一种miRNA及其应用

一种mirna及其应用
技术领域
1.本发明属于昆虫防治技术领域，具体涉及一种mirna及其应用。


背景技术：

2.microrna(mirnas)是一类广泛的单链非编码rna，长度为19
–
24个核苷酸，在转录后水平负调控基因表达。由在秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)中发现lin-4开始，在植物、动物和其他真核生物中已鉴定出数千个mirna。通过互补碱基配对的原则，mirnas可以有效抑制靶mrna(信使rna)的翻译或介导其降解。单个mirna通常能够识别数百个不同的mrna转录本。同样，一个mrna分子通常具有多个mirna结合位点，而与单个mrna结合的mirna通常以协同方式发挥作用。mirna在广泛的生物学过程中发挥着关键作用，包括发育时间、细胞分化、增殖、凋亡和代谢。
3.在相关技术中，植物源mirna被报道能穿过动物严格的胃肠道屏障，进入血液循环，并进一步通过调节各种组织中的基因表达发挥生物学功能。水稻源的mir168a被证明能够通过进食进入哺乳动物的血液中调节小鼠的ldlrap1以改变小鼠的生理状态；金银花源的mirna有助于小鼠抵抗病毒；植物源mir167e-5p可以靶向小鼠的β-catenin进一步抑制肠道上皮细胞的增殖。这些研究表明，植物源mirna的摄入可能有助于动物的生理变化。但是在植物源mirna与昆虫互作关系的研究极少，更没有报道发现具备防治害虫的植物源mirna。
4.褐飞虱是一种单食性的半翅目昆虫，具备远距离迁飞的习性，是当前水稻上的首要害虫，主要通过其刺吸式口器吸食水稻的韧皮部汁液，同时还会传播多种水稻病害。目前对防治褐飞虱的靶标基因开发已有很多，但可用于防治褐飞虱的mirna小分子极少，更没有以植物源mirna形式对褐飞虱进行防治的研究报道。
5.本背景技术中所陈述内容并不代表承认其属于已公开的现有技术。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种mirna，该mirna能够有效应用于昆虫防治。
7.本发明还提出一种与上述mirna相关的生物材料。
8.本发明还提出一种上述mirna或上述生物材料的应用。
9.本发明还提出一种昆虫防治方法。
10.根据本发明的一个方面，提出了一种mirna，所述mirna的核酸序列如seq id no.1～2中任一种所示或为seq id no.1～2中任一种所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。
11.在本发明的一些实施方式中，所述mirna为玉米源的mirna。
12.根据本发明的第二方面，提出了一种与上述mirna相关的生物材料，所述生物材料为1)～4)中任一种：
13.1)权利要求1所述的mirna前体；
14.2)权利要求1所述的mirna模拟物；
15.3)编码权利要求1所述的mirna或1)中所述的mirna前体的dna分子；
16.4)含有3)中所述的dna分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
17.根据本发明的第三方面，提出了一种上述mirna或上述生物材料的应用，所述应用为在昆虫防治中的应用。
18.在本发明的一些实施方式中，所述应用为杀灭昆虫虫体和/或抑制昆虫虫体的生长。
19.在本发明的一些实施方式中，所述昆虫为水稻害虫。
20.在本发明的一些实施方式中，所述水稻害虫为褐飞虱。
21.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：所述mirna为来源于玉米的ma-mir164a-5p：5
’‑
uggagaagcagggcacgugca-3’(seq id no.1)，可能靶向多个不同的褐飞虱已报道的致死靶基因，注射人工合成的zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pccmirna模拟体进入虫体，在7天内存活率相比于对照组明显降低。由于zma-mir164a-5p是玉米源的mirna，玉米是人日常生活食物，因此，该片段对人是安全的，可用作为安全有效的防治植食性害虫的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物。
22.在本发明的一些实施方式中，所述应用为杀灭昆虫虫体和/或抑制昆虫虫体的生长。
23.在本发明的一些实施方式中，所述昆虫为水稻害虫。
24.在本发明的一些实施方式中，所述水稻害虫为褐飞虱。玉米源的mirna(zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc)对水稻害虫半翅目单食性昆虫褐飞虱生长具有抑制作用。由于zma-mir164a-5p来源于玉米，一种主要的农作物，zma-mir164a-5pcc为zma-mir164a-5p的类似物，在zma-mir164a-5p核酸序列的基础上，在其5’端添加了两个“g”，3’端添加了两个“c”，得到的zma-mir164a-5pcc核酸序列为5
’‑
gguggagaagcagggcacgugcacc-3’(seq id no.2)，因此zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc对人类安全，可用作安全有效的防治褐飞虱的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物；因此zma-mir164a-5p或zma-mir164a-5pcc转基因植物(即植物体过表达zma-mir164a-5p或zma-mir164a-5pcc)进行褐飞虱防治将有着实际的应用价值。
25.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在杀虫剂制备中的应用。
26.一种杀虫剂，所述杀虫剂中含有上述mirna或生物材料。
27.本发明的第四方面，提出了一种昆虫防治方法，包括如下步骤：使植物体表达mirna，所述mirna的序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
28.在本发明的一些优选实施方式中，使所述植物体过表达上述mirna。
29.在本发明的一些实施方式中，所述植物体选自水稻。
附图说明
30.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
31.图1为本发明实施例使用的zma-mir164a-5p的mirna序列信息及与玉米转录组比对结果图；
32.图2为本发明测试例褐飞虱注射zma-mir164a-5p和pbs后0h-168h的存活率；
33.图3为本发明测试例褐飞虱注射zma-mir164a-5pcc和pbs后0h-168h的存活率；
34.图4为本发明测试例zma-mir164a-5p和与褐飞虱靶基因krueppel homolog 1b(kr-h1b)的3’utr结合位点的体外细胞结合验证结果图；
35.图5为本发明测试例zma-mir164a-5pcc和与褐飞虱靶基因krueppel homolog 1b(kr-h1b)的3’utr结合位点的体外细胞结合验证结果图。
具体实施方式
36.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
37.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
38.为了筛选既能防治褐飞虱又安全环保的抗虫mirna，将植物源的mirna库作为小rna库，将筛选后的褐飞虱已报道的致死基因作为靶基因库，进行植物源mirna的褐飞虱靶基因预测。经过预测发现，zma-mir164a-5p可能的致死靶基因有14个。由于在动物中，mirna主要靠种子区域识别靶mrna，因此种子区的改变，可能能让mirna获得不同的靶基因。所以，对zma-mir164a-5p的序列进行改造，分别在5’端和3’端添加“gg”和“cc”形成zma-mir164a-5pcc，经预测可以靶向不同的14个靶基因。分别注射zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc后褐飞虱若虫的存活率相比于对照组在168h内显著降低。因此zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc具备潜在的抗虫价值。
39.由于zma-mir164a-5p来源于玉米，属于人类主食植物中的一类，对人类安全。因此，基于zma-mir164a-5p或zma-mir164a-5pcc构建转基因植物进行害虫防治有着实际的应用价值。
40.实施例1
41.一种mirna zma-mir164a-5p，核酸序列为5
’‑
uggagaagcagggcacgugca-3’(seq id no.1)，来源于玉米，zma-mir164a-5p的mirna序列信息及与玉米转录组比对结果图如图1所示，在褐飞虱防治中的应用。为研究其防治机理进行了如下研究：
42.对褐飞虱已报道的致死基因进行筛选，提取致死基因的3’utr序列。分别在靶基因预测软件网站pita(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_exe.html)、miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)下载软件在linux环境中的安装包，并进一步解压安装。在linux系统中调用zma-mir164a-5p序列与褐飞虱致死靶标的3’utr数据
库进行靶基因预测。
43.实验结果如下表1所示：
44.表1 zma-mir164a-5p与褐飞虱已报道致死基因3’utr的靶基因结合位点预测
[0045][0046][0047]
根据表1结果所示，zma-mir164a-5p可能靶向多个褐飞虱致死靶基因的3’utr位点。
[0048]
实施例2
[0049]
一种玉米源mirna zma-mir164a-5p的类似物zma-mir164a-5pcc，在zma-mir164a-5p核酸序列的基础上，在其5’端添加了两个“g”，3’端添加了两个“c”，得到的zma-mir164a-5pcc核酸序列为5
’‑
gguggagaagcagggcacgugcacc-3’(seq id no.2)，在褐飞虱防治中的应
用。
[0050]
为研究其防治机理进行了如下研究：
[0051]
对褐飞虱已报道的致死基因进行筛选，提取致死基因的3’utr序列。分别在靶基因预测软件网站pita(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_exe.html)、miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)下载软件在linux环境中的安装包，并进一步解压安装。在linux系统中调用zma-mir164a-5pcc序列与褐飞虱致死靶标的3’utr数据库进行靶基因预测。
[0052]
实验结果如下表2所示：
[0053]
表2zma-mir164a-5pcc与褐飞虱已报道致死基因3’utr的靶基因结合位点预测
[0054]
[0055]
根据表2结果所示，zma-mir164a-5pcc可能靶向多个褐飞虱致死靶基因的3’utr位点。
[0056]
测试例
[0057]
1、zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc对褐飞虱的杀虫效果验证
[0058]
本测试例将半翅目昆虫5龄若虫分为3组，每组200只，对半翅目昆虫5龄若虫分别注射200ng人工合成的zma-mir164a-5p(实验组)、zma-mir164a-5pcc(实验组)和磷酸盐缓冲液(pbs)(对照组)，注射体积为100nl。将注射后的虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，每24h统计存活率。
[0059]
观察结果如图2-3所示，从图2中可以看出，注射zma-mir164a-5p后第168h，zma-mir164a-5p的存活率为52.86％，而对照组的存活率为91％；从图3中可以看出，注射zma-mir164a-5pcc后第168h，zma-mir164a-5pcc的存活率为23.4％，而对照组的存活率为90％。结果表明，zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc均能明显降低褐飞虱的存活率。
[0060]
2、zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc对褐飞虱kr
ü
ppel homolog 1b 3’utr区域得体外结合验证
[0061]
根据实施例1-2中三个软件的预测结果，将褐飞虱kr
ü
ppel homolog 1b基因3’utr的预测结合区域构建进含有荧光素酶报告基因的pis-check2质粒，并转染进斜纹夜蛾221细胞；分别加入等量人工合成的mirna模拟体zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc(实验组)与nc(对照组，序列如seq id no.3所示：uucuccgaacgugucacgutt)的48小时后，测定荧光强度。
[0062]
观察结果如图4-5所示，从图4中可以看出，加了zma-mir164a-5p后的细胞荧光强度显著低于nc，说明zma-mir164a-5p在细胞中能结合kr
ü
ppel homolog 1b基因的3’utr区域，显著抑制该基因表达；从图5中可以看出，加了zma-mir164a-5pcc后的细胞荧光强度显著低于nc，说明zma-mir164a-5pcc在细胞中能结合kr
ü
ppel homolog 1b基因的3’utr区域，显著抑制该基因表达。结果表明，zma-mir164a-5p和zma-mir164a-5pcc均能与褐飞虱已报道致死基因3’utr进行靶基因结合。
[0063]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。