干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒与流程

1.本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒。


背景技术：

2.新筛中根据蛋氨酸和c3的含量异常来有针对性地筛查丙酸、蛋氨酸、维生素b12(vitamin b12，钴胺素，cobalamin,cbl)代谢有关的先天性缺陷。美国医学遗传学会颁布了新筛的初筛中需要被鉴别诊断的遗传病主要有29种先天性遗传病，另外还有次要的25种先天性遗传病。其中4种主要疾病和2种次要疾病与c3和met浓度的异常增高有关。
3.甲基丙二酸血症(methylmalonic academia,mma)是一种常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶a变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素(cobalamin,cbl,维生素b12)代谢缺陷，导致甲基丙二酸、3-羟基丙酸及甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积引起的疾病。根据酶缺陷类型分为甲基丙二酰辅酶a变位酶缺陷(mut型)及其辅酶钴胺素代谢障碍两大类。钴胺素代谢障碍包括6个类型，分别为cbla、cblb、cblc、cbld、cblf、cblh。
4.丙酸血症(propionic academia,pa)是支链氨基酸和奇数链脂肪酸代谢导致的一种较常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传代谢病，是由于丙酰辅酶a羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积，出现一系列生化异常、神经系统及其他脏器损害症状。pa是由于丙酰辅酶a羧化酶活性缺陷导致丙酰辅酶a转化为甲基丙酰辅酶a受阻，进而引起丙酰辅酶a、丙酰肉碱、丙酸、3-羟基丙酸、甲基枸橼酸和丙酰甘氨酸等代谢产物异常增高，引起机体损伤。
5.同型半胱氨酸血症(homocysteinemia,hcy)是含硫氨基酸蛋氨酸(甲硫氨酸)代谢过程中由于某种酶缺乏导致血浆同型半胱氨酸浓度增高，而同型半胱氨酸是动脉粥样硬化、急性心肌梗死、脑卒中、冠状动脉病变以及与外周血管病变能发病的独立危险因子。该病属于常染色体隐性遗传性疾病。临床表现多种多样，主要表现为晶状体脱落、血管病变、骨骼异常和智力低下。同型半胱氨酸血症可因胱硫醚β合成酶(cystathionine beta-synthase,cbs)缺乏、甲钴胺素代谢缺陷导致甲硫氨酸合酶(methionine synthase,ms)缺乏(包括甲基丙二酸血症合并同型胱氨酸尿症)及亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,mthfr)缺乏所致，前两者较多见。
6.单纯性高甲硫氨酸血症(isolated hypermethioninemia)是由于体内甲硫氨酸降解过程受阻导致血甲硫氨酸过多引起疾病。肝脏疾病、酪氨酸血症ⅰ型、经典型通行同型胱氨酸血症、过多摄入甲硫氨酸等也可引起继发性高蛋氨酸血症。原发性高甲硫氨酸血症主要由于甲硫氨酸s-腺苷转移酶(methionine adenosyltransferaseⅰ/ⅲ,matⅰ/ⅲ)缺乏所致，甘氨酸n-甲基转移酶(glycine n-methyltransferase,gnmt)缺乏及s-腺苷同型半胱氨酸水解酶(s-adenosylhomocysteine hydrolase,ahcy)缺乏也可导致高甲硫氨酸血症。呈常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传。多数患者无临床表现，少数有智力减退及其
他神经系统症状。
7.丙酸、蛋氨酸、维生素b12代谢相关的先天性缺陷更具有特异性的指标是甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸、3-羟基丙酸，理想的状况是把这几个指标加入到新筛项目中，但是检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸这3种物质的含量用到了lc-ms/ms方法，每针进样之间的走样时长较长，且需要色谱分离，这样才能准确地分离识别和定量甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸这3种物质的含量，尤其是要分离同分异构体甲基丙二酸和丁二酸。所以把这几个指标加入到新筛项目中不具有可实践性。所以最好的方法便是发展二次筛查的工作。即新筛中初筛时检测出c3和met浓度异常的血斑样本，用lc-ms/ms的方法再检测其甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸含量。
8.目前，使用lc-ms/ms的方法检测生物样本中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸，其前处理方法分为衍生法和非衍生法。衍生法中，通过萃取液萃取样本中的物质后，需要将样本溶液的溶剂去除，再使用衍生化试剂(3n盐酸正丁醇)进行反应，然后去除多余的衍生化试剂后，才能对目标化合物的衍生化产物进行间接检测，进而分析样本中目标化合物的含量。衍生操作可有助于同分异构体甲基丙二酸和丁二酸的液相分离，且提高检测灵敏度，但是衍生化前处理衍生步骤复杂，衍生化试剂具有毒性和刺激性，且衍生化试剂稳定性差、成本高，开发一种前处理方法简便、分离度良好和方法稳定的廉价非衍生化方法是非常有必要的。


技术实现要素：

9.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒。本发明旨在克服现有衍生化方法存在的问题，并通过hplc-ms/ms检测方法的优化，将甲基丙二酸与琥珀酸实现基线分离，提交定量准确性，并缩短检测时间。
10.本发明首先提供了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法，其包括如下步骤：
11.1)将血斑样本经过提取、还原和浓缩，得到待测样品；
12.2)采用uplc-ms/ms技术对样品进行内标法定量分析，使用6个水平的血斑做校正线，以以标准品溶液和内标浓度比为x轴，标准品和内标峰面积比为y轴；进行线性回归分析得回归方程，将相应氨待测物质面积代入回归方程，计算样本中待测物质的浓度；
13.所述uplc-ms/ms技术中，以体积百分比计，液相方法所使用的流动相a为：5％甲醇水 0.3％甲酸，流动相b为：85％甲醇 10％异丙醇 0.3％甲酸水溶液，液相方法所使用的梯度洗脱程序为0-0.35min，100％a；0.35-0.4min 100％a渐变为0％a；0.4-1.5min，0％a；1.5-1.51min，0％a渐变为100％a；1.51-3min，100％a；
14.质谱方法为同时进行正离子和负离子电喷雾离子化的多离子反应检测模式，待测物为甲基丙二酸(mma)、甲基枸橼酸(mca)、总同型半胱氨酸(thcy)和蛋氨酸(met)，琥珀酸(sa)，内标为d3-甲基丙二酸、d3-甲基枸橼酸、d4-同型半胱氨酸和d3-蛋氨酸；质谱采集参数如下所示：
[0015][0016][0017]
本发明还提供了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测试剂盒，其至少包括：
[0018]
内标品稀释液，体积百分比为50％甲醇水溶液；
[0019]
质控品，含有已知浓度的甲基丙二酸，甲基枸橼酸，蛋氨酸和总同型半胱氨酸的干血滤纸片，3个水平；
[0020]
校准品，含有已知浓度的甲基丙二酸，甲基枸橼酸，蛋氨酸和总同型半胱氨酸的干血滤纸片，6个水平；
[0021]
内标品冻干粉，包括d3-甲基丙二酸、d3-甲基枸橼酸、d8-同型半胱氨酸、d3-蛋氨酸4中物质，d3-甲基丙二酸、d3-甲基枸橼酸、d8-同型半胱氨酸、d3-蛋氨酸的摩尔质量比分别为1:4:3:4。
[0022]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果包括：
[0023]
本发明方法不使用3n盐酸正丁醇作为前处理的衍生化试剂，克服了衍生前处理步骤复杂，产品化生产困难，且衍生化试剂稳定性差、成本高，对人体也有危害等问题，本发明通过优化方法，缩短前处理步骤时间以及衍生化试剂对人体的危害。
[0024]
本发明通过色谱条件优化，能将甲基丙二酸与琥珀酸实现色谱分离，提高了定量的准确性。一个样品的检测时间为仅3分钟，可实现高通量检测。通过色谱方法分离了甲基丙二酸的干扰物琥珀酸，特异性强。
[0025]
通过开发的新的hplc-ms/ms检测方法研制相应的检测试剂盒，能够为临床提供更加准确可靠的辅助检测方法。
附图说明
[0026]
图1为本发明方法标准品基质色谱图；
[0027]
图2为hcy单通道数据；
[0028]
图3为met单通道数据；
[0029]
图4为mma单通道数据；图4中，1.01分钟出峰物质为sa(琥珀酸)；
[0030]
图5为mca单通道数据；
[0031]
图6为使用本发明方法测定甲基丙二酸血症样本，检测出的异常指标——mma，mca的色谱图。
[0032]
图7为使用本方法测定同型半胱氨酸血症样本，检测出的异常指标——hcy的色谱图
[0033]
其中，图2-7中，实心填充的峰为实际样本检测峰或非同位素标记氨基酸的峰，非实心填充的峰为同位素内标峰。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
[0035]
在本发明的具体实施例中，干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测试剂盒，包含如下内容(其中，百分比均为体积百分比)：
[0036]
内标稀释液：50％甲醇水溶液；
[0037]
萃取剂：0.2％甲酸,60％乙腈水溶液；
[0038]
流动相：a(0.3％甲酸 5.0％甲醇水溶液)/b(0.3％甲酸 10％异丙醇 85％甲醇水溶液)；
[0039]
复溶液：0.3％甲酸 5.0％甲醇水溶液；
[0040]
质控品：含有已知浓度的甲基丙二酸，甲基枸橼酸，蛋氨酸和总同型半胱氨酸的干血滤纸片，3个水平；
[0041]
校准品含有已知浓度的甲基丙二酸，甲基枸橼酸，蛋氨酸和总同型半胱氨酸的干血滤纸片，6个水平；
[0042]
内标冻干粉：d3-甲基丙二酸、d3-甲基枸橼酸、d4-同型半胱氨酸和d3-蛋氨酸；d3-甲基丙二酸、d3-甲基枸橼酸、d8-同型半胱氨酸、d3-蛋氨酸的摩尔质量比分别为1:4:3:4；
[0043]
还原剂：二硫苏糖醇(dtt)粉末。
[0044]
其中，质控品浓度：
[0045] 同型半胱氨酸蛋氨酸甲基丙二酸甲基枸橼酸低水平104021中水平207053高水平45120159
[0046]
校准品浓度
[0047] 同型半胱氨酸蛋氨酸甲基丙二酸甲基枸橼酸校准品12.540.40.4校准品25101.60.8校准品3102542校准品42075165
校准品5501508012.5校准品615030020050
[0048]
内标冻干品被稀释后所得的内标品溶液的浓度如下：
[0049] d4-同型半胱氨酸d3-蛋氨酸d3-甲基丙二酸d3-甲基枸橼酸单位：μmol/l1520520
[0050]
在试剂盒使用之前，试剂盒所有成分和样本均需平衡至室温(约需30分钟)。
[0051]
一、试剂准备
[0052]
(1)内标储备液准备：使用前开封需将内标品冻干瓶3000rpm离心3分钟。96测试内标品使用内标品稀释液(50％甲醇溶液)1ml溶解。复溶后-20℃条件下保存在原包装瓶中可稳定保存30天。
[0053]
(2)还原剂准备(dtt溶液)：使用前开封需将冻干瓶3000rpm离心3分钟。96测试还原剂使用超纯水1ml溶解。复溶后-20℃条件下保存在原包装瓶中可稳定保存30天。
[0054]
(3)工作液制备：将内标品溶液∶还原剂∶萃取剂(0.2％甲酸,60％乙腈水溶液)每孔按照1∶1∶20例稀释，举例说，如果处理100个样本，需要22ml的工作液，需要1ml内标品，1ml还原剂，用20ml萃取剂稀释。本实施例的工作液为包含如下浓度或体积百分数物质的水溶液：d3-甲基丙二酸0.25μmol/l、d3-甲基枸橼酸1μmol/l、d4-同型半胱氨酸0.75μmol/l和d3-蛋氨酸1μmol/l,10mg/ml dtt,0.2％甲酸,60％乙腈。
[0055]
二、样本处理
[0056]
(1)使用手动或自动打孔器在干血斑上将滤纸片打孔，并将滤纸血片移入提供的u型微孔板内。滤纸血斑直径约为3.2mm(1/8英寸)。每个孔加入3个干滤纸血斑。
[0057]
(2)使用多道移液器给每个含有滤纸血片的板孔内添加200μl的工作液。用铝箔封套覆盖微孔板，确保密封性良好，将挥发量降低到最小。
[0058]
(3)封盖后，立即将微孔板置于孵育器/振荡器内，在45℃条件下震荡30分钟。微孔板震荡的速度范围为600rpm。
[0059]
(4)震荡完成后将微孔板从孵育器/振荡器上取下，静置至室温(约10分钟)。
[0060]
(5)小心揭去板上的铝箔封套，使用多道移液器转移150ul的萃取上清液至另一洁净的u型微孔板内。
[0061]
(6)使用氮气在40℃条件下吹干(约40分钟)。
[0062]
(7)向以上各孔加入40μl复溶液，用铝箔封套覆盖微孔板，确保密封性良好。
[0063]
(8)设定振荡频率600rpm，30℃条件下震荡10分钟，确保复溶。
[0064]
(9)将板在3000rpm，4℃条件下离心10分钟。
[0065]
(10)小心揭去板上的铝箔封套，转移30μl复溶液至对应的洁净v型96孔微孔板中。
[0066]
(11)用铝箔封套覆盖微孔板，确保密封性良好，将挥发量降低到最小。并将v型96孔微孔板放入自动进样器中。进样分析。
[0067]
三、仪器及参数
[0068]
使用仪器：超高效液相色谱-串联质谱仪(waters acquity uplc i-class ivd/waters xevotq-d ivd system，usa)；
[0069]
氮气吹扫仪(型号md200-1a，杭州奥盛仪器有限公司)；
[0070]
孵育震荡仪(型号mb100-4a，杭州奥盛仪器有限公司)；
[0071]
高速冷冻离心机(型号multifugex3r，thermo scientific)。
[0072]
质谱方法：
[0073]
大气压电喷雾离子源(esi)，正离子模式与负离子模式；
[0074]
多重反应选择离子检测(mrm)；
[0075]
毛细管电压：3.0kv
[0076]
离子源温度：150℃；
[0077]
脱溶剂气温度：600℃；
[0078]
脱溶剂气流量：900l/hr；
[0079]
反吹气流量：50l/hr；
[0080][0081]
液相方法：
[0082]
初始流动相：a(0.3％甲酸 5.0％甲醇水溶液)/b(0.3％甲酸 10％异丙醇 85％甲醇水溶液)＝100：0；
[0083]
流速：0.3ml/min；
[0084]
梯度洗脱程序为0-0.35min，100％a；0.35-0.4min 100％a渐变为0％a；0.4-1.5min，0％a；1.5-1.51min，0％a渐变为100％a；1.51-3min，100％a。
[0085]
洗针液：乙腈/水＝50:50
[0086]
色谱柱：acquity uplc beh c18(1.7μm，2.1*50mm)
[0087]
保护住：acquity uplc beh c18 vanguard pre-column(1.7μm，2.1*5mm)柱温相温度：30℃。
[0088]
以下结合本发明的检测结果进行分析。如图1所示，为本发明方法标准品基质色谱图，采集时间为0.4-1.2分钟，共0.8分钟，一个样品的走样时间仅为3分钟，可实现高通量检测，且本发明方法不使用3n盐酸正丁醇作为前处理的衍生化试剂，克服了衍生前处理步骤复杂，产品化生产困难，且衍生化试剂稳定性差、成本高，对人体也有危害等等问题，本发明可以缩短前处理步骤时间以及衍生化试剂对人体的危害。
[0089]
图2-5为各物质单通道图谱，图2中，0.59分钟出峰的物质为hcy和d4-hcy，图3中，0.77分钟出峰的物质为met和d3-met，图4中，1.12分钟出峰物质为mma和d3-mma，1.01分钟出峰物质为sa(琥珀酸)；由图可知，本发明通过色谱条件优化，能将甲基丙二酸与琥珀酸实现基线分离，提高了定量的准确性。图5中，1.13分钟出峰物质为mca和d3-mca。图6为使用本发明方法测定甲基丙二酸血症样本，检测出的异常指标——mma，mca的色谱图，可看出阳性样本中mma和mca的峰面积有明显的增高。图7为使用本方法测定同型半胱氨酸血症样本，检测出的异常指标——hcy的色谱图，可看出阳性样本中hcy的峰面积有明显的增高。sa为mma的干扰物质，本方法不仅分析时间短，还可以分离除mma的干扰物质。
[0090]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。