一种双键官能化修饰的透明质酸(钠)及其合成方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药与医学美容领域，尤其涉及一种新的双键官能化的透明质酸(钠)及其合成方法和应用。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，ha)是一种线性、非枝化，由双糖反复交替连接而组成的大分子酸性粘多糖聚合物，构成透明质酸分子重复单元的是下面两种小分子：β(1，4)-n-乙酰-d-氨基葡萄糖和β(1，3)-d-葡萄糖醛酸。与细胞外基质中高含量的其他糖胺聚糖(gags)不同，如肝素和硫酸软骨素，ha为非硫酸化。ha链长度为从约200kda到10mda之间不等，最常见的大小范围为从2.0mda到5.0mda。超过50％的透明质酸存在于皮肤、肺和肠。此外，在关节滑液、软骨、脐带、血管壁等组织间质中也有存在。人体内合成的透明质酸主要发挥润滑及缓冲作用、填充剂和扩散屏障、清除自由基等生理功能。目前市场上所用的透明质酸产品可以从动物组织(如鸡冠、眼玻璃体、脑软骨、关节液)中提取，也可由细菌(如链球菌、绿脓杆菌等)发酵而来。
3.近年来，随着对ha功能的深入研究，ha已广泛应用于医药领域，如用于制备药物传递系统以及用于骨科疾病和眼科疾病的治疗、手术后粘连的预防及软组织修复等，已成为组织工程领域的研究热点。
4.尽管天然ha具有极好的生物相容性和抗炎等作用，但存在机械强度较弱以及易降解性等问题。因此作为组织工程支架材料，ha必须经过适当的化学改性或与其他材料配伍使用，以改善这些不足，更好地发挥其生物作用，为细胞的存活和功能及组织的修复和再生提供良好的环境。ha可通过分子间物理作用，如氢键、静电作用、疏水作用及链间缠结等进行暂时性物理交联，此过程是可逆的。未经修饰的ha很难具有协同作用，不能形成稳定的水凝胶。高浓度高分子量的未修饰ha可形成凝胶状溶液，但不存在化学交联。此类凝胶不需额外交联剂，但凝胶力学性能差，不能满足多数组织工程学的应用要求。
5.易降解的天然ha可通过化学改性获得较好的物理稳定性和机械强度。ha的化学交联一般通过小分子交联剂使ha分子内交联或通过对ha进行化学修饰后交联来完成。ha分子结构中有大量的伯、仲羟基，羧基等基团，因此，可以用双官能团小分子交联剂将其交联。如环氧化合物、戊二醛、二乙烯基砜、多功能酰肼类等。此外，ha分子单体链上的基团经过化学修饰可获得功能化的修饰透明质酸，如醛基化ha、酰肼化ha、硫醇化ha、双键化ha等。功能化ha通过自身进行交联或与其他成份交联，可获得一类具有优良力学性能和降解性能的水凝胶。ha也可与其他成分的生物功能材料配伍使用，相互取长补短，从而获得具有优良机械性能的三维支架。然后，传统小分子交联剂中含有的反应性基团对生物体侵蚀性比较严重，残余交联剂通过对蛋白质变性进而引起人体强烈的过敏反应。因此，开发生物相容性良好的ha交联技术对该类产品的工业化进程具有极大的促进意义。
6.通过化学方式交联获得的ha水凝胶已被广泛应用于组织工程领域。如通过在ha交联水凝胶中引入作为骨诱导效应的信号分子所制备的支架材料，能够提高前成骨细胞的骨
生成效应，诱导新骨形成；ha本身即为软骨组织的天然成分，ha可以配合软骨细胞制备成可降解支架，应用于软骨组织修复；ha水凝胶敷料用于皮肤组织工程，可以发挥促进血管生成、抑制胶原过度增生、减少瘢痕形成和促进创伤愈合等作用。
7.然而，众多制备ha水凝胶的化学方式存在多种局限性和安全隐患，如使用有毒小分子交联剂制备凝胶、化学修饰ha效率低、凝胶制备不易操作等。因此，需要通过设计更安全、有效的合成方式来获得功能化ha，利用功能化基团通过自身交联或与其他组分高效交联制备ha水凝胶是目前亟待解决的问题。
8.双键官能化透明质酸是一种生物相容性好，易于交联的透明质酸衍生物。近年来已有多篇文献报道该类透明质酸衍生物形成的水凝胶在组织工程学和再生医学领域展现出了良好的应用价值。然而现阶段报道的双键透明质酸修饰方法还存在种种不足之处。例如：修饰单体投料比过高(20-100倍量)，需要有机溶剂促进修饰单体的溶解来提高反应效率，经常需要多步合成和多步纯化过程。因此，该类材料的应用技术仍然局限于实验室研究领域，并未产生成熟的工业化应用实例。


技术实现要素：

9.本发明通过对透明质酸(钠)的羧基进行修饰合成双键官能化的透明质酸(钠)。
10.根据本发明的一个方面，本发明涉及一种具有如下结构的双键官能化修饰的透明质酸(钠)，在本专利中可英文简写为ha-acylate：
[0011][0012]
本领域技术人员可以理解，各种分子量的透明质酸或透明质酸钠均可用于本发明。在优选的实施方案中，被双键官能化修饰的透明质酸或透明质酸钠的分子量为5k da-10m da，更优选为100k da-800k da，最优选为200k da-600k da。
[0013]
在优选的实施方案中，双键官能化的透明质酸或透明质酸钠的修饰率(或取代度)为20％-80％，优选地，修饰率为40％-70％，更优选地，修饰率为约65％。
[0014]
本领域技术人员可以理解，在本发明中，可以使用各种来源的透明质酸(钠)，可以市售，也可以自制，可以是提取物，也可以通过生物发酵等方式制备得到。
[0015]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述双键官能化修饰的透明质酸或透明质酸钠的制备方法，包括如下步骤：将透明质酸(钠)溶解于水中，并调节所得溶液的ph至4.5-5.0，优选4.7-4.8；加入edci(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)搅拌使之溶
解；随后加入nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)搅拌使之溶解；加入丙烯酸酰肼衍生物(n-(2-乙酰肼基)丙烯酰胺)，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下搅拌反应0.5-12h，优选1-4h，最优选约2h；调节反应液ph至6.0-8.0，优选6.9-7.1以终止反应，将反应液透析并冻干得双键官能化修饰的透明质酸(钠)；
[0016]
优选地，透明质酸(钠)的分子量为5k da-10m da，更优选地，透明质酸(钠)的分子量为100kda-800kda，最优选地，透明质酸(钠)的分子量为200kda-600kda；
[0017]
优选地，透明质酸(钠)水溶液的质量/体积浓度为0.1％-2.5％，更优选为0.5-1.5％，最优选为约1.0％；
[0018]
优选地，edci和透明质酸(钠)的质量比为1∶4-4∶1，更优选1∶2-2∶1；
[0019]
优选地，nhs和透明质酸(钠)的质量比为1∶4-4∶1，更优选1∶2-2∶1；
[0020]
优选地，丙烯酸酰肼衍生物和透明质酸(钠)的质量比为1∶4-4∶1，更优选1∶2-2∶1；
[0021]
优选地，加入edci搅拌使之溶解后继续搅拌2-60分钟，更优选5-30分钟，最优选约15分钟；
[0022]
优选地，加入nhs搅拌使之溶解后继续搅拌15分钟-4小时，更优选30分钟-2小时，最优选约1小时；
[0023]
优选地，在加入nhs之后和反应过程中控制反应液的ph为4.5-5.0，更优选为4.7-4.8。
[0024]
本领域技术人员可以理解，各种本领域常用的ph调节剂均可用于本发明。优选地，使用盐酸水溶液和/或氢氧化钠水溶液调节ph，更优选，盐酸水溶液的浓度为约1m，氢氧化钠水溶液的浓度为约1m。
[0025]
本领域技术人员可以理解，透析以去除反应残留物及杂质。优选地，使用透析袋。
[0026]
上述反应的具体反应路线如下：
[0027][0028]
本发明的双键官能化透明质酸或透明质酸钠既可以通过紫外引发自由基聚合交联形成水凝胶，又可以通过硫醇点击化学交联反应形成水凝胶。
[0029]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种水凝胶，其由上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)交联得到。
[0030]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：制备含有上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)和光引发剂的水溶液，于紫外光(优选230nm-400nm，最优选254nm)照射下进行交联反应0.1-10分钟，优选约1分钟，即得到紫外光交联的
水凝胶。本发明的优点在于反应过程不需要加入交联剂，且光引发剂在紫外光照射下，基本分解完全。
[0031]
根据本发明，光引发剂优选i2959(2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)。
[0032]
根据本发明，水溶液中双键官能化修饰的透明质酸(钠)的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1.0-3.0％，最优选为约2.0％。
[0033]
根据本发明，水溶液中光引发剂的质量/体积浓度为0.1％-2.0％。
[0034]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种水凝胶，其由上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)与含巯基的透明质酸(钠)交联得到。
[0035]
根据本发明，上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)与含巯基的透明质酸(钠)的质量比为1∶10-10∶1，优选为1∶5-5∶1，最优选约1∶1。
[0036]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：制备含有上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)和含巯基的透明质酸(钠)的水溶液，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下反应0.1-10h，优选10min-5h。
[0037]
根据本发明，水溶液中上述双键官能化修饰的透明质酸(钠)的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1.0-3.0％，最优选为约2.0％；含巯基的透明质酸(钠)的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1.0-3.0％，最优选为约2.0％。
[0038]
本发明的水凝胶其机械性能明显优于现有市售透明质酸水凝胶产品，具体体现在生物体内更耐降解。
[0039]
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述水凝胶的用途，特别适合用于生物医药，医疗美容整形，以及化妆品等领域。具体的，其可以用于制备软组织创伤修复敷料、用于骨修复的支架材料、眼科手术中用于支撑作用的粘弹剂、以及用于3d生物打印的支架材料等。
[0040]
本发明的有益效果在于：
[0041]
1.本发明通过一锅一步法合成得到双键官能化修饰的透明质酸或透明质酸钠，该方法的双键接枝率可调节。
[0042]
2.与传统方法合成的双键透明质酸相比，酰肼交联位点的稳定性大大高于酯基交联位点的稳定性。因此，本产品形成的水凝胶在体内的维持时间要明显高于传统方法合成双键透明质酸在体内的代谢时间，在填充塑型美容产品领域拥有更诱人的应用前景。
[0043]
3.本发明将透明质酸修饰试剂的使用量从20-100倍降低到0.3-2倍量，极大的降低了反应成本，即相当于降低了50倍的修饰剂成本，即本发明所采用的方法，其成本只相当于现有技术中具有交到作用方法的成本的2％，这将极大的促进成本控制和产业进步。
[0044]
4.本发明还避免了有机溶剂的使用，从根本上解决了产品中有机溶剂的残留问题，这样可以更好的带来生物相容性，相应的植入人体的排异反应及炎症反应发生概率可以大大降低。
[0045]
5.本发明为一步合成修饰法，无须进行中间产物的提纯等工艺，有利于工业化扩大生产和进一步的节约成本。
[0046]
6.本发明的交联透明质酸，对比现有技术中的交联透明质酸或市售的交联透明质酸，具有机械强度更大的优点，并且这些优点可使由本发明的双键修饰化透明质酸所制备的交联透明质酸具有更好的填充成型性，适用于生物医学或医学美容领域的填充领域。
附图说明
[0047]
图1双键官能化修饰的透明质酸(钠)的结构特征1h-nmr谱图
具体实施方式
[0048]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0049]
制备例1丙烯酸酰肼衍生物的合成
[0050]
将5g甘氨酸乙酯与5g三乙胺溶解于100ml无水二氯甲烷中，溶液冷却至0度，缓慢滴加4.5g丙烯酰氯，反应过程控制温度不超过5度。滴加完毕后，溶液于室温搅拌16小时，过滤除去三乙胺盐酸盐。溶液中加入25g水合肼(50％)，室温搅拌24小时，旋转蒸发除去二氯甲烷，所得粗产品经过重结晶得到丙烯酸酰肼衍生物n-(2-乙酰肼基)丙烯酰胺4.3g，产率60.1％。
[0051]
实施例1双键官能化修饰的透明质酸(钠)ha-acrylate的制备
[0052]
将1.0g分子量为200kda的透明质酸(钠)溶解于100ml超纯水中配制成1.0％w/v的溶液，随后用1m的hcl水溶液调节溶液ph至4.75；加入0.96g的edci，搅拌使之溶解，继续搅拌15分钟；加入0.58g的nhs，搅拌使之溶解，继续搅拌1小时，期间用1m的hcl水溶液控制反应液的ph在4.7-4.8之间；加入0.72g的丙烯酸酰肼衍生物于室温下搅拌反应2小时，在反应过程中用1m的hcl水溶液控制反应液的ph在4.7-4.8之间；用1m的naoh水溶液将反应液ph调节至7.0，以终止反应；将反应液转移至透析袋(仕必纯，8kda截留分子量)中透析3天，将透析后所得的纯化溶液经冷冻干燥后得到双键官能化修饰的透明质酸(钠)。经测，双键官能化修饰率为65％，经计算，收率为83％。产物避光保存于-20℃，优选充氮气保存。
[0053]
本实施例所用透明质酸(钠)原材料为市售品、化妆品级，分子量为200kda。
[0054]
实施例2：由实施例1所制备的ha-acrylate制备水凝胶
[0055]
称取50mg i2959溶解于10毫升去离子水中，得到光引发剂溶液。将实施例1制备的双键官能化透明质酸(钠)溶解于光引发剂溶液后得到浓度为2％的凝胶前体溶液。所得前体溶液在紫外光(254nm)照射下，交联反应达到1分钟后，粘度不再增加，即得到光交联的水凝胶，即双键官能化透明质酸(钠)水凝胶，英文可简写为ha-acrylate-gel，本实施例中所用的光引发剂在紫外光照射下，即基本分解完毕。交联后的水凝胶，其压缩模量(61.65
±
0.03)
×
103pa(ph6.8)。
[0056]
本实施例中，i2959为光引发剂，化学名为：2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，cas号：106797-53-9；线性分子式为hoch2ch2oc6h4coc(ch3)2oh；分子量224.25；光引发剂i2959可以商购获得。
[0057]
实施例3：双键官能化透明质酸(钠)水凝胶的机械强度测定
[0058]
本发明以市售来源的透明质酸为原料起点，制备了双键官能化的透明质酸(钠)ha-acrylate，并以此ha-acrylate与适宜光引发剂发生作用，制得双键官能化的透明质酸(钠)水凝胶ha-acrylate-gel。对制备的双键官能化透明质酸(钠)水凝胶进行了流变试验
和压缩试验。结果表明，水凝胶经紫外光引发后可迅速固化，机械强度达到约60kpa，与人体内血管的强度是相近的。可作为人体内局部手术填充或3d打印血管的候选支撑材料。
[0059][0060]
实施例4：实施例1所制得双键官能化透明质酸(钠)的细胞毒性测试
[0061]
取小鼠成纤维细胞l929接种至96孔板，培养24小时，向其中加入100μl不同浓度的实施例1中的ha-acrylate水溶液(设置3个复孔)，浓度为0.1mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，阴性对照使用全培养基，培养24小时后进行mtt测试。结果显示，实验组和阴性对照组细胞均生长良好，与阴性对照相比，各实验组均没有显著性差异，表明本发明中制备例1所制得双键官能化透明质酸(钠)的生物相容性良好。
[0062]
实施例5：实施例2所制得双键官能化透明质酸(钠)水凝胶的细胞毒性测试
[0063]
将200μl实施例2中制备的双键官能化透明质酸(钠)水凝胶浸泡于1ml全细胞培养基中浸提24小时后获得100％浸提液。将浸提液按照75％，50％，25％的浓度进行稀释。
[0064]
取小鼠成纤维细胞l929接种至96孔板，培养24小时，向其中加入100μl上述不同浓度的实施例2中双键官能化透明质酸水凝胶的浸提液(设置3个复孔)，阴性对照使用全培养基，培养24小时后进行mtt测试。结果显示，实验组和阴性对照组细胞均生长良好，与阴性对照相比，各实验组均没有显著性差异，本实施例的结果表明，本发明实施例2所制得的双键官能化透明质酸(钠)水凝胶的生物相容性良好。
[0065]
实施例6：由实施例1所制得双键官能化透明质酸(钠)与巯基官能化透明质酸(钠)(ha-sh)交联制备水凝胶
[0066]
本实施例即由实施例1所制得双键官能化透明质酸(钠)经硫醇点击化学与ha-sh交联反应形成水凝胶。
[0067]
ha-sh，来源：市售品，供货商为creative pegworks公司，产品型号为：hyaluronate thiol，mw 250kda。
[0068]
取由实施例1所制得的双键官能化透明质酸(钠)ha-acrylate，加水配制成w/v浓度为2.0％的水溶液；另取市售的ha-sh，加水配制成w/v浓度为2.0％的水溶液；将上述两种水溶液以等体积充分混合后，在室温条件下反应10min后形成水凝胶，继续在室温条件下培养4小时后得到完全交联的凝胶，其储能模量已不再增加，该水凝胶的储能模量g’为1976
±
58pa，损耗模量g”为94
±
24pa。
[0069]
实施例7：由实施例1所制得双键官能化透明质酸(钠)在生物医药领域的应用
[0070]
用于3d打印的可光固化基质材料组合物处方：
[0071]
双键官能化透明质酸(钠)(ha-acrylate)
ꢀꢀꢀꢀ
2％-4％
[0072]
光引发剂i2959
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1％-0.5％
[0073]
ph6.8磷酸盐缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95.5％-97.9％
[0074]
将以上材料在室温下混合均匀，并以此为基质，在紫外光下经过3d激光打印成型，紫外波长优选为254nm，打印时的成型时间保持在1min。
[0075]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。