一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其是涉及一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.酶是重要的生物大分子，是人新陈代谢的催化剂，实时准确地监测生物样品中的酶活性具有十分重要的意义。酪氨酸酶是一种普遍存在的含铜氧化酶，广泛存在于植物、动物和真菌中。酪氨酸酶可催化黑色素的形成，是黑色素生成的限速酶，被广泛认为是一种重要的生物标志物，其代谢异常与严重的疾病有关，例如，酪氨酸酶的过量表达会导致恶性黑色素瘤的产生，黑色素缺乏的人会患白化病或者白癜风，此外酪氨酸酶与精神性疾病有关，如帕金森病和精神分裂症等。因此开发一种灵敏度高、选择性好的工具来检测酪氨酸酶，对于酪氨酸酶相关疾病的诊断具有重要意义。
3.目前，检测酪氨酸酶的方法有比色法、电化学法和电泳法等，然而这些方法操作复杂或不适用于活体样品中酪氨酸酶的检测，因此这些方法是存在局限性的。荧光分析法具有操作简单、灵敏度高、选择性高和可用于生物活体成像等优点，是一种很好的检测酪氨酸酶的工具。研究表明，主要的荧光传感系统分为两类，一类是基于纳米材料，另一类是基于有机荧光分子。基于纳米材料的荧光探针，大多为荧光淬灭型探针，具有信号低和抗干扰能力差等缺点，基于有机荧光分子的荧光探针可通过灵活的分子设计，克服上述缺点，故受到更为广泛的关注。
4.迄今为止，已经开发了多种用来识别酪氨酸酶的荧光探针，但由于水溶性差、细胞性毒性大、斯托克斯位移小等缺点，无法应用于生物成像。目前，也有利用基于香豆素衍生物的荧光探针检测酪氨酸酶的报道，但其仍然存在探针荧光背景高、探针对酪氨酸的检测效果差、斯托克斯位移小、抗干扰能力差的问题。因此，迫切需要开发一种能够克服上述缺点的新型荧光探针。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用，解决现有技术中探针荧光背景高、探针对酪氨酸的检测效果差、斯托克斯位移小、抗干扰能力差的技术问题。
6.本发明的第一方面提供一种检测酪氨酸酶荧光探针，其具有以下结构式：
[0007][0008]
本发明的第二方面提供一种检测酪氨酸酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
将7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素和间羟基苄溴在有机溶剂和碱的作用下回流反
应，随后经分离纯化得到检测酪氨酸酶荧光探针；具体合成路线如下：
[0010][0011]
本发明的第三方面提供一种检测酪氨酸酶的荧光探针的应用，本发明第一方面提供的检测酪氨酸酶的荧光探针应用于体外或体内酪氨酸酶活性的检测和酪氨酸酶抑制剂的筛选。
[0012]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0013]
(1)本发明制备的荧光探针具有荧光背景低、化学稳定性好、水溶性好、选择性高、斯托克斯位移大(170nm)、抗干扰能力强、灵敏度高、检测效果好等优点，可用于0-120u/ml浓度范围内酪氨酸酶的线性检测，检测限为0.12u/ml；
[0014]
(2)本发明制备的荧光探针本身处于荧光淬灭状态，与酪氨酸酶结合识别后，表现出强烈的荧光，荧光增强约178倍；
[0015]
(3)本发明制备的荧光探针不仅能用于体外酪氨酸酶活性的检测，还能应用于酪氨酸酶抑制剂的筛选，对治疗与酪氨酸酶相关疾病具有重要意义；
[0016]
(4)本发明制备的荧光探针可用于细胞和斑马鱼中内源性酪氨酸酶的检测和成像，成功用于细胞水平以及生物水平的酪氨酸酶的检测和成像；
[0017]
(5)本发明的荧光探针制备方法简单，仅一步反应便可得到。
附图说明
[0018]
图1为本发明实施例1所得荧光探针的1h nmr谱图；
[0019]
图2为本发明实施例1所得荧光探针的
13
c nmr；
[0020]
图3为本发明实施例1所得荧光探针的hrms谱图；
[0021]
图4为本发明实施例1所得荧光探针检测酪氨酸酶响应的荧光光谱图；
[0022]
图5为不同浓度的酪氨酸酶对本发明实施例1所得荧光探针的滴定测试图；
[0023]
图6为本发明实施例1所得荧光探针在低浓度范围内检测酪氨酸酶的检测限测试图；
[0024]
图7为本发明实施例1所得荧光探针对酪氨酸酶的酶动力学米氏方程拟合图；
[0025]
图8为本发明实施例1所得荧光探针ic
50
测试图；
[0026]
图9为本发明实施例1所得荧光探针与不同分析物反应的荧光响应柱状图；
[0027]
图10为本发明实施例1所得荧光探针在活细胞中检测酪氨酸酶的荧光成像图；
[0028]
图11为本发明实施例1所得荧光探针检测活体斑马鱼中酪氨酸酶的荧光成像图。
具体实施方式
[0029]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
[0030]
本发明的第一方面提供一种检测酪氨酸酶荧光探针，其具有以下结构式：
[0031][0032]
本发明的识别酪氨酸酶的荧光增强型探针的作用机制如下：以7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素(hfc)为荧光团，间羟基苄基为识别基团，探针处于荧光淬灭状态，在酪氨酸酶的作用下，连接臂断开，荧光团释放，从而表现出强烈的荧光信号，通过监测在505nm处的荧光信号，可以实时监测酪氨酸酶的活性。
[0033][0034]
本发明的第二方面提供一种检测酪氨酸酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
将7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素(hfc)和间羟基苄溴在有机溶剂和碱的作用下回流反应，随后经分离纯化得到检测酪氨酸酶荧光探针(hfc-tyr)。具体合成路线如下：
[0036][0037]
本发明中，7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素、碱与间羟基苄溴的摩尔比为1：(2～4)：(1～3)，进一步为1:3:2。
[0038]
本发明中，有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、无水二氯甲烷中的至少一种，碱为无水碳酸钾、碳酸铯、三乙胺、吡啶中的至少一种。
[0039]
本发明中，回流反应的温度为40～70℃，进一步为60℃；回流反应的时间为12～24h，进一步为12h。
[0040]
本发明中，分离纯化的步骤包括：回流反应结束后，将反应液冷却至室温，加入乙酸乙酯和水萃取，收集乙酸乙酯层样品，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，除去溶剂，得到粗产物；将粗产物经硅胶柱层析(ch2cl2:pe＝2:1)提纯，得到白色固体；然后用无水乙醚洗涤所得到的固体，离心、固液分离，得到检测酪氨酸酶荧光探针(hfc-tyr)。
[0041]
本发明的第三方面提供一种检测酪氨酸酶的荧光探针的应用，本发明第一方面提供的检测酪氨酸酶的荧光探针应用于体外或体内酪氨酸酶活性的检测和酪氨酸酶抑制剂的筛选。
[0042]
本发明中，上述体外或体内酪氨酸酶活性的检测包括水溶液中酪氨酸酶的定性以
及定量检测。
[0043]
本发明中，上述体外或体内酪氨酸酶活性的检测包括活细胞和斑马鱼内源性酪氨酸酶的检测，且该细胞用于非治疗目的。
[0044]
本发明中，上述酪氨酸酶抑制剂的筛选包括：以上述检测酪氨酸酶的荧光探针为底物对酪氨酸酶抑制剂的筛选。
[0045]
实施例1
[0046]
一种检测酪氨酸酶荧光探针的制备方法，具体步骤如下：
[0047]
称取hfc(150mg，0.65mmol)和无水碳酸钾(269.52mg,1.95mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入7ml无水乙腈溶解，室温搅拌30分钟，用3ml无水乙腈溶解间羟基苄溴(243.53mg，1.30mmol)，逐滴加入，60℃反应回流12小时，待原料hfc反应完后，停止反应，冷却至室温，加入乙酸乙酯和水萃取，收集乙酸乙酯层样品，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，除去溶剂，得到粗产物，将粗产物经硅胶柱层析(ch2cl2:pe＝2:1)提纯，得到白色固体，用无水乙醚洗涤固体，离心，固液分离，所得固体即为纯度较高的hfc-tyr。
[0048]
本实施例所得荧光探针hfc-tyr的核磁共振氢谱图如图1所示，1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),δ7.65,7.64,7.62(t,j＝12.0hz,1h),δ7.22,7.21,7.19,7.18,7.14,7.12,7.11(m,3h),6.89,6.87,6.86,6.85(m,4h),δ6.74-6.72(d,j＝8.0hz,1h),δ5.20(s,2h)。
[0049]
本实施例所得荧光探针的
13
c nmr如图2所示。
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ162.56,159.16,158.97,157.99,156.25,140.03,138.86,137.85,129.88,126.31,120.81,120.50,118.67,118.47,115.53,114.71,113.78,106.99,103.03,70.43。
[0050]
本实施例所得到的荧光探针的hrms图如图3所示。hrms(esi)calcd for c
17h12
f3o
4
；found:337.06824[m h]

。
[0051]
实施例2
[0052]
测试实施例1所得荧光探针与酪氨酸酶的响应效果：
[0053]
使用dmso配制10mm的实施例1中化合物hfc-tyr的储液，使用pbs缓冲液和甘油配制1500u/ml的酪氨酸酶储液。取1μl上述化合物hfc-tyr的储液和999μl pbs(ph＝6.5)缓冲液于比色皿中，检测其在505nm处的荧光光谱，同时取1μl上述化合物hfc-tyr的储液、799μl pbs(ph＝6.5)缓冲液和200μl的酪氨酸酶储液于比色皿中，检测该反应体系随时间变化的荧光光谱，如图4所示，荧光探针本身没有荧光，当与酪氨酸酶反应后，荧光强度增强，在505nm处的荧光强度增加约178倍，说明该探针是一种识别酪氨酸酶的荧光增强型探针，当反应时间达到12小时，荧光强度不再增加，反应结束。
[0054]
实施例3
[0055]
测试实施例1所得的荧光探针与不同浓度的酪氨酸酶反应的荧光光谱图：
[0056]
向比色皿中加入1μl上述化合物hfc-tyr的储液、ph＝6.5的pbs缓冲液(999，995.67，992.33，985.67，979，972.33，965.67，959，945.67，932.33，919，899，879，859，832.33，799μl)和不同体积(0，3.33，6.67，13.33，20，26.67，33.33，40，53.33，66.67，80，100，120，140，166.67，200μl)上述酪氨酸酶储液，对应酪氨酸酶的工作浓度分别为0，5，10，20，30，40，50，60，80，100，120，150，180，210，250，300u/ml，反应12小时后，测试其荧光光谱，如图5所示，反应体系在505nm处的荧光强度随酪氨酸酶的浓度增加而增加，说明该探针
可以检测不同浓度的酪氨酸酶。
[0057]
实施例4
[0058]
测定实施例1所得的荧光探针检测酪氨酸酶的检测限：
[0059]
向比色皿加入上述化合物1μl(工作浓度为10μm)、pbs(ph＝6.5)缓冲液(999，995.67，992.33，985.67，979，972.33，965.67，959，945.67，932.33，919μl)和不同体积(0，3.33，6.67，13.33，20，26.67，33.33，40，53.33，66.67，80μl)上述酪氨酸酶储液，对应的酪氨酸酶的工作浓度分别为0，5，10，20，30，40，50，60，80，100，120u/ml，反应12小时后，在505nm处的荧光强度和酪氨酸酶的线性关系图，如图6所示，505nm处的荧光强度和酪氨酸酶呈良好的线性关系，说明在(0-120u/ml)的范围内，荧光探针可以定量检测酪氨酸酶。同时，根据线性关系图，计算出该探针检测酪氨酸酶的检测限为0.12u/ml，说明探针比较灵敏，可以检测较低浓度的酪氨酸酶。
[0060]
实施例5
[0061]
测试实施例1所得荧光探针酪氨酸酶的酶动力学米氏方程拟合图：
[0062]
将200μl(对应的工作浓度为300u/ml)的酪氨酸酶与0，0.1，0.2，0.5，1，2，3，3.5，4μl(对应的工作浓度为0，1，2，5，10，20，30，35，40μm)荧光探针hfc-tyr反应，测试其荧光强度随反应时间的变化。荧光强度与反应时间曲线的斜率为反应速率。如图7所示，以反应速率为纵坐标，荧光探针的浓度为横坐标，用米氏方程非线性拟合，计算得到酪氨酸酶对该探针的km为13.33μm，表明酪氨酸酶对该探针具有良好的亲和力。
[0063]
实施例6
[0064]
测试实施例1得到的荧光探针对酪氨酸酶抑制剂的抑制活性测试：
[0065]
向比色皿中分别加入实施例1所得荧光探针1μl(工作浓度为10μm，溶于37℃下ph值为6.5的pbs缓冲溶液中)、200μl酪氨酸酶(工作浓度为300u/ml)和曲酸(0，20，40，80，200，400，600，800μm)的混合液，反应12小时后，测试各个混合液在505nm处的荧光强度。如图8所示，以荧光探针为底物，测试不同浓度曲酸对酪氨酸酶的ic
50
抑制活性图，随着抑制剂浓度的增加，反应体系的荧光强度逐渐减弱，再次说明荧光探针可特异性识别酪氨酸酶。通过拟合得到抑制剂曲酸的ic
50
值为4.88μm。
[0066]
实施例7
[0067]
测试实施例1所得荧光探针识别酪氨酸酶的选择性：
[0068]
向比色皿中分别加入实施例1所得荧光探针1μl(工作浓度为10μm，溶于37℃下ph值为6.5的pbs缓冲溶液中)和不同的分析物的混合液(1:free；2:mg
2
(100μm)；3:k

(100μm)；4:ca
2
(100μm)；5:na

(100μm)；6:so
42-(100μm)7:hco
3-；8:h2s(100μm)；9:arg(100μm)；10:cly(100μm)；11:ala(100μm)；12:l-cys(100μm)；13:leu(100μm)；14:glu(100μm)；15:l-ser(100μm)；16:neutrophil elastase(100u ml-1
)；17:trypsin(100u ml-1
)；18:chymotrypsin(100u ml-1
)；19:tyrosinase(100u ml-1
)，测试各个混合液在反应12小时后在505nm处的荧光强度。如图9所示，在各种阴离子、金属阳离子、氨基酸以及各类生物酶存在下，荧光探针的荧光信号基本无变化，而加入酪氨酸酶后，其荧光显著增强，说明该荧光探针对酪氨酸酶具有很高的选择性。
[0069]
实施例8
[0070]
测定实施例1所得荧光探针检测活细胞中的酪氨酸酶：
[0071]
测定实施例1所得荧光探针1μl(工作浓度为10μm)分别与活细胞(hepg2、skov3、hela和293t细胞)共孵育2小时，用pbs洗涤后对细胞进行显微镜成像，如图10(a)所示，hepg2细胞的荧光最明显，说明hepg2细胞中酪氨酸酶含量高于另外三种细胞，于是选择hepg2细胞作为细胞模型，监测探针与hepg2孵育不同时间(30、60、90、120分钟)的细胞成像，并加入抑制剂曲酸预处理细胞后进行成像，如图10(b)所示，在hepg2细胞中表现出了绿色荧光，当加入抑制剂曲酸预处理后，绿色荧光明显被抑制，说明探针可用于检测成像活细胞内源性酪氨酸酶。
[0072]
实施例9
[0073]
测试实施例1所得荧光探针对活体斑马鱼中酪氨酸酶的成像检测：
[0074]
将生长0-7天的斑马鱼幼苗培养于6孔板中分为三组，第一组为空白组，即不加入探针孵育进行成像，第二组加入荧光探针孵育1小时和2小时后进行共聚焦成像，第三组先加入曲酸预处理细胞，然后加入荧光探针与斑马鱼共孵育2小时后进行共聚焦成像。如图11所示，随着孵育时间的增加，斑马鱼的荧光强度越强，而加入抑制剂预处理之后，斑马鱼几乎无荧光，说明该探针可特异性检测生物活体内源性酪氨酸酶的活性。
[0075]
最后，为了更好的体现本发明的优势，现将本发明制备的荧光探针与现有的基于香豆素衍生物的荧光探针的性能总结至表1。
[0076]
表1
[0077][0078]
通过表1可以看出，本技术的荧光探针明显具有更大的斯托克斯位移，说明其具有更好的抗干扰能力，并且可用于活细胞和斑马鱼内源性酪氨酸酶的检测。
[0079]
综上，本发明的荧光探针荧光背景低，几乎完全淬灭，对酪氨酸酶的响应效果好，和酪氨酸酶反应后，荧光增强倍数高达178倍；本发明的荧光探针具有较大的斯托克斯位移，从而使吸收能量中小部分能量用于发光，两峰重叠小，抗干扰能力更强；本发明的荧光探针可用于酪氨酸酶抑制剂的筛选；本发明的荧光探针可用于活细胞、活体斑马鱼内源性酪氨酸酶的检测和成像，具有检测与酪氨酸酶相关疾病的应用前景。
[0080]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。