制备得到：
[0087]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对刺梨原料进行萃取，得到刺梨提取液；其中，刺梨原料的质量和水的体积比为1g:10ml，萃取的场强为15kv/cm，脉冲次数为6次；
[0088]
(b)将步骤(a)得到的刺梨提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用300目滤膜，浓缩的温度为75℃；
[0089]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述刺梨提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.1，喷雾干燥的进风温度为90℃，出风温度70℃。
[0090]
制备例4
[0091]
本制备例提供一种余甘子提取物，所述余甘子提取物由以下制备方法制备得到：
[0092]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对余甘子原料进行萃取，得到余甘子提取液；其中，余甘子原料的质量和水的体积比为1g:30ml，萃取的场强为30kv/cm，脉冲次数为10次；
[0093]
(b)将步骤(a)得到的余甘子提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用300目滤膜，浓缩的温度为90℃；
[0094]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述余甘子提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.3，喷雾干燥的进风温度为120℃，出风温度90℃。
[0095]
制备例5
[0096]
本制备例提供一种蓝莓提取物，所述蓝莓提取物由以下制备方法制备得到：
[0097]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对蓝莓原料进行萃取，得到蓝莓提取液；其中，蓝莓原料的质量和水的体积比为1g:20ml，萃取的场强为20kv/cm，脉冲次数为12次；
[0098]
(b)将步骤(a)得到的蓝莓提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用200目滤膜，浓缩的温度为80℃；
[0099]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述蓝莓提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.2，喷雾干燥的进风温度为100℃，出风温度70℃。
[0100]
制备例6
[0101]
本制备例提供一种蔓越莓提取物，所述蔓越莓提取物由以下制备方法制备得到：
[0102]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对蔓越莓原料进行萃取，得到蔓越莓提取液；其中，蔓越莓原料的质量和水的体积比为1g:20ml，萃取的场强为18kv/cm，脉冲次数为10次；
[0103]
(b)将步骤(a)得到的蔓越莓提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用200目滤膜，浓缩的温度为80℃；
[0104]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述蔓越莓提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.2，喷雾干燥的进风温度为100℃，出风温度70℃。
[0105]
制备例7
[0106]
本制备例提供一种黑果腺肋花楸提取物，所述黑果腺肋花楸提取物由以下制备方法制备得到：
[0107]
(a)通过pef萃取法用水作为溶剂对黑果腺肋花楸原料进行萃取，得到黑果腺肋花楸提取液；其中，黑果腺肋花楸原料的质量和水的体积比为1g:15ml，萃取的场强为25kv/cm，脉冲次数为6次；
[0108]
(b)将步骤(a)得到的黑果腺肋花楸提取液过滤、浓缩，得到浸膏；其中，过滤采用300目滤膜，浓缩的温度为80℃；
[0109]
(c)将步骤(b)得到的浸膏和麦芽糊精混合后，进行喷雾干燥，得到所述黑果腺肋花楸提取物；其中，浸膏和麦芽糊精的质量比为1:0.1，喷雾干燥的进风温度为90℃，出风温度70℃。
[0110]
实施例1
[0111]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物30份、制备例2提供的橄榄提取物5份和胶原蛋白肽10份。
[0112]
实施例2
[0113]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物25份、制备例3提供的刺梨提取物8份和胶原蛋白肽12份。
[0114]
实施例3
[0115]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物30份、制备例4提供的蓝莓提取物5份和胶原蛋白肽10份。
[0116]
实施例4
[0117]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物32份、制备例5提供的蓝莓提取物3份和胶原蛋白肽7份。
[0118]
实施例5
[0119]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物40份、制备例6提供的蔓越莓提取物3份和胶原蛋白肽7份。
[0120]
实施例6
[0121]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，所述具有抗衰老作用的组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物20份、制备例7提供的黑果腺肋花楸提取物10份和胶原蛋白肽16份。
[0122]
实施例7
[0123]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的裂褶菌发酵物替换为cn107320541a中实施例1提供的裂褶菌发酵液。
[0124]
实施例8
[0125]
本实施例提供一种具有抗衰老作用的组合物，与实施例1的区别仅在于，将制备例2提供的橄榄提取物替换为市售的橄榄提取物(厂家：超邦生物，货号：cb-2021091)。
[0126]
对比例1
[0127]
本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物33份和胶原蛋白肽12份。
[0128]
对比例2
[0129]
本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：制备例1提供的裂褶菌发酵物35份、制备例2提供的橄榄提取物10份。
[0130]
对比例3
[0131]
本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：制备例2提供的橄榄提取物20份和胶原蛋白肽25份。
[0132]
试验例1
[0133]
清除自由基的能力
[0134]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0135]
测试方法：
[0136]
1、对超氧阴离子自由基清除能力评价
[0137]
取0.05mol/lph＝8.2的tris-hcl缓冲液4.5ml，于25℃水浴锅中预热20min。再加入1ml试样和0.4ml 25mmol/l的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/l的hcl 1.0ml终止反应。以tris-hcl缓冲液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1ml试样的溶剂来替代样品。
[0138]
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(a2/a1)]
×
100％；式中a1为空白对照的吸光度值；a2为样品的吸光度值。
[0139]
2、对羟自由基的清除能力评价
[0140]
在25ml比色管中依次加入2mmol/l feso
4 3ml，1mmol/l h2o
2 3ml，摇匀，接着加入6mmol/l水杨酸3ml，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。下式为待测液对羟自由基(
·
oh)的清除率：
[0141]
羟自由基清除率(％)＝[a
1-a
2-(a
1-a3)]/a1×
100％；式中a1为未加药品前反应体系的吸光度值；a2为样品清除
·
oh后体系的吸光度值；a3为空白对照清除
·
oh后体系的吸光度值；
[0142]
3、对dpph自由基的清除能力评价
[0143]
试验参照larrauri ja中规定的方法，配制20mmol/l的dpph溶液；受试样品溶液：采用超纯水稀释实施例1-10提供的裂褶多糖组合物和对比例1-5提供的组合物，得到质量浓度为0.1％的溶液。取受试样品溶液2.0ml及20mmol/l的dpph溶液2.0ml于试管之中，混匀后反应30min，于517nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，根据吸光度值计算dpph抑制率。
[0144]
dpph自由基抑制率(％)＝[1-(a
1-a2)/a3]
×
100％；其中，a1为2.0ml的dpph溶液与2.0ml受试样品溶液的吸光度，a2为2.0ml受试样品溶液与2.0ml无水乙醇的吸光度，a3为2.0ml的dpph溶液与2.0ml无水乙醇的吸光度，平行测试三次取平均值；
[0145]
具体测试结果如表1所示：
[0146]
表1
[0147][0148]
由表1测试数据可知，本发明所述具有抗衰老作用的组合物具有很好的抗氧化和清除dpph自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在60％以上，对羟自由基清除率在60％以上，对于dpph自由基抑制率在80％以上。
[0149]
由实施例1和对比例1-3的对比可知，本发明所述具有抗衰老作用的组合物中三种组分相互配合，具有协同增效的作用，能进一步提高所述组合物对于dpph自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
[0150]
试验例2
[0151]
羟脯氨酸的检测
[0152]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0153]
测试方法：
[0154]
1、准备人的皮肤细胞
[0155]
取正常人的真皮成纤维细胞作为原代细胞，于75cm2培养瓶中(含有生长因子的培养基2ml)，37℃、co2浓度为5％的条件下培养细胞至80％浓度。进行传代，传代细胞175cm2方瓶中继续培养细胞至80％浓度。
[0156]
2、制备待测样品
[0157]
用含有10％胎牛血清的dmem培养液培养上一步培养得到的人真皮成纤维细胞，37℃，5％co2培养24小时，待细胞接近融合，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％edta的消化液消化后按1:2传代，选取第四代细胞；
[0158]
用含有10％胎牛血清的dmem培养液将细胞稀释至密度为105个细胞/ml，再接种到12孔板中，接种量为2
×
105个细胞/孔，培养至细胞接近80％融合后，用生理盐水洗板3遍，
每孔内分别加入待测样品(上述样品0.1ml 生理盐水0.2ml)和对照组样品(0.3ml生理盐水)，在37℃，5％co2条件下培养一天，之后收集待测样品和对照组样品的培养上清液备用。
[0159]
3、测定羟脯氨酸含量
[0160]
依照人羟脯氨酸酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，进行待测样品和对照组样品的培养上清液的羟脯氨酸含量测定：
[0161]
(1)绘制羟脯氨酸标准曲线，配制6个羟脯氨酸标准品溶液，浓度依次为：0μg/ml，3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml，24μg/ml，48μg/ml，用酶标仪测试其在450nm波长下的od值；
[0162]
(2)根据羟脯氨酸标准品的吸光度测试结果，以吸光度为纵轴，以羟脯氨酸浓度为横轴绘制羟脯氨酸的标准曲线；
[0163]
(3)用试剂盒中的溶剂将待测样品和对照组样品的培养上清液稀释5倍，依照人羟脯氨酸酶联免疫分析试剂盒说明书，测定稀释5倍后的待测样品和对照组样品的培养上清液在450nm波长下吸光度，据绘制的羟脯氨酸浓度标准曲线计算待测样品和对照组样品的培养上清液中的成纤维细胞产生的羟脯氨酸的含量；
[0164]
具体测试结果如表2所示：
[0165]
表2
[0166][0167][0168]
由表2测试数据可知，添加本发明所述具有抗衰老作用的组合物后羟脯氨酸的含量明显增加，羟脯氨酸的含量为34μg/ml以上，与对照组相比提升率达到25％以上。说明本
发明所述具有抗衰老作用的组合物可以使皮肤的成纤维细胞分泌的胶原蛋白的量显著提高。
[0169]
试验例3
[0170]
透明质酸的检测
[0171]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0172]
测试方法：
[0173]
依照人透明质酸酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，对试验例2中的各待测样品和对照组样品的培养上清液的羟脯氨酸含量测定：
[0174]
1、绘制透明质酸标准曲线；配制6个透明质酸标准品溶液，浓度依次为：0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml，利用酶标仪450nm下测试其od值，
[0175]
2、根据透明质酸标准品测试结果，以吸光度为纵轴，以透明质酸浓度横轴绘制透明质酸的标准曲线；
[0176]
(3)用试剂盒中的溶剂将待测样品和对照组样品的培养上清液稀释5倍，依照人透明质酸酶联免疫分析试剂盒说明书，其od值，再计算透明质酸含量；
[0177]
具体测试结果如表3所示：
[0178]
表3
[0179][0180]
由表2测试数据可知，添加本发明所述具有抗衰老作用的组合物后透明质酸的含
量明显增加，透明质酸的含量为185μg/ml以上，与对照组相比提升率达到40％以上。说明本发明所述具有抗衰老作用的组合物能够使皮肤成纤维细胞分泌的透明质酸的量有显著提高，提高皮肤的锁水能力，可以保持皮肤湿润。
[0181]
试验例4
[0182]
对小鼠血清抗氧化酶活力的影响
[0183]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0184]
测试方法：
[0185]
1、实验动物
[0186]
12月老龄spf级健康小鼠，雌雄各半。
[0187]
2、实验方法
[0188]
将12月老龄spf级健康小鼠随机分为12组，每组10只；其中，11组分别除正常喂养常规饲料外，另分别每日喂食2.0g/kg的对应组的实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；其中，1组作为对照组，正常喂养常规饲料；各组连续喂养30天后处死，然后测小鼠体内血清丙二醛(mda)、还原性谷胱甘肽含量(gsh)、抗氧化酶活力。
[0189]
3、统计学处理
[0190]
采用spss11.0统计软件进行统计处理，计量资料数据以表示，用多个样本均数比较的单因素方差分析，计数资料采用x2检验。
[0191]
4、实验结果
[0192]
脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。
[0193]
具体测试结果如表4所示：
[0194]
表4
[0195]
[0196][0197]
由表4测试数据可知，服用本发明所述具有抗衰老作用的组合物的小鼠中血清中mda水平均显著降低，抗氧化物质gsh含量、sod活性、gsh-px活性均显著升高，其中，mda含量达到4.5mmol/l以下，gsh含量达到5.6mmol/l以上，sod含量达到280μ/ml以上，gsh-px含量达到200μ/ml以上。表明本发明的具有抗衰老作用的组合物具有很好的抗氧化、保健功效。
[0198]
试验例5
[0199]
炎性细胞因子分泌有抑制
[0200]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0201]
测试原理：“促发炎细胞因子(proinflammatory cytokine)”是指一系列可以促进炎症的细胞因子的总称，促发炎细胞因子在急性发炎反应中扮演重要的角色，可增加血管通透性，因而导致红、肿、热、痛等发炎反应。比较常见的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,tnf-α)、介白素6(interleukin-6,il-6)和介白素12(interleukin-12,il-12)等，因此抑制这些细胞因子也可以有助于减少某些疾病的发炎症状；
[0202]
测试方法：
[0203]
1、试验材料：lps购自sigma公司；fbs购自美国paa公司；dmem高糖培养基；elisa试剂盒购自美国的biolegnd公司。
[0204]
2、动物：c57bl/6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
[0205]
3、实验上将raw264.7细胞以3
×
105cells/well的浓度接种在96孔微量盘中，在37℃、5％co2培养箱中培养。培养24h后，分别添加1μg/ml的lps与样品，再在37℃、5％co2培养箱中培养24h小时，其中样品分别为实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物(样品浓度为50μg/ml)。
[0206]
培养后将培养液吸出使用elisa试剂盒分析tnf-α、il-6和il-12等促发炎细胞因子的表现量，再依下列公式计算样品的促发炎细胞因子生成的抑制率：
[0207]
促发炎细胞因子生成的抑制率(％)＝[1-c1/c0]
×
100％；
[0208]
其中，c0代表仅添加诱导剂lps时促发炎细胞因子生成的浓度，c1代表同时添加诱导剂lps与样品时促发炎细胞因子生成的浓度；
[0209]
具体测试结果如表5所示：
[0210]
表5
[0211][0212][0213]
由表5测试数据可知，lps刺激bmdm细胞活化，表现为分泌大量炎性细胞因子tnf-α、il-6、il-12。而本发明所述具有抗衰老作用的组合物均能显著抑制tnf-α、il-6、il-12分泌，对于tnf-α抑制率达到20％以上，对于il-6抑制率达到50％以上，对于il-12抑制率达到30％以上。
[0214]
应用例1
[0215]
本应用例提供一种固体饮料，所述固体饮料按重量份数计包括如下组分：
[0216]
名称配比份数实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物30调味剂0.5食用香精1麦芽糊精20
[0217]
所述固体饮料的制备方法包括如下步骤：
[0218]
(1)将橄榄提取物、麦芽糊精置于高效湿法制粒机中进行湿法混合6min，控制混合搅拌转速为150r/min；再投入裂褶菌发酵物混合5min进行制粒，控制制粒浆转速为800r/min；
[0219]
(2)将造好的颗粒物料通过流化床干燥得到颗粒混合物，控制干燥温度为70℃；再将颗粒混合物、胶原蛋白粉、甜味剂、食用香精投入三维混合机中进行总混，得混合物；最后将总混粉用多列式分装机进行分装，控制产品净含量。
[0220]
应用例2-8
[0221]
本应用例提供不同固体饮料，与应用例1的区别仅在于，将实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物替换为对应的实施例2-8提供的具有抗衰老作用的组合物。
[0222]
对比应用例1-3
[0223]
对比应用例提供不同固体饮料，与应用例1的区别仅在于，将实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物替换为对应的对比例1-3提供的组合物。
[0224]
应用例9
[0225]
本应用例提供一种液体饮料，所述液体饮料按重量份数计包括如下组分：
[0226]
名称配比份数实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物20水果浓缩汁10食用香精0.2调味剂0.1纯净水30
[0227]
所述液体饮料的制备方法包括如下步骤：
[0228]
(i)配制：将实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物、水果浓缩汁、食用香精和调味剂投入配制罐中，加入配方量的纯净水控温70℃搅拌15min至混合均匀，然后过筛网至储存罐中；
[0229]
(ii)配制后料体采用超高温瞬时灭菌uht技术进行灭菌处理；内包装瓶采用负离子清洗技术进行清洗；采用全自动灌装机将液体进行分装。
[0230]
应用例10-16
[0231]
本应用例提供不同液体饮料，与应用例9的区别仅在于，将实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物替换为对应的实施例2-8提供的具有抗衰老作用的组合物。
[0232]
对比应用例4-6
[0233]
对比应用例提供不同液体饮料，与应用例1的区别仅在于，将实施例1提供的具有抗衰老作用的组合物替换为对应的对比例1-3提供的组合物。
[0234]
试验例6
[0235]
抗衰老性能测试
[0236]
测试样品：实施例1-8提供具有抗衰老作用的组合物以及对比例1-3提供的组合物；
[0237]
测试方法(斑马鱼sa-β-gal染色实验)：
[0238]
将试验组或空白组斑马鱼，sa-β-gal染色后，用显微镜对其捕获采集图像，所有的图像均统一采用相同拍摄参数包括，体位、放大倍数、光强度、吸收度和曝光设置(每个样品分别5ms、15ms、30ms曝光，拍摄三张图片)等，斑马鱼sa-β-gal染色效果的采集图像，显微成像表明，试验组分别用不同样品处理后，与空白对照组相比，斑马鱼sa-β-gal染色阳性率肉眼可见降低。
[0239]
以确保可比性，然后采用图像分析软image pro plus，分别获取侧位鱼体面积值(s)和染色积分光密度值(iod)，计算二者比值iod/s；
[0240]
具体测试结果如表6所示：
[0241]
表6
[0242][0243][0244]
由表6测试数据可知，试验组与空白组相比，sa-β-gal染色阳性率低，差异具有统计学意义(p《0.05)。说明在适当比例浓度下，本发明所述具有抗衰老作用的组合物可以使斑马鱼sa-β-gal染色的染色阳性率降低，所述具有抗衰老作用的组合物可以有效干预斑马鱼胚胎发育细胞的衰老，延缓斑马鱼衰老进程，由此证明所述具有抗衰老作用的组合物具抗衰老作用。
[0245]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具有抗衰老作用的组合物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。