红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用的制作方法

红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因hctrx及其重组载体在vigs沉默体系中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，涉及红麻vigs沉默体系，特别是指红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因hctrx及其重组载体在vigs沉默体系中的应用。


背景技术：

2.红麻（hibiscus cannabinus l.）是一种重要的纤维作物，已有4000多年的栽培历史，现已在20多个国家进行商业化种植，其总产量的95%以上主要来自中国、印度和泰国。红麻纤维具有柔软、韧度大、吸湿性好以及可降解等优势，其多功能用途包括制作纸张、建筑材料、麻纺产业、环境友好吸附材料、生物复合材料等产品，市场前景广阔，被视为21世纪极具发展潜力的作物和未来派作物。因此，为保障红麻产业的可持续发展亟需加强红麻种质资源创新研究，培育优质高产的红麻新品种。
3.利用基因工程手段是获得红麻新种质的有效途经，但目前由于缺乏有效的红麻遗传转化和再生体系方法，极大的限制了对红麻内源性功能基因的深入研究和应用。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，vigs）技术是研究植物基因功能的一种快速而有效的方法，不需要遗传转化，具有周期短、成本低、操作简单和沉默效率高等优势，广泛的应用于植物生长发育、抗病抗逆、代谢调控等相关基因的功能鉴定。目前vigs技术已经在烟草、拟南芥、小麦、水稻、玉米、番茄等多种植物研究中取得了成功。
4.专利202010073462.1公开了一种红麻hcpds基因vigs沉默体系，该体系通过构建含有hcpds基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体，该载体经农杆菌介导转化红麻，诱导红麻内源hcpds基因发生沉默，有效降低了红麻hcpds基因的表达水平，导致白化表型。该体系的转化模式为通过侵泡法将红麻种子在混合菌液中浸泡24 h，然后进行种植，所得的植株出现白化表型；这种模式的周期较长，延长了试验周期，为了进一步摸索获得较短时间就能出现表型差异的方法以及进一步发现新的报告基因，本课题进行了深入的摸索。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出一种红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因hctrx及其重组载体在vigs沉默体系中的应用。
6.本发明的技术方案是这样实现的：红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因hctrx，其碱基序列如seq id no.1所示。
7.上述的基因hctrx表达的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.上述的基因hctrx作为红麻报告基因中的应用。
9.优选的，所述应用是通过构建基因hctrx的重组载体侵染红麻植株实现的。
10.优选的，所述重组载体为病毒载体。
11.优选的，所述病毒载体为烟草脆裂病毒。
12.上述的应用，实验步骤为：
（1）克隆红麻hctrx基因的全长，构建重组质粒blunt-hctrx；（2）以步骤（1）的重组质粒blunt-hctrx为模板，以特异性片段的引物对为引物进行扩增，回收目的片段，将目的片段连接到ptrv2载体上，构建ptrv2-hctrx重组质粒；（3）将含ptrv2-hctrx重组质粒的菌液与ptrv1辅助载体的菌液等比例混合后注射至红麻叶片，暗培养后正常培养得花斑型植株。
13.所述步骤（2）中特异性片段的序列如seq id no.3所示。
14.所述步骤（3）中注射至红麻叶片的浸润面积＞75%整个叶片的面积。
15.进一步，所述步骤（3）中暗培养的时间为35-37小时。
16.本发明具有以下有益效果：1、本发明从红麻中克隆获得了一个硫氧还蛋白类似蛋白（thioredoxin-like protein，trx）基因，该基因定位于叶绿体中，位于叶绿体中的trx蛋白所对应的编码基因发生突变或沉默后，突变体有明显的花斑表型，是易于识别的标记性状，可以作为vigs体系应用的报告基因。
17.2、本技术构建了携带hctrx序列的烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus, trv）重组载体，通过叶片注射法侵染红麻后，诱导hctrx基因发生沉默，沉默后植株中hctrx基因的表达量显著下降，出现典型的花斑表型。本发明构建的携带hctrx序列的trv重组载体可以作为红麻vigs技术体系中的阳性对照，并探索和优化了红麻的vigs技术体系，为vigs技术在红麻中的应用奠定了坚实的理论和实践基础，也为硫氧还蛋白类似蛋白trx-like，以及vigs技术体系在其他作物中的应用提供了借鉴。
18.3、本发明首次对红麻叶绿体中的硫氧还蛋白类似蛋白（thioredoxin-like protein, trx）基因进行了克隆和亚细胞定位分析；构建了红麻hctrx基因沉默体系，该体系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特点；本发明所述的hctrx基因及沉默体系有效的降低了红麻hctrx基因的表达水平，叶绿素合成受到影响，导致花斑表型，能够作为vigs沉默体系在红麻应用中的报告基因。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为红麻hctrx基因pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000 dna marker；泳道1、2，hctrx基因。
21.图2为红麻hctrx的亚细胞定位。
22.图3为构建重组病毒载体ptrv2-hctrx、空载体ptrv2和辅助载体ptrv1农杆菌菌落pcr检测的琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000 dna marker；泳道1-3，重组病毒载体ptrv2-hctrx农杆菌单克隆；泳道4-6，空载体ptrv2农杆菌单克隆；泳道7-9，辅助载体ptrv1农杆菌单克隆。
23.图4为叶背注射法进行vigs浸染过程及红麻新叶花斑表型形态示意图。
24.图5为实时荧光定量（qrt-pcr）检测红麻hctrx基因的沉默效果。trv:00，空载体
ptrv2对照植株；trv:hctrx-1~10，重组病毒载体ptrv2-hctrx沉默植株。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例11、红麻hctrx基因的克隆提取红麻品种福红992幼苗根系的总rna，然后按照反转录试剂盒操作步骤合成cdna第一链，-20℃保存备用。根据本实验室对红麻转录组的高通量测序结果，设计用于扩增红麻hctrx基因序列的引物hctrx-f和hctrx-r，采用高保真酶pfu dna polymerase，以cdna为模板扩增红麻trx基因序列（结果如图1所示）。扩增体系为：cdna 1μl，hctrx-f和hctrx-r 各1μl (10μm)，10
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pfu buffer 2.5 μl，dntp mix 2 μl(2.5 mm), pfu dna polymerase 0.5μl (2.5 u)，ddh2o补足至25 μl。扩增程序为：95 ℃预变性5 min ；95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30个循环；72 ℃延伸5 min。pcr产物电泳后经胶纯化回收试剂盒纯化后连接到peasy-blunt克隆载体上，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，然后涂布在含有kan（100mg/ml）的lb平板上，37℃倒置培养8~12 h，挑选阳性克隆测序，获得含硫氧还蛋白类似蛋白hctrx基因序列的重组菌blunt-hctrx。
27.、红麻hctrx蛋白的亚细胞定位（1）pbi121-hctrx瞬时表达载体的构建以重组菌blunt-hctrx菌液为模板，根据瞬时表达载体pbi121的多克隆位点序列信息，结合clonexpressii技术设计用于扩增hctrx基因瞬时表达的引物pbi-hctrx-f和pbi-hctrx
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r。扩增体系为：blunt-hctrx菌液 1 μl，hctrx-f和hctrx-r 各1 μl (10 μm)，10
×
pfu buffer 2.5 μl，dntp mix 2 μl(2.5 mm), pfu dna polymerase 0.5 μl (2.5 u)，ddh2o补足至25 μl。扩增程序为：95 ℃预变性5 min ；95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30 个循环；72 ℃延伸5 min。pcr扩增产物电泳后经胶纯化回收试剂盒纯化后连接到经过xholi线性化处理的pbi121载体上。连接体系为：pbi121载体线性化质粒270 ng，插入片段24 ng，5
×
ceii buffer 2 μl，exnase ii 1 μl，ddh2o补足至10 μl。连接条件为：37 ℃反应10 min, 降至4℃后立即置于冰上冷却。连接产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，然后涂布在含有kan（100mg/ml）的lb平板上，37℃倒置培养8~12 h，挑选阳性克隆测序，获得重组菌pbi121-hctrx。
28.（2）烟草叶片瞬时转化在含有蛭石的基质中播种烟草种子若干，培养一个月后待其生长出6~8片叶片后即可注射。提取重组菌pbi121-hctrx的质粒转入农杆菌eha105感受态细胞，然后涂布在含有kan（100 mg/ml）、rif（50 mg/ml）及str（25 mg/ml）的lb平板上，28℃倒置培养2 d。以农杆菌转化子菌落为模板，用基因特异引物对pbi-hctrx-f和pbi-hctrx-r进行pcr扩增检测。挑取含有pbi121-hctrx质粒的农杆菌单菌落接种于100 ml的lb液体培养基中进行扩大培养，200 rpm培养至od为0.6~0.8。4000 rpm，离心4 min收集菌体，用含10 mm mgcl2和120 μ
m as的lb液体悬浮液重悬菌体，od调至0.6。挑选生长状况良好的烟草叶片，用去针头的1 ml注射器从烟草叶片下表皮进行注射，并对注射区域做好标记，将注射完成的烟草植株暗培养24 h后，取标记处的叶片制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照，结果如图2所示， hctrx:gfp发出的绿色荧光与叶绿体本身发出的红色荧光重叠，这表明红麻中的hctrx是一个叶绿体定位蛋白，说明红麻hctrx基因在叶绿体上发挥作用。
29.、vigs载体构建及侵染（1）携带hctrx序列的trv重组载体的构建以重组菌blunt-hctrx菌液为模板，根据ptrv2载体的多克隆位点序列信息，结合clonexpressii技术要求，使用thesgn vigs tool在线软件(https://vigs.solgenomics.net/)设计用于扩增hctrx基因cds结构域上的276 bp特异性片段（序列如seq id no.3所示）的引物ptrv2-hctrx-f和ptrv2-hctrx-r。扩增体系为：blunt-hctrx菌液 1 μl，ptrv2-hctrx-f和ptrv2-hctrx-r各1 μl (10 μm)，10
×
pfu buffer 2.5 μl，dntp mix 2 μl(2.5 mm), pfu dna polymerase 0.5 μl (2.5 u)，ddh2o 补足至25 μl。扩增程序为：95 ℃预变性5 min ；95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30 个循环；72 ℃延伸5 min。pcr扩增产物电泳后经胶纯化回收试剂盒纯化后连接到经过ecori线性化处理的ptrv2载体上。连接体系为：ptrv2载体线性化质粒220 ng，插入片段11 ng，5
×
ceii buffer 2 μl，exnase ii 1 μl，ddh2o补足至10 μl。连接条件为：37 ℃反应10 min, 降至4℃后立即置于冰上冷却。连接产物转化到大肠杆菌dh 5α感受态细胞中，然后涂布在含有kan（100 mg/ml）的lb平板上，37℃倒置培养8~12 h，挑选阳性克隆测序，获得重组质粒ptrv2-hctrx。
30.引物序列如下表所示（2）红麻植株培养挑取籽粒饱满的红麻品种福红992种子，先用3%的h2o2溶液消毒10 min，再用无菌蒸馏水中冲洗4~5次后，室温下在无菌水中浸泡1 h，然后均匀地摆放在铺有3层吸水纸的发芽盒（27 cm
×
18 cm
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9 cm）中，置于光照培养箱中（光/暗周期为 14 /10 h，昼夜温度28/26℃，相对湿度60/100，光照强度300 μm/(m2·
s)）培养7天后，选取长势一致的幼苗移栽至含1/4 hoagland培养液的育苗盘中进行水培，待其长至第一片真叶展开时方可注射，每两天更换一次培养液。
31.（3）vigs侵染分别提取重组菌ptrv2-hctrx、载体ptrv2和辅助载体ptrv1的质粒（如图3所示）转入农杆菌gv301感受态细胞，然后涂布在含有kan（100 mg/ml）、rif（50 mg/ml）及str（25 mg/ml）的lb平板上，28 ℃倒置培养2 d后。以农杆菌转化子菌落为模板，分别用ptrv2
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hctrx-f和ptrv2-hctrx-r、ptrv2-f和ptrv2-r、ptrv1-f和ptrv1-r扩增引物对进行pcr扩增检测。挑取含ptrv2-hctrx、ptrv2和ptrv1质粒的农杆菌单菌落分别接种于100 ml的lb液体培养基中进行扩大培养，200 rpm培养至od为0.8~1.0。4000 rpm，离心10 min收集菌体，用含10 mm mgcl2、200 μm as和10 mm mes 无菌ddh2o2悬浮液重悬菌体，od调至1.0；将携带ptrv1载体的菌液重悬液分别与携带ptrv2载体的菌液重悬液与携带重组质粒ptrv2-hctrx的菌液重悬液按照体积比1:1混合制成2种混合菌液，混合菌液于室温下避光静置孵育3 h后，用于注射红麻叶片。用去针头的1 ml注射器从红麻的子叶下表皮进行注射，浸润面积占整个叶片面积的75%以上为宜，注射完成的红麻植株暗培养36 h，之后在正常条件下培养（流程示意图如图4所示）。
32.（4）浸染后hctrx基因表达量检测待叶片出现花斑表型后（一般在注射完后10天左右），分单株提取红麻叶片总rna，以actin为内参基因，采用实时荧光定量（qrt-pcr）法检测hctrx基因在对照（注射ptrv2空载体菌液）和沉默（注射重组病毒载体ptrv2-hctrx菌液）植株中表达情况，结果如图5所示，由图5可知hctrx在干涉植株中的表达量显著下降，证明基因沉默成功。内参基因引物为actin-f和actin-r，hctrx基因引物yg-hctrx-f和yg-hctrx-r。
33.实施效果分析本发明首次对红麻叶绿体中的硫氧还蛋白类似蛋白（thioredoxin-like protein, trx）基因进行了克隆和亚细胞定位分析；构建了红麻hctrx基因沉默体系，该体系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特点；本发明所述的hctrx基因及沉默体系有效的降低了红麻hctrx基因的表达水平，叶绿素合成受到影响，导致花斑表型，能够作为vigs沉默体系在红麻应用中的报告基因。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。