一种发酵型素肉香精的制备方法

1.本发明属于香精开发领域，尤其是一种不添加任何动物性成分且满足健康需求的素肉香精制备方法。


背景技术：

2.素肉香精是肉味香精的一种，指一般不添加任何动物源或动物性成分，仅通过酵母抽提物、水解蛋白等非动物源物质在美拉德反应的基础上研发而成的香精。此类产品最大的优势是不添加任何动物源物质，且具有肉的风味，可满足健康饮食的需求。肉味香精生产的主要原理是基于对肉类物质在加热过程中产生风味物质的反应的模拟，模拟系统与实际产香系统近似程度越高，则反应产生的肉香味越逼真。利用前体物质制备肉味香精的基础是糖类和含硫氨基酸经加热发生的反应，主要包括脂肪酸的氧化、分解、糖和氨基酸的热降解、羰氨反应及各种生成物的二次或三次反应等，它们形成了数百种具有肉味香气的化合物成分。随着人们生活水平的提高，对食品的要求越来越高，各种方便食品、肉味制品、调味品在中国的发展很快，运用现代食品高新技术来开发新型热加工肉味风味料具有非常广阔的市场前景。
3.蛋白质水解技术制备肉味香精的原理是：通过生物或化学方法，使动植物中的蛋白质发生降解，进而获得各种肽、氨基酸及核苷酸等水解产物。利用水解产物中的肽、氨基酸、核苷酸等作为美拉德反应的前体物。目前主要的水解蛋白技术主要包括：酸法水解，酶法水解和发酵法水解。酸法水解水解速度快，成本低，但专一性较差，水解程度难以控制，易造成环境污染，产品颜色深，杂质多等。酶法水解反应速率快，产物更加安全和营养，水解程度易控制，工艺简单无污染且利于工业生产，但水解不彻底，产物有时带有苦味，做出的香精常香气不足。发酵法水解蛋白质水解程度深和氨基酸含量高且香精香味浓郁，留香持久，生产成本低，也是目前研究较为广泛的一种蛋白水解方式。
4.酵母中不但含有丰富的蛋白质、核酸、维生素和矿物质等营养成分，且氨基酸组成合理。我国是啤酒生产大国，每年产生的啤酒废酵母约5万吨。这些啤酒废酵母除了部分经粗加工制成饲料等低附加值产品外，大部分直接排弃，不但浪费了资源，还造成了环境的污染。开发酵母蛋白来源的肉味香精则是对废酵母的一种高附加值的资源利用。当下相关研究中，从酵母蛋白来源生产肉味香精主要采用的是酶法降解蛋白，且在美拉德反应中，常加入动物性油脂来增加肉味及其饱和度。此类做法生产成本较高，且不适用于素食和“三高”人群的饮食要求。“回归自然，寻求绿色食品”已经成为食品工业的潮流，这就需要更安全，更可靠，更天然的肉味香精来满足人们的需求，而目前还没有酵母蛋白来源生产的肉味浓郁的素肉香精。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种制备发酵型肉味香精的方法。利用本发明的原料，设定的步骤及工艺条件，使得到的产品具有特殊的肉味香气。
6.本发明肉味香精包含如下步骤：
7.1.菌株活化；
8.2.发酵培养基配置，灭菌；
9.3.发酵接种，发酵液煮沸处理；
10.4.恒温酶解；
11.5.灭酶；
12.6.离心过滤，去除残渣；
13.7.添加热反应配料，热反应，得到具有肉味的香精。
14.本发明提供了一种发酵型素肉香精的制备方法，包括酶解过程，巨大芽孢杆菌菌体参与所述酶解过程。
15.优选的是，所述发酵型素肉香精为酵母蛋白来源的素肉香精。
16.上述任一项优选的是，所述发酵型素肉香精的原料包括酵母或酵母提取物，进一步优选的是，所述原料不包括植物蛋白、动物蛋白或动物脂肪。
17.上述任一项优选的是，所述制备方法包括以下步骤：
18.步骤1：活化巨大芽孢杆菌，准备发酵培养基；
19.步骤2：将活化的巨大芽孢杆菌接种于步骤1所述的发酵培养基，发酵获得发酵液；
20.步骤3：将步骤2得到的发酵液在沸水中煮；
21.步骤4：步骤3得到的发酵液进行恒温酶解；
22.步骤5：将酶解后的发酵液进行灭酶处理；
23.步骤6：将步骤5冷却后的酶解液离心取上清，待用；
24.步骤7：在步骤6得到的酶解液上清中加入反应原料，所述反应原料包括还原糖、l-半胱氨酸、维生素b1、食盐、精氨酸、脯氨酸和菜籽油，混匀反应。
25.上述任一项优选的是，步骤1中所述发酵培养基4％(w/v)食品酵母粉，0.2％(w/v)氯化钙，1％(w/v)果葡糖浆。
26.上述任一项优选的是，步骤4恒温酶解的过程为：在步骤3的基础上，待煮过的发酵液冷却至室温后，调节发酵液ph为5.6，加入2925u的风味蛋白酶，在46.5℃，90r/min的水浴摇床中保持5h后，冷却至室温。
27.上述任一项优选的是，步骤5中，将酶解后的发酵液于90℃下保持15min进行灭酶处理。
28.上述任一项优选的是，步骤7中，所述反应原料引入植物油，用于引入非动物源油脂来平衡反应后的香气。进一步优选的植物油为菜籽油。所述菜籽油优选为市售压榨菜籽油。
29.上述任一项优选的是，步骤7中，所述反应原料按如下体积加入：
30.优选的添加5％(w/v)的还原糖；
31.优选的添加0.5-1％(w/v)的l-半胱氨酸，进一步优选为0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％(w/v)的l-半胱氨酸；
32.优选的添加0.2-0.4％(w/v)的维生素b1，进一步优选为0.2％、0.3％、0.4％(w/v)的维生素b1；
33.优选的添加0.2-0.6％(w/v)的食盐，进一步优选为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、
0.6％(w/v)的食盐；
34.优选的添加0.2-0.6％(w/v)的精氨酸，进一步优选为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％(w/v)的精氨酸；
35.优选的添加0-0.2％(w/v)的脯氨酸，进一步优选为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％(w/v)的脯氨酸；
36.优选的田间2-3％(v/v)的菜籽油，进一步优选为，2％、2.3％、2.5％、2.7％、3％(v/v)的菜籽油。
37.上述任一项优选的是，所述还原糖包括木糖。
38.上述任一项优选的是，所述还原糖还包括葡萄糖，葡萄糖：木糖＝0～2:3，葡萄糖与木糖的质量比进一步优选为0、0.5：3、1：3、1.5：3或2：3。
39.上述任一项优选的是，步骤7中，反应条件为110-120℃下反应50-90min，反应温度进一步优选为110、115、120℃，反应时间进一步优选为50、60、70、80、90min。
40.所述酵母粉为实验室常用的食品酵母粉，所述菌株为保藏于天津北洋百川生物技术有限公司的巨大芽孢杆菌。使用的酶为澜翊康生物科技(北京)提供的风味蛋白酶(实测酶活，4136u/ml)，添加的热反应配料有还原糖，氨基酸，维生素和食用油等食品添加剂。本发明所使用的原料和试剂可通过商业购买的方式为公众获得。
41.在本发明一项优选的实施方式中，包括以下步骤：
42.1.从斜面中取一环巨大芽孢杆菌，接种于ph＝7.2的已灭菌lb培养基中，在37℃，200r/min条件下培养24h，进行菌株活化。发酵培养基配方：4％(w/v)食品酵母粉，0.2％(w/v)氯化钙，1％(w/v)果葡糖浆，果葡糖浆和培养基其他组分分开灭菌，灭菌条件：121℃灭菌20min。于接种前将单独灭菌的果葡糖浆加入培养基。
43.2.在步骤1的基础上，将活化好的巨大芽孢杆菌按5％(v/v)接种于已混匀的发酵培养基中，37℃，200r/min发酵12h，所得发酵液备用。
44.3.在步骤2的基础上，将发酵液于沸水中煮10min。以使巨大芽孢杆菌菌体破裂死亡，使得巨大芽孢杆菌菌体蛋白在后续的酶解过程中也参与降解。
45.4.在步骤3的基础上，待煮过的发酵液冷却至室温后，调节发酵液ph为5.6，加入2925u的风味蛋白酶，在46.5℃，90r/min的水浴摇床中保持5h后，冷却至室温。
46.5.在步骤4的基础上，将酶解后的发酵液于90℃下保持15min进行灭酶处理。
47.6.在步骤5的基础上，将冷却后的酶解液在5000r/min的条件下离心10min，离心取上清，得到用于美拉德反应的酵母水解液，调节ph至4-6待用。
48.7.在步骤6的基础上，向步骤5所得的酶解液(即步骤6离心上清得到的用于美拉德反应的酵母水解液)按体积加入5％(w/v)的还原糖(木糖或葡萄糖：木糖＝2:3)，0.5-1％(w/v)的l-半胱氨酸，0.2-0.4％(w/v)的维生素b1，0.2-0.6％(w/v)的食盐，0.2-0.6％(w/v)的精氨酸0-0.2％(w/v)的脯氨酸以及2-3％(v/v)的菜籽油，混匀，在110-120℃下反应50-90min，得到具有肉味浓郁的素肉香精。
49.本发明采用食品酵母粉为原料，通过巨大芽孢杆菌发酵后，在发酵液风味良好的前提下，水解度由几乎为零增加到53％，构成酵母蛋白氨基酸组成也发生较大变化，其中人体必需氨基酸和芳香族氨基酸在发酵后组成含量较大提高，酶解后，水解度在发酵基础上进一步提升30％。通过先发酵后酶解的方式不仅节省成本，还克服了单一酶解水解不彻底，
产物带苦味等缺点。本发明的香精为液体香精，具有较好的水溶性，可直接添加使用。如下，表1为本发明提供的方法，食品酵母粉水解氨基酸，发酵液上清游离氨基酸和酶解液上清游离氨基酸占总氨基酸百分表。
50.表1
[0051][0052]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0053]
1.巨大芽孢杆菌能够产多种蛋白酶且活性较强，但当前对于该菌用于发酵降解蛋白的研究较少且无将该菌应用于降解酵母蛋白的研究。本发明采用微生物发酵和酶处理，先后降解酵母蛋白的方式获得美拉德反应水解液，不仅生产成本大大降低，且得到的水解液中人体必需氨基酸占总氨基酸的67.29％，对肉味贡献的氨基酸占总氨基酸的21.19％。食品酵母粉水解度相较于起始，经过发酵和酶处理后，水解度较之前提高83％，且水解液风味良好。
[0054]
2.本发明在美拉德反应原料的选择中，创新性的引入了植物油脂(葵花籽油)，通过顶空固相微萃取，gc-ms分析发现添加油脂后，风味物质数量上较不添加油脂变化不大，但醇类，酸类和酯类物质较不添加油脂含量增多，噻唑，糠醛，吩类及吡嗪等肉类特征物质较不添加油脂含量上相对减少。添加油脂之后，体系风味物质在含量和数量上发生改变，进一步平衡了美拉德反应产物的饱满肉香。
[0055]
3.美拉德反应对反应条件进行优化，最后在酵母水解液ph4-6，110-120℃下反应50-90min的方式进行反应，有效防止丙烯酰胺的生产，生产出风味较佳，健康安全的素肉香精。
[0056]
4.本发明采用食用酵母粉为原料生产素肉香精，为啤酒酵母等食用酵母的高附加值处理提供了一条低成本，操作简便的有效途径。
具体实施方式
[0057]
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
[0058]
实施例1
[0059]
1.从斜面中取一环巨大芽孢杆菌，接种于ph＝7.2的已灭菌lb培养基中，在37℃，200r/min条件下培养24h，进行菌株活化。发酵培养基配方：4％(w/v)食品酵母粉，0.2％(w/v)氯化钙，1％(w/v)果葡糖浆，果葡糖浆和培养基其他组分分开灭菌，灭菌条件：121℃灭菌20min。于接种前将单独灭菌的果葡糖浆加入培养基。
[0060]
2.在步骤1的基础上，将活化好的巨大芽孢杆菌按5％(v/v)接种于已混匀的发酵培养基中，37℃，200r/min发酵12h，所得发酵液备用。
[0061]
3.在步骤2的基础上，将发酵液于沸水中煮10min。以使巨大芽孢杆菌菌体破裂死亡，使得巨大芽孢杆菌菌体蛋白在后续的酶解过程中也参与降解。
[0062]
4.在步骤3的基础上，待煮过的发酵液冷却至室温后，调节发酵液ph为5.6，加入2925u的风味蛋白酶，在46.5℃，90r/min的水浴摇床中保持5h后，冷却至室温。
[0063]
5.在步骤4的基础上，将酶解后的发酵液于90℃下保持15min进行灭酶处理。
[0064]
6.在步骤5的基础上，将冷却后的酶解液在5000r/min的条件下离心10min，离心取上清，得到用于美拉德反应的酵母水解液。
[0065]
7.在步骤6的基础上，向步骤5所得的酶解液按体积加入5％(w/v)的还原糖(葡萄糖：木糖＝2:3)，0.5％(w/v)的l-半胱氨酸，0.2％(w/v)的维生素b1，0.2％(w/v)的食盐，0.2％(w/v)的精氨酸0.2％(w/v)的脯氨酸以及3％(v/v)的菜籽油，混匀，在110℃下反应90min，得到具有肉味浓郁的素肉香精。
[0066]
8.通过顶空固相微萃取，gc-ms分析发现添加油脂后，风味物质数量上较不添加油脂变化不大，但醇类，酸类和酯类物质较不添加油脂含量增多，噻唑，糠醛，吩类及吡嗪等肉类特征物质较不添加油脂含量上相对减少。添加油脂之后，体系风味物质在含量和数量上发生改变，进一步平衡了美拉德反应产物的饱满肉香。如下，表2为本实施例顶空固相微萃取gc-ms风味物质含量表，表3为本实施例不添加油脂顶空固相微萃取gc-ms风味物质含量表。所述顶空固相微萃取是常规的操作，根据现有技术公开的文献进行操作。
[0067]
表2：添加油脂风味成分分析表
[0068]
[0069]
[0070][0071]
表3：不添加油脂风味成分分析表
[0072]
[0073]
[0074][0075]
实施例2
[0076]
1.从斜面中取一环巨大芽孢杆菌，接种于ph＝7.2的已灭菌lb培养基中，在37℃，200r/min条件下培养24h，进行菌株活化。发酵培养基配方：4％(w/v)食品酵母粉，0.2％(w/v)氯化钙，1％(w/v)果葡糖浆，果葡糖浆和培养基其他组分分开灭菌，灭菌条件：121℃灭菌20min。于接种前将单独灭菌的果葡糖浆加入培养基。
[0077]
2.在步骤1的基础上，将活化好的巨大芽孢杆菌按5％(v/v)接种于已混匀的发酵培养基中，37℃，200r/min发酵12h，所得发酵液备用。
[0078]
3.在步骤2的基础上，将发酵液于沸水中煮10min。以使巨大芽孢杆菌菌体破裂死亡，使得巨大芽孢杆菌菌体蛋白在后续的酶解过程中也参与降解。
[0079]
4.在步骤3的基础上，待煮过的发酵液冷却至室温后，调节发酵液ph为5.6，加入2925u的风味蛋白酶，在46.5℃，90r/min的水浴摇床中保持5h后，冷却至室温。
[0080]
5.在步骤4的基础上，将酶解后的发酵液于90℃下保持15min进行灭酶处理。
[0081]
6.在步骤5的基础上，将冷却后的酶解液在5000r/min的条件下离心10min，离心取上清，得到用于美拉德反应的酵母水解液。
[0082]
7.在步骤6的基础上，向步骤5所得的酶解液按体积加入5％(w/v)的木糖，0.5％(w/v)的l-半胱氨酸，0.2％(w/v)的维生素b1，0.2％(w/v)的食盐，0.2％(w/v)的精氨酸以及3％(v/v)的菜籽油，混匀，在120℃下反应50min，得到具有肉味浓郁的素肉香精。
[0083]
实施例3
[0084]
1.从斜面中取一环巨大芽孢杆菌，接种于ph＝7.2的已灭菌lb培养基中，在37℃，200r/min条件下培养24h，进行菌株活化。发酵培养基配方：4％(w/v)食品酵母粉，0.2％(w/v)氯化钙，1％(w/v)果葡糖浆，果葡糖浆和培养基其他组分分开灭菌，灭菌条件：121℃灭菌20min。于接种前将单独灭菌的果葡糖浆加入培养基。
[0085]
2.在步骤1的基础上，将活化好的巨大芽孢杆菌按5％(v/v)接种于已混匀的发酵培养基中，37℃，200r/min发酵12h，所得发酵液备用。
[0086]
3.在步骤2的基础上，将发酵液于沸水中煮10min。以使巨大芽孢杆菌菌体破裂死亡，使得巨大芽孢杆菌菌体蛋白在后续的酶解过程中也参与降解。
[0087]
4.在步骤3的基础上，待煮过的发酵液冷却至室温后，调节发酵液ph为5.6，加入2925u的风味蛋白酶，在46.5℃，90r/min的水浴摇床中保持5h后，冷却至室温。
[0088]
5.在步骤4的基础上，将酶解后的发酵液于90℃下保持15min进行灭酶处理。
[0089]
6.在步骤5的基础上，将冷却后的酶解液在5000r/min的条件下离心10min，离心取上清，得到用于美拉德反应的酵母水解液。
[0090]
7.在步骤6的基础上，向步骤5所得的酶解液(即步骤6所得的美拉德反应的酵母水解液)按体积加入5％(w/v)的还原糖(葡萄糖：木糖＝2:3)，0.5％(w/v)的l-半胱氨酸，0.2％(w/v)的维生素b1，0.2％(w/v)的食盐，0.2％(w/v)的精氨酸以及3％(v/v)的菜籽油，混匀，在120℃下反应50min，得到具有肉味浓郁的素肉香精。