一种水溶性克酮酸染料及其制备方法与应用

一种水溶性克酮酸染料及其制备方法与应用
(一)技术领域
1.本发明属于克酮酸菁染料技术领域，尤其涉及一种水溶性克酮酸菁染料及其制备方法和在肿瘤光声、荧光成像及光动力治疗中的应用。
(二)

背景技术：

2.肿瘤的精准检测、诊断和切除有赖于精准的成像系统，相比较于辐射成像、超声成像、磁共振成像等传统的生物成像技术相比，荧光成像与光声成像在诊断与引导手术切除中因其高灵敏度和高特异性、低成本、无创性和更好的生物安全性等优点展现出巨大的应用潜力。很多荧光材料也已被广泛的应用于荧光成像研究中，但大多数表现为可见光以及近红外一区(nir-i,750-900nm)发射，其在进入生物组织时会被不同程度地吸收和散射而衰减，从而降低成像深度和对比度。近红外二区(nir-ii)由于发射波长(1000-1700nm)更长，生物组织的穿透性更强，探测深度更深、空间分辨率更高等优点而成为生物医学研究的热点方向。目前已有的一些无机材料如稀土下转换纳米颗粒，碳纳米管，量子点等能够实现近红外二区发射，但是它们的发射波长大多位于近红外一区，且重金属生物安全性能差，进入活体后代谢缓慢等缺点限制了它们的应用。相对于无机材料，有机克酮酸类荧光染料相对分子量较小，易于代谢，有更好的生物相容性和稳定性，更容易被修饰，同时也可以实现近红外第二窗口区的发射。
3.光声成像技术作为一种新兴的无损、非侵入性复合成像技术，同时具备了光学成像的高灵敏度和声学成像的高穿透性和分辨率的特点，在生物医学临床诊断，特别是在活体组织结构和功能成像方面具有广泛的应用前景。为了克服光的散射效应，提高光声信噪比，增强光声成像技术的成像质量，除了选择合适的波长区域作为工作区域外，利用外源性光声造影剂是另一种行之有效的方法。使用外源性近红外造影剂，由于发射波长长，能够提高光声成像的穿透深度，提高最大允许辐照能量，降低背景信号，改变局部组织的光学和声学性能，提高成像的对比度和分辨率，从而显著增强光声成像的成像效果。
4.光动力疗法是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术，其过程是在特定波长的激光照射下，使分布于组织的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。
5.因此，本发明试图开发一种在近红外区域具有吸收的水溶性克酮酸菁染料，其能够实现光动力治疗、肿瘤微环境ph响应型荧光成像技术与光声成像技术的结合，不仅可以实现成像技术之间的优势互补，在肿瘤部位酸性环境下荧光和光声响应值增强，为疾病的诊断提供更加丰富的生物学信息，同时实现了诊断与治疗的目的，并且避免了多次注射不同造影剂所带来的风险与负担，具有广阔的应用前景。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是首次提供一种水溶性具有光动力效果的ph响应型克酮酸菁染料及
其制备方法与在制备光学成像试剂或治疗肿瘤药物中的应用，除了能在肿瘤酸性微环境下光声、荧光成像效果得到增强，在近红外光的激发下显示出肿瘤组织边界，为肿瘤的完整切除提供一种较为客观的参考外，还首次报道克酮酸菁类染料可用于肿瘤的光动力治疗，有效地使肿瘤组织坏死。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种式(i)所示水溶性克酮酸菁染料：
[0009][0010]
本发明还提供一种所述克酮酸菁染料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]
(1)式b所示中间体的合成：
[0012][0013]
将化合物a和n-甲基哌嗪加入甲苯中混匀后，加热到110-120℃回流反应8h，反应液旋转蒸发去除溶剂后，获得油状浓缩物；油状浓缩物用石油醚溶解后作为上样液进行硅胶层析柱，以体积比4:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，以1-5ml/min(优选1ml/min)的洗脱速度洗脱5-7个(优选5个)柱体积去除未反应化合物a；再用体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱液，以1-5ml/min(优选3ml/min)的洗脱速度洗脱8-9个(优选9个)柱体积，以体积比为4:1石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.1-0.3的组分，旋转蒸干，得中间体b；
[0014]
(2)式(i)所示目标产物的合成：
[0015][0016]
将中间体b与克酮酸(4,5-二羟基-4-环戊烯-1,2,3-三酮)溶于正丁醇和甲苯中，加热到110-120℃进行回流反应过夜，反应液旋转蒸发至干去除溶剂后，所得浓缩物用流动相溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯(色谱柱型号为cosmosil 5c
18-ms-ii 20mm*250mm)，以体积比1:9的超纯水：甲醇的混合溶剂为流动相进行洗脱，洗脱速度为2-6ml/min(优选4ml/min)，检测波长为700nm，柱温为30℃，收集保留时间为14min时的洗脱液，旋转蒸干甲醇，冻干(优选4℃)后，得到式(i)所示克酮酸菁染料，记为sr780。
[0017]
进一步，步骤(1)中化合物a与n-甲基哌嗪质量比为1:1-5，优选1:1.3；所述甲苯体积用量以化合物a质量计为20-50ml/g，优选32ml/g。
[0018]
进一步，步骤(2)中，中间体b与克酮酸质量比为1:0.3-0.5，优选1:0.32；所述正丁醇体积用量以中间体b质量计为100-200ml/g，优选148ml/g；所述正丁醇与甲苯体积比1：1。
[0019]
本发明还提供一种式(i)所示克酮酸菁染料在制备肿瘤成像试剂中的应用，用于肿瘤检测的光声成像或荧光成像。
[0020]
本发明还提供一种式(i)所示克酮酸菁染料在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、口腔癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、结直肠癌细胞、膀胱癌细胞和前列腺癌细胞等实体瘤细胞。更具体为肝癌细胞hepg-2、肝癌细胞7404、乳腺癌细胞4t1。
[0021]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0022]
本发明提供一种结构对称的克酮酸菁染料sr780，通过引入给电子基团扩大体系的π共轭程度，并具有供体-受体-供体结构，形成稳定两性离子的刚性共振平面结构，有效调控菁染料的吸收和发射波长，将其红移到更长波长的近红外区域(750-1000nm)。该化合物制备方法简单，反应位点明显，易于控制反应进程。
[0023]
本发明提供的克酮酸菁染料sr780，在近红外区具有良好的吸收性能，能用于肿瘤检测的光声成像。
[0024]
本发明提供的克酮酸菁染料sr780，具有良好的荧光量子产率为2.058％(以碳纳米管为对照，808nm激发，用900lp滤光片所得)，能用于肿瘤检测的荧光成像。
[0025]
本发明提供的克酮酸菁染料sr780，具有良好的ros产生效率，能用于肿瘤治疗的光动力治疗。
(四)附图说明
[0026]
图1为实施例2制得的克酮酸菁染料sr780的核磁氢谱。
[0027]
图2为实施例2制得的克酮酸菁染料sr780的核磁碳谱。
[0028]
图3为实施例3中克酮酸菁染料sr780的紫外可见吸收光谱。
[0029]
图4为实施例3中克酮酸菁染料sr780的荧光发射图谱。
[0030]
图5为实施例3中克酮酸菁染料sr780的不同ph条件下荧光发射图谱。
[0031]
图6为实施例3中克酮酸菁染料sr780的光声信号图谱。
[0032]
图7为实施例4中克酮酸菁染料sr780激光照射不同时间后的紫外可见吸收光谱。
[0033]
图8为实施例4中市售染料icg激光照射不同时间后的紫外可见吸收光谱。
[0034]
图9为实施例4中市售染料ir780激光照射不同时间后的紫外可见吸收光谱。
[0035]
图10为实施例5中克酮酸菁染料sr780在不同照射时间下的荧光发射图谱。
[0036]
图11为实施例5中克酮酸菁染料sr780的ros产率图。
[0037]
图12为实施例5中克酮酸染料1的ros产率效果图。
[0038]
图13为实施例5中市售染料icg的ros产率效果图。
[0039]
图14为实施例6中克酮酸菁染料浓度对肝癌细胞hepg-2存活率影响柱形图。
[0040]
图15为实施例6中市售染料icg浓度对肝癌细胞hepg-2存活率影响柱形图。
(五)具体实施方式
[0041]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0042]
本发明所述室温为25-30℃。
[0043]
实施例1、中间体b的合成
[0044][0045]
将化合物a(0.263g)和n-甲基哌嗪(0.341g)投入到含有8ml甲苯的圆底烧瓶中，加热到110-120℃进行回流反应8h，反应液旋转蒸发去除溶剂后，获得油状浓缩物。将油状浓缩物加入10ml的石油醚中溶解，作为硅胶柱层析的上样液。
[0046]
将100～200目柱层析硅胶50g和50ml石油醚充填层析柱(3cm
×
30cm)，释放石油醚后，10ml上样液沿管壁缓慢上样，以体积比为4:1的石油醚：乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，以1ml/min的洗脱速度洗脱6个柱体积去除化合物a后，改用体积比为1:1的石油醚：乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，以3ml/min的洗脱速度洗脱9个柱体积，以体积比为4:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.1-0.3的组分，真空旋转蒸干混合溶剂后，得到化合物b 0.298g。
[0047]
化合物b的核磁数据：1h nmr(400mhz,dmso)δ6.80(t,j＝4.0hz,1h),6.63(d,j＝8.0hz,1h),7.74(d,j＝4hz,1h),3.20(t,j＝4hz,4h),2.58(t,j＝4hz,4h),2.36(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ159.24,126.68,112.29,105.31,54.39,51.37,46.11.
[0048]
实施例2、克酮酸菁染料sr780的合成。
[0049][0050]
将实施例1方法制备的中间体b(0.1g)与克酮酸(0.031g)投入到含有正丁醇(15ml)和甲苯(15ml)的圆底烧瓶中，110℃加热回流反应过夜，反应液旋转蒸发至干去除溶剂后，得到固体浓缩物。将固体浓缩物用20ml体积比1:9的超纯水：甲醇混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱仪进行分离提纯，根据色谱峰信号，在保留时间为14min时收集得到洗脱液，旋转蒸干甲醇后，4℃冻干，得到式(i)所示克酮酸菁染料(记为sr780)0.062g。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。
[0051]
制备型高效液相色谱仪的型号为lc3000，色谱柱型号为cosmosil5c18-ms-ii 20mm*250mm；流动相为体积比1:9的超纯水：甲醇混合溶剂；洗脱速度为4ml/min，检测波长为700nm，柱温为30℃，保留时间为14min。
[0052]
sr780的核磁数据：1h nmr(600mhz,dmso)δ8.54(s,2h),7.04(s,2h),3.72(s,3h),
2.51(s,8h),2.26(s,8h),1.23(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ181.94,173.38,123.16,115.00,70.25,69.76,65.96,63.10,54.06,51.22,45.66,31.76,29.35,28.93,24.92,22.56,14.43.
[0053]
实施例3、克酮酸菁染料吸收光谱和发射光谱检测
[0054]
紫外可见吸收光谱测试：采用紫外可见光分光光度计(uv-5500pc，上海元析仪器有限公司)对实施例2方法制备的克酮酸菁染料sr780进行紫外可见吸收光谱检测：取700μl浓度为7.5μg/ml的sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至7.5μg/ml)置于石英比色皿中，以去离子水置零，选择500nm～1000nm波长范围进行光谱扫描，结果见图3所示，sr780在600nm～900nm之间具有强吸收。
[0055]
荧光发射光谱测试：采用荧光分光光度计(perkinelmer lambda 750)对实施例2方法制备的克酮酸菁染料sr780进行荧光发射光谱检测：取3ml浓度为10μm的sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至10μm)，选择900nm～1400nm波长范围进行光谱扫描，结果见图4所示，sr780在900nm～1100nm之间具有宽发射。
[0056]
此外，分别制备3ml浓度为10μm且ph＝1.0、3.0、4.5、5.5、6.5、7.4、8.0的sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至10μm)，选择900nm～1400nm波长范围进行光谱扫描，结果见图5所示，sr780在900nm～1100nm之间随着ph值降低，荧光信号逐渐增强。
[0057]
光声信号测试：采用光声成像仪(vevo lazr，fujifilm visualsonics)对实施例2方法制备的克酮酸菁染料sr780进行光声信号检测：取200μl浓度为5mm的sr780 dmso溶液，选择1200nm～2000nm的激发光，结果见图6所示，sr780在1400nm～1800nm具有较强光声信号。
[0058]
结果表明sr780的吸收光谱和发射光谱都处于近红外区(750-900nm)，发射光谱延伸到了近红外二区(1000-1100nm)，且具有较强荧光及光声信号。
[0059]
实施例4、克酮酸菁染料与市售染料icg及ir780稳定性比较
[0060]
分别将实施例2方法制备的克酮酸菁染料sr780、吲哚菁绿(icg，tci)及ir780碘化物(heowns)用dmso溶解制成1mm母液，再分别用去离子水稀释制备成浓度为10μg/ml的溶液。各取1ml置于ep管中，用808nm激光(功率1.5w/cm2)分别照射0min、10min、20min后选择500nm～1000nm波长范围进行紫外可见吸收光谱扫描，结果见图7、图8、图9所示，光照10min后市售染料icg与ir780均无紫外吸收，而克酮酸菁染料sr780光照20min后紫外吸收几乎无变化，表明sr780稳定性良好。
[0061][0062]
实施例5、克酮酸菁染料sr780的ros产率效果
[0063]
1、dcfh溶液：
[0064]
取5μl的10mm的活性氧荧光探针(dcfh-da)甲醇溶液与20μl的0.01m的naoh水溶液，室温反应30min，加入975μl的pbs，获得50μm的无荧光2',7'-二氯二氢荧光素(dcfh)溶液。
[0065]
2、激光照射时间对染料荧光强度的影响
[0066]
将实施例2方法制备的克酮菁染料sr780溶于去离子水中，配置成浓度5μm的sr780溶液。向990μl的sr780溶液中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液构成1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。用808nm激光(功率0.5w/cm2)持续照射180s，分别在照射0、10、20、30、45、60、90、120和180s时在450-650nm波长范围内检测荧光。结果如图10所示，随着时间的延长，525nm波长处荧光逐步增强。
[0067]
3、激光照射时间对染料荧光强度的影响
[0068]
设置空白对照组(blank)、sr780不光照组(sr780)、sr780光照组(sr780 laser)、icg光照组(icg laser)，sr780加维生素c光照组(sr780 vc laser)。
[0069]
sr780光照组：向990μl的5μm sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至5μm)中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液构成1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。用808nm激光(功率0.5w/cm2)持续照射180s。
[0070]
sr780不光照组：向990μl的5μm sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至5μm)中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液构成
1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。黑暗下放置180s。
[0071]
sr780加维生素c光照组：向990μl的5μm sr780溶液(先将sr780用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至5μm)中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液、88μg维生素c构成1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。用808nm激光(功率0.5w/cm2)持续照射180s。
[0072]
icg光照组：向990μl的5μm icg溶液(先将icg用二甲基亚砜dmso配制成1mm母液，再用去离子水将母液稀释至5μm)中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液构成1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。用808nm激光(功率0.5w/cm2)持续照射180s。
[0073]
空白对照组：向990μl的水中加入10μl步骤1制备的dcfh(50μm)溶液构成1ml的反应体系，保持反应体系中dcfh工作浓度0.5μm。用808nm激光(功率0.5w/cm2)持续照射180s。
[0074]
将各组分别在激光照射0、10、20、30、45、60、90、120和180s时，采用荧光分光光度计检测525nm波长处荧光强度，各时间点荧光强度与0s时荧光强度比值(即活性氧物种ros产率)如图11所示，相较于紫外吸收相似的市售染料icg组，sr780表现出较高的ros产率。
[0075]
4、不同染料的光动力
[0076]
参考文献[1]spence g t,hartland g v,smith b d.activated photothermal heating using croconaine dyes[j].chemical science,2013,4(11):4240.制备克酮酸染料1。
[0077]
向2ml的5μm克酮酸染料1甲醇溶液中加入20μl的3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)氯仿溶液(10mm)构成2.02ml的反应体系，且反应体系中dpbf工作浓度0.1mm。用氙灯(功率150w,620nm滤光片)距离15cm，持续照射180s。分别在0、1、2、3min取样在300-950nm进行紫外分光光度计扫描，结果见图12所示。
[0078]
同样条件下，将克酮酸染料1替换为市售染料icg，其他操作相同，结果见图13所示。
[0079]
图12、图13表明，icg组随着光照时间延长在400nm处吸光度逐步降低，表明有ros产生，而克酮酸染料1组随着光照时间延长在400nm处吸光度不变，表明无ros产生。由此结果得出sr780光动力效果(图10与11)远高于文献中克酮酸染料1，sr780给与光照后(图10与图11)产生较多ros，且效果优于icg。
[0080][0081]
实施例6、克酮酸菁染料sr780的抗hepg-2肿瘤细胞增殖活性
[0082]
1、本实施例验证克酮酸菁染料对肿瘤细胞的光动力治疗效果。
[0083]
(1)将实施例2方法制备的克酮酸菁染料sr780溶于pbs制成1mm母液，分别用pbs稀释并设置(10μm、20μm、40μm、60μm、80μm)浓度梯度进行给药。
[0084]
(2)用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法评估sr780对肝癌细胞hepg-2代谢活性，具体步骤如下：
[0085]
将肝癌细胞hepg-2接种至含10％胎牛血清的dmem完全培养基，置于培养箱(37℃，
5％co2)孵育，培养3代后，取对数生长期的细胞接种在96孔板中，密度为8
×
103细胞/孔，37℃孵育过夜，使细胞充分贴壁。吸弃旧的培养基，设置实验组和对照组，实验组分为光照组(sr780 l)和非光照组(sr780)，每组设置4个平行(计算误差)。光照组(sr780 l)和非光照组(sr780)分别加入100μl含不同浓度(10μm、20μm、40μm、60μm、80μm)sr780的不含血清的dmem培养基，空白对照组添加100μl不含血清的dmem培养基。继续37℃，5％co2培养4h后，光照组给予0.5w/cm2的808nm激光照射2min，非光照组和空白对照组黑暗处理。照射后继续孵育24h后，采用酶标仪(thermo scientifictmmultiskantmfc)检测各组在490nm处吸光值，通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果如图14所示。从结果中可以看到，克酮酸菁染料显示出剂量依赖的光细胞毒性，细胞存活率在光照条件下随着染料的浓度增加而降低，这表明它们在这些条件下具有高的细胞杀伤效率。同时，发现这些染料在黑暗中细胞存活率高，这表明它们在没有光存在的情况下是无毒性的。
[0086]
2、市售染料icg对肿瘤细胞的光动力治疗效果
[0087]
(1)将市售染料icg溶于dmso中，制成100mm母液，分别用pbs稀释并设置(0μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm)浓度梯度进行给药。
[0088]
(2)将肝癌细胞hepg-2接种至含10％胎牛血清的dmem完全培养基，置于培养箱(37℃，5％co2)孵育，培养3代后，取对数生长期的细胞接种在96孔板中，密度为8
×
103细胞/孔，37℃孵育过夜，使细胞充分贴壁。吸弃旧的培养基，设置实验组和空白对照组，实验组分为光照组与非光照组，每组设置4个平行(计算误差)。光照组(icg l)和非光照组(icg)分别加入100μl含不同浓度(0μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm)icg的dmem培养基，空白对照组添加100μl的dmem培养基。继续37℃，5％co2培养4h后，光照组给予0.2w/cm2的810nm激光照射2min，非光照组和空白对照组黑暗处理。照射后继续孵育24h后，采用酶联免疫检测仪检测各组在490nm处吸光值，通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对细胞存活率的影响。结果如图15所示。从结果中可以看到，icg的细胞存活率在光照条件下随着染料的浓度增加而降低(icg杀伤细胞作用包括两方面，即光动力与光热)，但相较于只产生光动力效果的sr780而言，相同细胞存活率时，icg所需浓度远高于sr780，表明sr780单纯的光动力效果优于icg光动力与光热的联合效果。
[0089]
以上结果展示了该克酮酸菁染料在光动力治疗中的应用前景。