miRNA-139-5p在制备预防或治疗抑郁症靶向药物中的应用的制作方法

mirna-139-5p在制备预防或治疗抑郁症靶向药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因表达调控技术领域，尤其涉及mirna-139-5p在制备预防或治疗抑郁症靶向药物中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是一种世界常见的慢性精神卫生疾病，由各种原因引起的以显著而持久的心境低落为主要临床特征的一类心境障碍，伴有不同程度的认知和行为改变，部分患者存在自伤、自杀行为，甚至因此死亡。目前，对抑郁症的治疗主要包括药物治疗、心理治疗和物理治疗。
3.抑郁症发病的确切生理机制尚未明确，目前研究抑郁症发生机制的假说主要有：神经营养因子假说、 5-羟色胺假说、多巴胺假说和谷氨酸假说等。许多研究表明，作为nt族最主要的因子——脑源性神经营养因子在抑郁症的发生发展过程中发挥了重要的作用。小鼠海马区bdnf的表达水平是衡量抑郁状态的重要指标之一。
4.磷酸二酯酶4(pde4)是体内特异性水解第二信使环磷酸腺苷的酶，由4种不同的异构体组成：pde4a、 4b、4c和4d。pde4d位于染色体5q12中，编码camp特异性3',5'-环状磷酸二酯酶4d。有研究报告称： pde4d在调控情感和记忆的关键脑区——海马中高度表达，是诱发抑郁症的关键因素。其主要是通过抑制 camp/蛋白激酶a(pka)/camp反应元件结合蛋白(creb)信号通路。而pde4d抑制剂可抑制pde4d 表达，减少camp降解，激活pka，使creb磷酸化。磷酸化creb(p-creb)易位到细胞核，在那里它结合dna元件并促进bdnf基因转录，通过增强海马神经发生发挥抗抑郁作用。然而，由于pde4d 主要在小鼠海马的催吐中心(如孤束核)表达，且在cums模式后上调，使其可能也是介导其抑制剂呕吐副作用的重要亚型。
5.现在的研究表明，对pde4d的选择性抑制可以保留抗抑郁作用并降低副作用倾向。因此，将pde4d 靶向作为一种潜在的治疗方法。然而，迄今为止，还没有研究报告一种有效且无副作用的新型pde4d抑制剂。因此，有必要寻找针对pde4d的新药物。


技术实现要素：

6.因此，基于以上背景，本发明将mirna-139-5p应用到用于预防和治疗抑郁症的药物中，不仅对 mirna-139-5p的应用进行了更进一步地开发，并且还可为抑郁症的防治提供新的技术思路。
7.本发明提供的技术方案为：
8.本发明的目的之一为提供：mirna-139-5p在制备预防或治疗抑郁症靶向药物中的应用。
9.本发明中的mirna-139-5p通过靶向结合抑制pde4d mrna表达，下调pde4d水平，激活camp/pka/ creb信号通路，上调camp、p-creb和bdnf表达，促进海马神经元brdu、nestin和dcx表达，实现抗抑郁药效。
10.本发明的目的之二是提供：mirna-139-5p在制备pde4d抑制剂中的应用。
11.本发明的目的之三是提供：一种用来预防或治疗抑郁症靶向药物，其包括有效量的mirna-139-5p。
12.进一步地，其还包括载体。
13.进一步地，所述载体为腺相关病毒。
14.进一步地，其可为注射剂型。
15.本发明的优点在于：
16.本发明通过mirna-139-5p可靶向下调pde4d的水平，可激活camp/pka/creb信号通路，促进海马神经元brdu、nestin和dcx表达，为研究抗抑郁药提供了新靶点，为抑郁症的防治提供新的思路与依据，具有较强的应用前景。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为实施例1的实验流程图；
19.图2为实施例1的实验小鼠的行为学检测数据统计：其中图2a为体重变化；图2b为糖水消耗率；图 2c为tst不动时间；图2d为fst不动时间；
20.图3为实施例1的小鼠海马pde4d mrna的水平；
21.图4为实施例1的小鼠海马pde4d蛋白的水平；
22.图5为实施例1的小鼠海马组织mirna测序热图；
23.图6为实施例1的小鼠海马组织mirna测序火山图；
24.图7为实施例1的采用rt-qp cr技术验证差异表达的mirna；
25.图8为实施例1的mir-139-5p与pde4d结合位点；
26.图9为实施例1的mir-139-5p和pde4d mrna双荧光素酶基因报告；
27.图10为实施例1的小鼠海马中mir-139-5p和pde4d mrna的定位；
28.图11a为实施例2的转染后对ht-22细胞基因表达的影响；图11b为转染后对ht-22细胞蛋白表达的影响；
29.图12a为实施例2的转染后对ht-22细胞中pde4d蛋白表达的影响；图12b为转染后对ht-22细胞中p-creb蛋白表达的影响；
30.图13a为实施例2的转染后对ht-22细胞中bdnf蛋白表达的影响；图13b为实施例2的转染后对ht-22细胞中creb蛋白表达的影响；
31.图14实施例3的实验流程图；
32.图15a为实施例3的aav-mir-139-5p载体结构；图15b为实施例3的aav-mir-139-5p sponge载体结构；
33.图16a为实施例3的海马立体定位注射部位示意图；图16b为实施例3的海马立体定位注射效果；图 16c为实施例3的立体定位注射后海马组织的mir-139-5p的表达水平；
34.图17a为实施例3的海马立体定位注射aav后spt改变；图17b为实施例3的海马立体定位注射 aav后tst改变；图17c为实施例3的海马立体定位注射aav后fst改变；
35.图18a为实施例3的注射aav后小鼠海马组织camp的表达水平；图18b为实施例3的注射aav 后小鼠海马组织蛋白的表达水平；图18c注射aav后小鼠海马组织pde4d蛋白的表达水平；
36.图19a为实施例3的注射aav后小鼠海马组织p-creb蛋白的表达水平；图19b为实施例3的注射 aav后小鼠海马组织bdnf蛋白的表达水平；图19c为实施例3的注射aav后小鼠海马组织creb蛋白的表达水平；
37.图20为实施例3的注射aav后对小鼠海马组织神经发生的影响；
38.图21a实施例3的注射aav后对小鼠海马组织brdu的影响；图21b为实施例3的注射aav后对小鼠海马组织dcx的影响；图21c为注射aav后对小鼠海马组织nestin的影响；
39.图22为本发明机制示意图。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1：本实施例通过构建抑郁症小鼠模型，通过mirna基因测序和生信分析，筛选靶向pde4d mrna的mirnas；并且采用luciferase基因报告实验和fish实验，验证目的mirna和pde4d mrna 的靶向结合关系和细胞定位。
42.1.cums造模及行为学检测
43.取spf级c57bl/6j的小鼠20只，8-12周，20
±
2g，雌雄各半，购买并饲养于南方医科大学实验动物管理中心：单位许可证号syxk(粤)2018-0001；饲养环境许可证syxk(粤)2018-0001。饲养环境安静、通风，无特定病原菌，温度21
±
2℃，湿度55
±
5％，光照/黑暗周期为12小时。将动物分成5只/笼，适应性饲养1周，自由摄食和饮水，普通饲料由南方医科大学实验动物管理中心提供。所有动物研究均经南方医科大学国家动物保健与伦理委员会批准(伦理审查编号：l2019114)
44.将所有小鼠按性别和体重随机分为2组，10只/组：(1)正常对照(control)组，自由摄食饮水；(2) cums组，接受cums程序进行造模。流程图如图1所示.
45.本实施例主要采用bio-tst4悬尾系统；bio-fst-dsm小鼠强迫游泳系统；xs205du精密电子天平等仪器；主要实验耗材有蔗糖、生理盐水、蒸馏水等。
46.1.1建模方法
47.cums造模包括以下9种刺激：
①
禁食24h
②
禁水24h
③
空瓶1h
④
笼具45
°
倾斜7h
⑤
照明过夜
⑥
潮湿垫料24h
⑦
在4℃的水中游泳5min
⑧
异物刺激24h
⑨
束缚制动4h。在1周内随机运用以上刺激，连续6周。造模结束后，由2名经过训练且经验丰富的观察员进行行为学检测。
48.1.1.1观察小鼠体重及进行行为学检测
49.(1)记录小鼠体重：每周称量所有小鼠体重1次，均在早上8：00进行，并根据体重调整cums强度，造模结束后分析比较2组小鼠的体重变化情况。
50.(2)糖水偏好实验(spt)：为避免误差，本实验分别在造模前、造模3周后和6周后均
进行了该实验。方法为：经第1天的适应和第2天的禁水禁食后，第3天将其中1个饮水瓶溶液更换为1％蔗糖溶液，另1个饮水瓶仍装有蒸馏水，2个饮水瓶称重后重新放回鼠笼相应的位置，记录4h后2个水瓶的重量，并计算小鼠糖水的偏好分数：糖水偏好分数＝(糖水消耗量/总液体消耗量)
×
100％。
51.(3)悬尾实验(tst)：小鼠适应环境后，把小鼠倒置束缚在悬尾仪上，且距离地面20cm，持续6min，记录后4min小鼠的不动时间(为小鼠不动的时间大于或等于2s者，s)。
52.(4)强迫游泳实验(fst)：适应环境后，将小鼠轻轻放入水深20cm的透明玻璃游泳桶(直径＝15cm，高度＝35cm)中，记录6min，计算后4min内小鼠的不动时间(为小鼠为了保持浮在水面而做的轻微动作以及持续超过2秒没有任何动作的时间，s)。实验过程中保持水温为22
±
2℃。
53.ˉ
54.数据通过使用spss 20.0软件进行统计分析，采用非配对t检验分析方法，结果以x
±
sem表示。p《0.05 即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。用graphpad prism 8.0软件进行作图。
55.结果见图2、表1至表3所示，造模后，与正常对照组相比，cums组小鼠出现抑郁样行为：(1)体重减轻(t值＝3.269，p《0.05)；(2)糖水消耗率明显降低(t值＝2.706，p《0.01)；(3)不动时间显著延长：t值tst＝6.428，p
tst
《0.01；t值fst＝3.182，p
fst
《0.05。
56.表1：2组小鼠体重变化(g，n＝10)
[0057][0058]
表2：2组小鼠的糖水消耗率比较(n＝10)
[0059][0060]
表3：2组小鼠的不动时间比较(s，n＝10)
[0061][0062]
*
p《0.05，
**
p《0.01vs.正常对照组
[0063]
2.cums模型组中pde4d的表达水平
[0064]
本实验中采用的仪器主要有68707小鼠脑切片模具；genequant rna/dna定量分析仪；4342718pcr 扩增仪；mx3005p实时荧光定量pcr仪；infinity/bio-vision紫外凝胶成像系统；3k15高速低温离心机；
[0065]
2.1主要溶液的配制
[0066]
(1)0.1％depc水：取1ml depc水加入1l ddh2o中混匀，室温保存12h备用。
[0067]
(2)无rna酶水：取1ml depc水加入1l ddh2o中混匀，室温放置过夜后经120℃高压灭菌20min，分装后置4℃保存备用。
[0068]
(3)无rna酶75％乙醇溶液：按无水乙醇：无rna酶水＝3：1比例混匀，现配现用。
[0069]
(4)0.5
×
tbe缓冲液：按5
×
tbe缓冲液：无rna酶水＝1：9比例稀释即可，常温保存备用。
[0070]
2.2引物设计
[0071]
引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，引物序列如下表4。
[0072]
表4：
[0073][0074]
3 pde4d mrna的差异表达检测
[0075]
3.1小鼠海马组织的收集
[0076]
处死小鼠，断头开颅取脑，迅速将鼠脑放入冰水中，待大脑降温变硬后，将鼠脑放入脑切片模具中，并按照小鼠大脑立体定位图谱进行定位，取出海马组织放置在1.5ml的离心管中。
[0077]
3.2小鼠海马组织总rna的提取及质量检测
[0078]
(1)采用trizol法提取总rna：于离心管内加液氮粉碎研磨后，加0.5mltrizol裂解组织，手动剧烈震荡15秒。加入0.2ml的氯仿后室温静置10min，12000rpm、4℃离心15min。离心后混合液体将分为上层无色水相(总rna全部被分配于水相中)，中间层和下层红色酚氯仿相。将上层水相转移到一干净无 rna酶的离心管中，加等体积异丙醇混合以沉淀其中的rna，混匀后室温静置10min，12000rpm、4℃离心10min。弃上清，每0.5mltrizol试剂裂解的样品中加入至少0.5ml的75％乙醇，清洗rna沉淀。震荡混匀后，7000rpm、4℃离心5min。吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10min。加入 20μl无rna酶的水，用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用，或立即用于逆转录。
[0079]
(2)采用紫外吸收法进行质量检测：予稀释用的te溶液将分光光度计调零后，取少量rna溶液用 te稀释(1:100)，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液浓度和纯度。
[0080]
3.3按照takara逆转录试剂盒说明书进行检测，反应体系如下表5。
[0081]
表5：
[0082][0083]
即为cdna溶液，保存于-80℃待用，或者立即做目的基因测定。
[0084]
按照takara荧光定量试剂盒说明书进行检测，其反应体系和程序。
[0085]
数据通过使用spss 20.0软件和graphpad prism 8.0软件进行统计分析及作图，采用非配对t检验分析方法，结果以表示。p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。
[0086]
结果见图3、表6，与正常对照组相比，pde4d mrna在cums组海马组织的表达上调(t＝10.74， p＝0.00044)。而gapdh mrna表达在各组间的差异无统计学意义(t＝6.65，p＝0.0785)。
[0087]
表6：小鼠海马pde4d mrna的水平(ng/ul,n＝3)
[0088][0089]
***
p《0.001vs.正常对照组
[0090]
4 pde4d蛋白的表达水平分析
[0091]
本实验中采用的主要仪器有：68707小鼠脑切片模具；hs-50超声裂解仪；3k15高速低温离心机； elx808酶标仪；1658033微型电泳电转移系统；is 2000mm image station多功能成像系统；
[0092]
4.1主要溶液的配制
[0093]
(1)10％十二烷基硫酸钠(sds)溶液：称取10g sds粉末，用蒸馏水定容至100ml，常温放置备用。
[0094]
(2)10％过硫酸铵(aps)溶液：称取10g aps粉末，用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。
[0095]
(3)1
×
电泳液：称量30g甘氨酸、30.3g三羟甲基氨基甲烷和10g sds粉末，加入800ml去离子水，搅拌溶解后，用去离子水定容至1000ml，此为10
×
电泳液，4℃保存备用。用的时候按10
×
电泳液：去离子水＝1：9的比例配成1
×
电泳液即可。
[0096]
(4)1
×
转膜液：称量30g甘氨酸和30.3g tris粉末，加入800ml去离子水，搅拌溶解后，用去离子水定容至1000ml，此为10
×
转膜液，4℃保存备用。用的时候按10
×
电泳液：去离子水＝1：7的比例，再加200ml甲醇溶液定容至1000ml，即是1
×
转膜液。
[0097]
(5)10
×
缓冲液(tbs)溶液：称量24.2g tris-base和80g nacl，加去离子水定容至化，用浓hcl 调ph至7.6即可，4℃保存备用。
[0098]
(6)1
×
tbst溶液：为按10
×
tbs：去离子水＝1：9的比例配成1
×
tbs溶液后，再加
1ml tween-20，搅拌溶解，常温保存备用。
[0099]
(7)封闭液——5％胎牛血清蛋白(bsa)溶液：称量5g bsa粉末，用1
×
tbs溶液定容至100ml，搅拌溶解，4℃保存备用。
[0100]
(8)配胶(见表7)
[0101]
表7：
[0102][0103]
4.2小鼠海马组织蛋白的提取
[0104]
将300ml ripa裂解液加入装有脑组织的离心管，震荡后置冰上，用超声裂解仪裂解。于4℃冰箱静置30min及以上，然后12000rpm、4℃离心15min。取上清，即为小鼠脑组织的总蛋白质，分装后置于
ꢀ‑
80℃保存备用。使用前应用bca蛋白定量试剂盒定量各样品蛋白浓度。
[0105]
4.3蛋白免疫印迹(wb)步骤
[0106]
(1)配胶：确认装玻璃板不漏水后，将配好的11％下胶加入玻璃板内，用异丙醇溶液封住，室温静置30min及以上。待下胶完全凝固后，倒出异丙醇，加入配好的5％上胶，插梳子，待凝备用。
[0107]
(2)蛋白变性：根据bca试剂盒测得的蛋白浓度计算蛋白上样量，按比例与5
×
sds上样缓冲液混合，置变性仪98℃蛋白变性4min。
[0108]
(3)上样：上胶凝固后，将玻璃板装入电泳板支架，放入电泳槽恰位，内槽加满1
×
电泳液，外槽按水位标志添加，轻柔均匀拔出梳子。在各泳道加入等量的蛋白变性后样本，两边各留泳道加marker约3-5ul。
[0109]
(4)电泳：开始时，跑胶电压为80v，约30mim，待样品跑成一条直线后，调整电压为120v，约 90min。当marker跑至电泳板底部边缘时，停止电泳并取出玻璃板，回收电泳液。
[0110]
(5)湿转法转膜：去掉上胶，将下胶浸泡在预冷的1
×
转膜液中15min。将预先剪裁好的pvdf膜浸泡在甲醇溶液至半透明，以增强其通透性。在转膜夹上依次叠放凝胶-pvdf膜等，确认凝胶与pvdf膜对位吻合，赶走所有气泡被后夹紧转膜夹，放入转膜槽中(白对红，黑对黑)。在转膜槽内加入大小适当的冰块，往转膜槽加满预冷的1
×
转膜液，加上转膜盖后置于冰盒中，加冰覆盖转膜槽。装好转膜仪的正负极 (红对红，黑对黑)，接通电源，设定电流为95ma，时长根据蛋白分子量大小进行调整，一般约90-120 min。
[0111]
(6)封闭：把转好的pvdf膜取出浸泡在5％bsa溶液中，置水平摇床上于室温封闭2h。
[0112]
(7)一抗孵育：用抗体稀释液或者2.5％bsa溶液按比例(gapdh-1:2000，pde4d-1:1000)稀释一抗，4℃保存备用。取出封闭好的pvdf膜，浸泡在相应的一抗中，于4℃冰箱摇床上孵育过夜。
[0113]
(8)二抗孵育：回收一抗，然后用1
×
tbst溶液洗膜，摇床上洗脱3次，每次5-10min。后将pvdf 膜浸泡在适当浓度的二抗(抗兔为1:2000，抗小鼠为1:2000)，置4℃冰箱摇床上孵育2h，随后洗膜3 次。
[0114]
(9)曝光：提前半小时预热曝光仪。将等量ecl试剂盒中的a液和b液混合，现用现配。条带与a、 b混合液充分接触后尽快将条带放入于kodak image station多功能成像系统曝光，获取并保存目的条带图像。
[0115]
4.4图像处理：用quantity one软件分析目的条带图像。
[0116]
数据通过使用spss 20.0软件进行分析，graphpad prism 8.0软件作图，结果以表示。统计分析采用非配对t检验，p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。
[0117]
结果见图4、表8，与正常对照组相比，cums模型组的pde4d蛋白表达显著升高(t＝8.542，p＝0.0001)
[0118]
表8：小鼠海马pde4d蛋白的灰度值(n＝4)
[0119][0120]
***
p《0.001vs.正常对照组
[0121]
5 mir-139-5p与pde4d mrna的靶向结合关系
[0122]
按照上述方法构建cums小鼠模型，并将空白对照组和cums组小鼠海马组织委托华大基因进行 mirna基因测序。生信分析结果显示：(1)相较于上调的mirnas，下调的mirnas差异性更突出(见图5)；(2)下调的mirnas中，mir-139-5p、mir-335-5p、mir-340-5p、mir-7-5p、mir-103a-3p、mir-19b-3p、 mir-18a-5p和mir-16-5p表达差异性最大，mir-139-5p尤甚(见图5和图6)。(3)通过qpcr验证，发现mir-139-5p最具有显著性差异(见图7)。(4)进一步使用targetscan和mirbase软件，找到了mir-139-5p 与pde4d结合位点(见图8)。
[0123]
5.1验证mir-139-5p与pde4d mrna的靶向结合关系
[0124]
本实验中采用的主要仪器有elx808酶标仪；5418离心机；hcb-1300v超净工作台；采用的主要试剂有dmem培养基、胰酶、lipofectamine
tm 2000试剂盒、双萤光素酶报告基因检测试剂盒。
[0125]
本实验操作过程为：293t细胞常规培养于37℃，5％的co2的条件下。取对数生长期的293t 细胞，以每孔1.5
×
104细胞接种于96孔板中，每孔总体积100μl，于37℃培养箱中培养24h。取10μlopti-mem培养基稀释mirna mimics或non-target control，15μl opti-mem培养基稀释靶基因3
’ꢀ
utr双报告基因载体或突变载体，25μl opti-mem培养基稀释0.25μl lipofectamine
tm 2000试剂， 5min后三者混合，共50μl，轻轻摇匀，静置20min。将质粒、mimics加入细胞前，每孔先吸走50 μl培养基，然后再加入上述50μl混合液，最终每孔总体积100μl。其中mimics转染浓度均为50nm，质粒浓度为100ng/孔，每组设3个复孔。6h后再加100μl新鲜培养基。将报告基因细胞裂解液充分混匀后，加入100ul报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。每个样品测定时，取样品20-100μl。加入100μl萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀混匀后测定rlu(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。在完成
上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100μl海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀后测定rlu。
[0126]
数据通过使用spss 20.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析方法，并根据实验设计进行 tukey多重比较检验分析。结果以表示。p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。用graphpad prism 8.0软件作图。
[0127]
结果见图9，一般情况下，mirna mimics跟阴性对照(negative control，nc)组相比，报告荧光下调20％或以上；且相应结合位点突变后，mirna mimics对突变型载体报告荧光的抑制程度明显降低或消失，则认为mirna mimics可通过该位点调控报告基因的表达。luciferase分析显示， mir-139-5p mimic对pde4d野生型载体的报告荧光有明显下调作用，相应结合位点突变后，突变型载体中的报告荧光无明显变化。说明在该实验模型下，mmu-mir-139-5p是能通过pde4d上相应的3
’ꢀ
utr位点调控报告基因的表达。
[0128]
5.2小鼠海马组织切片原位杂交(fish)实验
[0129]
本实验中采用的主要仪器有：cm1950冰冻切片机；lbp-3696全自动分子杂交仪；a1r激光扫描共聚焦显微镜；syg-1210恒温水浴锅。
[0130]
实验过程如下：(1)组织切片：鼠灌注取脑，固定脱水处理后，于冰冻切片机切片，脑片厚度为40um。(2)脱蜡：二甲苯脱蜡3次，每次5min；100％酒精2次，每次2min；移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。(3)蛋白酶处理：37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶k溶液(40 ml)，孵育20min后，予2
×
ssc在室温下漂洗切片3次，每次1min。梯度酒精脱水(-20℃预冷)。 (4)变性：每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；78℃孵育8min；即移入-20℃预冷70％酒精的染色缸内2min，再依次移入80％、90％和100％的-20℃预冷酒精内，每缸2min；空气干燥。(5)杂交：准备探针；取一个较大的湿盒，交叉放置切片；滴 10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；盖上湿盒盖，37℃孵育12-16h。镊子小心去除盖玻片，43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；2
×
ssc(37℃)洗两次，每次10min；切片放人染色缸的1
×
pbs内待检测，勿使切片干燥。从1
×
pbs中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。每张切片使用30-60μl罗丹明抗-地高辛抗体或fitc卵白素，室温下孵育20min；去掉塑料盖膜，把切片放入含1
×
pbs的染色缸。1
×
pbs室温下洗3次，每次2min。从1
×
pbs中取出切片，斜置切片使液体排出；每张切片滴30-60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；去掉塑料盖膜，把切片放人含1
×
pbs的染色缸。1
×
pbs室温下洗3次，每次2min；从1
×
pbs中取出切片，斜置切片使液体排出；每张切片滴30-60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；1
×
pbs室温下洗3次，每次2min。(6)细胞核染色：每张切片加10-20μl dapi，覆盖盖玻片并在室温下孵育2-5ml。尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
[0131]
结果见图10，过荧光原位杂交对mir-139-5p和pde4d mrna表达的分析表明，mir-139-5p位于小鼠海马细胞的细胞核中，而pde4d mrna存在于细胞质中。
[0132]
实施例2：本实施例采用mir-139-5p mimic或mir-139-5p inhibitor转染小鼠海马神经元ht-22细胞，使mir-139-5p在细胞内过表达或抑制表达，然后检测转染后对细胞的基因(mir-139-5p、pde4d和bdnfmrna)及蛋白(pde4d、p-creb和bdnf等)的影响，以验证细胞水平上，mir-139-5p可通过靶向pde4dmrna上调bdnf水平的信号通路。
[0133]
1.转染后对ht-22细胞中mir-139-5p、pde4d和bdnf基因表达的影响
[0134]
本实验中采用的主要仪器有：5418离心机；hcb-1300v超净工作台；genequant rna/dna定量分析仪；4342718pcr扩增仪；mx3005p实时荧光定量pcr仪。
[0135]
本实验采用的主要试剂有：ht-22细胞、dmem培养基、胎牛血清蛋白、胰酶、rna逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒。
[0136]
转染质粒由广州市锐博生物科技有限公司合成，序列见表9。
[0137]
表9：
[0138][0139]
引物序列见表10。
[0140][0141]
1.1转染操作过程
[0142]
(1)细胞培养及转染：小鼠海马神经元ht-22细胞培养在含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的 dmem培养基，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中培养，隔2天传代1次。当细胞浓度达到50％时可进行转染。将ht-22细胞分为control组、nc组、mir-139-5p mimic组和mir-139-5p inhibitor组，每组设3个复孔。将ht-22细胞加在12孔板中，然后用予100nm control、100nm nc、50nm mir-139-5p mimic 或100nm mir-139-5p inhibitor载体与lipofectamine 3000共转染，处理时间24h。成功转染的ht-22细胞用于后续各项实验。(2)qpcr实验分析转染后ht-22细胞的基因表达变化：参考实施例1过程。
[0143]
数据使用spss 20.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析方法，并根据实验设计进行tukey多重比较检验分析。结果以表示。p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。用 graphpad prism 8.0软件作图。
[0144]
结果见图11a和表11，与control组相比，mir-139-5p mimic组的细胞中，mir-139-5p(f值＝399.8， p《0.001)和bdnf mrna(f值＝27.01，p《0.001)的水平上调，但下调了pde4d mrna(f值＝62.58， p《0.001)的表达。相反地，mir-139-5p inhibitor显著抑制了mir-139-5p的表达，也下调了bdnf mrna 的水平，却显著上调了pde4d mrna的表达。在3个目的基因的分析中，均未见control组和nc组间存在统计学差异。
[0145]
表11：转染后对ht-22细胞基因表达水平(ng/ul,n＝3)
[0146][0147][0148]
*
p《0.05,
***
p《0.001vs.control组；
***
p《0.001vs.mir-139-5p mimic组。
[0149]
1.2转染后对ht-22细胞中camp/pka/creb信号通路的影响
[0150]
本实验仪器及试剂参考实施例1中关于wb实验。
[0151]
本实验抗体见表12。
[0152]
表12：
[0153][0154]
数据统计参考本实施例1.1。
[0155]
结果见图11b、图12、图13、表13所示，与control组相比，mir-139-5p mimic组的细胞中，pde4d 蛋白表达被显著抑制(f值＝61.49，p《0.001)，p-creb(f值＝110.50，p《0.001)和bdnf(f值＝91.20， p《0.001)蛋白表达上调。mir-139-5p inhibitor组得到相反的结果。各组中的creb蛋白表达未见差异(f 值＝0.75，p＝0.55)。control组和nc组间不存在统计学差异。
[0156]
表13：转染后ht-22细胞蛋白表达水平(n＝3)
[0157][0158]
***
p《0.001vs.control组；
##
p《0.01，
###
p《0.001vs.mir-139-5p mimic组。
[0159]
实施例3：本实施例通过立体定位注射技术将以腺病毒相关病毒为载体的mir-139-5p(aav
‑ꢀ
mir-139-5p)和mir-139-5p sponge(aav-mir-139-5p sponge)注入cums模型小鼠海马，验证mir-139-5p 的抗抑郁功效。
[0160]
1.小鼠海马立体定位注射aav对小鼠行为学的影响
[0161]
本实验采用的主要仪器有：69100立体定向仪器和加热垫；omnidrill35牙科钻；
lsp02-2b微量注射泵；bio-tst4悬尾系统；bio-fst-dsm小鼠强迫游泳系统。
[0162]
本实验的以avv为载体的aav-mir-139-5p、aav-mir-139-5p sponge)为委托广州基旦生物科技有限公司构建，载体结构分别见图15a和图15b，浓度均为6.0
×
10
12
viral gene/ml。
[0163]
取spf级c57bl/6j的小鼠40只，8-12周，20
±
2g，雌雄各半，购买并饲养于南方医科大学实验动物管理中心：单位许可证号：syxk(粤)2018-0001；饲养环境许可证：syxk(粤)2018-0001。饲养环境安静、通风，无特定病原菌，温度21
±
2℃，湿度55
±
5％，光照/黑暗周期为12小时。将动物分成5只/ 笼，适应性饲养1周，自由摄食和饮水，普通饲料由南方医科大学实验动物管理中心提供。所有动物研究均经南方医科大学国家动物保健与伦理委员会批准(伦理审查编号：l2019114)。
[0164]
将所有小鼠按性别和体重随机分为4组，10只/组：(1)control组，自由摄食饮水；(2)cums组，接受cums程序进行造模。(3)cums aav-mir-139-5p(aav-mir-139-5p)组，cums造模后通过立体定位海马注射aav-mir-139-5p；(4)cums aav-mir-139-5p sponge(aav-sponge)组，cums造模后通过立体定位海马注射aav-mir-139-5p sponge。实验流程见图14。
[0165]
1.1本实验的实验过程
[0166]
(1)小鼠双侧海马区立体定位注射：用氯胺酮(0.1ml/100g，100mg/kg)，甲苯噻嗪(0.01ml/100g， 2mg/kg)和咪达唑仑(0.05ml/100g，0.5mg/kg)的组合麻醉小鼠，然后腹腔内给予适合体重(0.1ml/10g) 的麻醉。麻醉小鼠后将其固定在立体定向仪，通过立体定位仪定位海马(ap:-1.70mm；ml:
±
1.0mm；dv:
ꢀ‑
2.00mm)，并使用牙科钻开孔和微量注射器注射。其中，aav-mir-139-5p组注射aav-mir-139-5p，1ul/ 只/次；aav-mir-139-5p sponge组注射aav-mir-139-5p sponge，1ul/只/次；正常对照组和cums组小鼠注射等剂量0.9％nacl溶液。注射后，缝合所有小鼠头部伤口，用抗生素涂抹手术伤口并且皮下注射酮洛芬。然后将所有动物放在加热灯下，待其麻醉中恢复后放回鼠笼，观察小鼠的精神状态。立体定位注射 aav部位示意图见图16a。
[0167]
(2)行为学检测，方法参考实施1。
[0168]
(3)采用qpcr法检测注射后小鼠海马组织内aav-mir-139-5p的水平，步骤同上。
[0169]
数据通过使用spss 20.0软件进行统计分析，注射后分析小鼠海马内mir-139-5p的表达水平采用非配对t检验分析方法；行为学检测分析采用单因素方差分析方法，并根据实验设计进行tukey多重比较检验分析。结果以表示。p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。用graphpad prism8.0软件作图。
[0170]
结果见附图16b、16c、表14所示，通过立体定位注射成功地将aav病毒载体注射进入小鼠双侧海马内。并通过qpcr法发现，注射后aav-mir-139-5p后，小鼠海马组织的mir-139-5p表达水平显著升高 (t＝8.376，p＜0.001)
[0171]
表14：小鼠海马注射aav后mir-139-5p的表达水平(n＝3)
[0172][0173]
[0174]
并且注射后小鼠行为学结果见图17，如图17a显示，与control组相比，cums组小鼠的糖水消耗率明显降低(p＜0.01)；而注射aav-mir-139-5p后，小鼠的糖水消耗率明显较cums模型组增加(p ＜0.01)；相反的，给予aav-mir-139-5p sponge干预后，小鼠糖水消耗率则降低(p＜0.05)。
[0175]
图17b显示了在tst测试中，cums组小鼠的不动时间均显著高于control组(p《0.001)。而 aav-mir-139-5p组小鼠的不动时间明显减少(p《0.01)，aav-mir-139-5p sponge组却升高(p《0.05)。
[0176]
图17c显示了在fst测试中，cums组小鼠的不动时间均显著高于control组(p《0.001)。注射了aav-mir-139-5p后小鼠的不动时间明显减少(p《0.01)，注射了aav-mir-139-5p sponge的小鼠不动时间却升高了(p《0.05)。
[0177]
2.aav病毒对小鼠海马组织camp/pka/creb通路的影响
[0178]
本实验采用的主要的仪器有：elx808酶标仪；hs-50超声裂解仪；3k15高速低温离心机；1658033 微型电泳电转移系统；is 2000mm image station多功能成像系统；
[0179]
本实验采用的主要试剂有：csb-e15860m小鼠camp elisa试剂盒；pd4-401ap pde4d抗体 (1:500)；9198p-creb抗体(1:1000)；ab203573bdnf抗体(1:1000)；ab203573bdnf抗体(1:1000)； 9197creb抗体(1:1000)；abs16 gapdh抗体(1:2000)。
[0180]
2.1本实验的试验过程
[0181]
(1)elisa法检测各组小鼠海马组织的camp水平：按照小鼠camp elisa试剂盒说明书进行操作：各种试剂先置室温下平衡30min。分别加标准品或样品100ul/孔，水平轻轻摇动混匀，贴上板贴，37℃恒温孵箱孵育2h。弃去酶标板孔内液体：将推荐的洗涤缓冲液按200ul/孔注入孔内，浸泡2min。随后在实验台上覆盖几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次，不用洗涤。加生物素标记抗体工作液，100ul/孔，贴上新的板贴，37℃恒温孵箱孵育1h。弃去酶标板孔内液体后，加hrp工作液，100ul/孔，贴上新的板贴，37℃恒温孵箱孵育1h。弃去酶标板孔内液体，按顺序加底物显色溶液tmb，90ul/孔，37℃避光显色15-30min。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度变化的蓝色，后3-4孔显色不明显时，即按顺序加入终止反应溶液(50ul/孔)，终止反应，此时蓝色立即转变为黄色。在反应终止5min内，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的od值。
[0182]
(2)wb法检测各组小鼠海马组织中pde4d、p-creb、bdnf和creb的蛋白表达量，方法参考实施例1。
[0183]
数据通过使用spss 20.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析方法，并根据实验设计进行tukey 多重比较检验分析。结果以表示。p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。用 graphpad prism 8.0软件作图。
[0184]
结果见18a、表15，elisa分析结果显示：与control组相比，cums组小鼠海马组织中camp水平显著降低(p《0.01)，而aav-mir-139-5p可升高海马camp的水平(p《0.001)，aav-mir-139-5p sponge 却降低了camp的水平(p《0.05)。
[0185]
表15：注射aav后小鼠海马组织camp的表达水平(n＝3)
[0186][0187]
**
p《0.01vs.control组；
#
p《0.05，
###
p《0.001vs.cums组。
[0188]
图18b、图18c、图19显示，wb结果表明，与control组相比，cums组小鼠的海马区中pde4d 蛋白表达明显升高(p《0.001)，p-creb(p《0.01)和bdnf(p《0.001)蛋白表达下调。aav-mir-139-5p sponge则加重以上病理改变。而aav-mir-139-5p可逆转这种病理现象：显著抑制pde4d蛋白表达 (p《0.01)，上调p-creb(p《0.01)和bdnf(p《0.01)蛋白表达。各组中的creb蛋白表达未见差异。
[0189]
3.aav病毒对小鼠海马神经发生的影响
[0190]
本实验采用的主要仪器有：cm1950冰冻切片机；a1r激光扫描共聚焦显微镜；
[0191]
本实验采用的主要试剂有：5292brdu抗体(1:500)；4604dcx抗体(1:300)；33475nestin抗体 (1:1000)；4408anti-mouse igg(h l),f(ab')2fragment(alexa488conjugate)荧光二抗；8889 anti-rabbit igg(h l),f(ab')2fragment(alexa594conjugate)荧光二抗。
[0192]
本实验的操作过程：
[0193]
采用免疫荧光染色(immunofluorescence，if)方法检测小鼠海马神经发生标志物brdu、nestin和dcx 蛋白荧光的表达水平。小鼠深度麻醉后灌注取全脑，在甲醛中固定8h后以清水冲水1h，接着将全脑浸入 30％蔗糖溶液脱水。待脑组织沉入瓶底后，冰冻切片机切片(厚度为40um)。0.1m pbs漂洗3遍，每次 3min。用含0.5％triton-100的10％bsa于25℃封闭1h，分别加入适当比例的brdu、nestin和dcx抗体，4℃孵育过夜。次日，用0.1m pbs漂洗脑片后，分别避光加入荧光二抗，常温孵育1h。再次漂洗后，将脑片倒入0.1m pbs溶液中，载玻片上贴片，滴加dapi溶液，以透明指甲油封片，共聚焦显微镜拍照并合成图片。用图像处理软件nis viewer分析目的免疫荧光图像，对4组小鼠海马brdu、nestin和 dcx蛋白荧光强度表达进行统计分析。
[0194]
数据使用spss 20.0软件和graphpad prism 8.0软件进行统计分析和作图，结果以表示。统计分析采用单因素方差分析方法，并根据实验设计进行tukey多重比较检验分析，p《0.05即被认为数据间存在显著性差异，即有统计学意义。
[0195]
结果见附图20至21，通过if方法检测分析，发现：cums组小鼠的海马中brdu(p《0.001)、nestin (p《0.001)和dcx(p《0.001)蛋白荧光表达强度较control组相比显著减少；aav-mir-139-5p可提升海马神经的brdu(p《0.01)、nestin(p《0.01)和dcx(p《0.01)蛋白荧光强度，并与cums组间存在显著性差异；aav-mir-139-5p sponge却减少海马神经元的brdu(p《0.05)、nestin(p《0.05)和dcx(p《0.05) 蛋白荧光强度。
[0196]
通过实施1至实施3的实验的结论：
[0197]
(1)mir-139-5p可靶向结合pde4d mrna：复制cums抑郁症小鼠，发现该模型组小鼠
海马组织 pde4d表达升高；通过生信分析，筛选出差异表达且靶向pde4d mrna的mir-139-5p；采用luciferase 基因报告实验证实mir-139-5p可靶向结合pde4d mrna；且fish结果显示，mir-139-5p位于细胞核内，而pde4d位于细胞质中。
[0198]
(2)mir-139-5p通过靶向pde4d mrna，激活camp/pka/creb信号通路，上调ht-22细胞的bdnf 表达水平：采用mir-139-5p mimic和inhibitor转染小鼠海马神经元ht-22细胞，结果显示：mir-139-5p mimic 可下调pde4d水平，激活camp/pka/creb信号通路，促进creb磷酸化，上调bdnf表达；mir-139-5p inhibitor则起到相反的作用。
[0199]
(3)mir-139-5p可通过抑制pde4d mrna，激活camp/pka/creb信号通路，上调小鼠海马的bdnf 表达水平，促进海马神经发生，发挥抗抑郁的作用：通过立体定位注射分别将aav-mir-139-5p和aav
‑ꢀ
mir-139-5p sponge注入cums小鼠海马，结果显示：aav-mir-139-5p可通过抑制pde4d mrna，激活 camp/pka/creb信号通路，上调bdnf表达水平，促进海马神经发生，发挥抗抑郁的作用。aav
‑ꢀ
mir-139-5p sponge则发挥相反的作用。
[0200]
通过实施例1至实施例3的实验，可以看出mir-139-5p可对抑郁症进行明显的改善(其机制示意图见图22)，并且与现有pde4d的抑制剂进行比较，如roflumilast和apremilast，本发明的mir-139-5p/pde4d mrna相互作用会阻碍pde4d蛋白合成并启动pde4d mrna降解，此会减少药物副作用。
[0201]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。