一种亚硝基脲类化合物的抗菌及联合抗菌活性

1.本发明涉及生物领域，具体涉及链脲菌素抗菌及联合抗菌活性的应用。


背景技术：

2.革兰氏阴性(g-)菌耐药日益严重，其中以产超广谱β-内酰胺酶(esbl)、碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌(包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等)最为突出，有效药物匮乏，临床治疗困难，不得不使多年前就因肾毒性和神经毒性过大而基本遭弃用的多粘菌素类药物承担起当前对抗多药耐药g-菌最后一道防线的任务。然而，多粘菌素的耐药菌株也逐渐涌现，特别是质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1的出现进一步加剧了细菌耐药的现状。更为严峻的是近50年全球上市的新结构类型抗菌药物仅有抗革兰氏阳性(g

)菌的恶唑烷酮类、脂肽类、截短侧耳素类，以及抗结核的二芳基喹啉类，没有一个针对g-耐药菌，且目前处于临床及临床前研究的新骨架化合物也非常有限。寻找有效抗菌药物和联合用药抗菌方案是对抗当前临床棘手的g-耐药菌感染的重要策略。
3.链脲菌素(cas no.18883-66-4)于1956年分离自不产色链霉菌发酵液，属于亚硝基脲结构类型的小分子活性物质(分子量265.22)。最早因抗菌活性被发现，1959-1960年曾有两篇文献报道过其体内外抗菌活性，但由于文献年代过于久远，研究结果无法追溯。然而自1960年起，链脲菌素作为dna烷化剂，其抗肿瘤活性逐渐突显；另外，在抗肿瘤研究过程中发现链脲菌素具有破坏胰岛β细胞继而引发ⅱ型糖尿病的活性。自1960年至今，链脲菌素主要用于抗肿瘤治疗和ⅱ型糖尿病动物模型的构建，而其抗菌活性研究几乎全部中断，尤其链脲菌素与其他抗菌药物联合应用的抗菌活性尚未见任何报道。


技术实现要素：

4.基于此，有必要发现和挖掘链脲菌素抗菌及联合抗菌活性的应用。
5.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
6.基于当前流行耐药菌株，开展抗菌活性研究。受试菌株包括但不限于：g

菌中的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(mrsa)和万古霉素耐药肠球菌(vre)，g-菌中的产esbl耐药菌株、碳青霉烯类耐药菌株、多粘菌素耐药菌株。开展链脲菌素与9种抗菌药物的体外联合抗菌活性研究。
7.采用琼脂稀释法检测链脲菌素对18个种属(g-菌14个种属和g

菌4个种属)共计37株细菌的最低抑菌浓度(mic)，明确其抗菌谱。采用k-b纸片联合药敏实验检测链脲菌素与杆菌肽药物组合对9个种属共计15株细菌的联合药敏，以及链脲菌素与另外8种抗菌药物组合对大肠埃希菌(包括耐药菌株)的联合药敏。采用棋盘法体外联合药敏实验定量检测链脲菌素与杆菌肽药物组合对产超广谱β-内酰胺酶(esbl)、碳青霉烯类耐药、多粘菌素耐药的大肠埃希菌联合抗菌效应及联合用药指数。
8.首先，本发明提供了链脲菌素在抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的应用。
9.优选的，所述革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌。
10.优选的，所述金黄色葡萄球菌包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌。
11.优选的，所述肠球菌包括万古霉素敏感肠球菌、万古霉素耐药肠球菌。
12.优选的，所述革兰氏阴性菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、成团泛菌、普通变形杆菌、伤寒沙门菌、摩氏摩根氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、福氏志贺菌。
13.优选的，所述大肠埃希菌包括产超广谱β-内酰胺酶耐药大肠埃希菌、不产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌、碳青霉烯耐药大肠埃希菌、多粘菌素耐药大肠埃希菌、产新德里金属-β-内酰胺酶1大肠埃希菌。
14.优选的，所述肺炎克雷伯菌包括产超广谱β-内酰胺酶耐药肺炎克雷伯菌、不产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌、碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌、多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌、产新德里金属-β-内酰胺酶1肺炎克雷伯菌。
15.进一步地，还提供了链脲菌素和杆菌肽在抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的联合应用。
16.优选的，所述革兰氏阴性菌包括产超广谱β-内酰胺酶耐药菌株、碳青霉烯耐药菌株、多粘菌素耐药菌株。
17.进一步地，还提供了链脲菌素和抗菌药物在抗菌中的联合应用，所述抗菌药物包括罗红霉素、泰利霉素、诺氟沙星、万古霉素、新生霉素。
18.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
19.链脲菌素具有广谱抗菌活性，和其他抗菌药物联合应用还具有相加或协同抗菌活性，有效填补了抗菌化合物的应用不足，尤其是针对耐药性细菌提供有效地抗菌解决方案，提高疗效，减少耐药菌的传播。
附图说明
20.图1k-b纸片法链脲菌素和杆菌肽联合抗菌实验结果；
21.图2k-b纸片法链脲菌素和抗菌药物联合抗菌实验结果。
具体实施方式
22.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
23.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
24.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
25.实施例1琼脂稀释法检测链脲菌素抑菌mic值
26.将受试菌株画线接种于琼脂培养皿中，于37℃恒温培养箱内静置过夜培养。次日从琼脂平皿中挑取至少3个分离良好、形态相同的菌落，接种于适当肉汤培养基中，35℃培养2～6小时，使用浊度仪调整菌液浓度至0.5麦氏浊度(1～2
×
108cfu/ml)待用。将链脲菌素药物贮备液用相应的稀释剂依次稀释至各种所需浓度，加入90mm无菌平皿中，再用刻度移液管加入相应体积的mh琼脂，将药液与培养基充分混匀后制成链脲菌素终浓度范围为0.06～128μg/ml的含药琼脂平皿备用。将0.5麦氏浊度菌液再稀释10倍(约107cfu/ml)，混
匀后取0.3ml按次序加入接种板中。使用多点接种仪将上述菌液接种至一系列含有不同浓度药物的平皿上，每个接种点的接种菌量约为104cfu。将接种好的平皿半开盖置于恒温室，待接种点完全干燥后，将平皿倒置于35
±
2℃培养箱或恒温室培养16～20小时(不动杆菌属培养20～24小时)。将一系列平皿按照药物浓度从低到高的顺序依次排列，放置于黑色无反光背景中，从含有最低浓度药物的平皿开始读取。肉眼观察细菌生长情况，细菌生长被完全抑制的最低的浓度即为mic值。
27.链脲菌素对18个种属(g-菌14个种属和g

菌4个种属)的共计37株细菌的最低抑菌浓度(mic)值见表1。研究结果显示链脲菌素具有广谱抗菌活性，其对g

菌(含mrsa和vre)的最小抑菌浓度为2～8μg/ml，对g-菌(含产esbl菌株、碳青霉烯耐药菌株、多粘菌素耐药菌株)的最小抑菌浓度为2～》128μg/ml。其中链脲菌素对金黄色葡萄球菌(包括mrsa)的mic值范围为4～8μg/ml，对大肠埃希菌(包括产esbl、碳青霉烯耐药、多粘菌素耐药菌株)的mic值范围为4～》128μg/ml，对肺炎克雷伯菌(包括产esbl、碳青霉烯耐药、多粘菌素耐药菌株)的mic值范围为128～》128μg/ml，对敏感及耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌的mic值均》128μg/ml。链脲菌素对其他种属细菌的mic值详见表1。
28.表1链脲菌素mic值测定结果
[0029][0030]
注：msse，甲氧西林敏感表皮葡萄球菌；mssa，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；mrsa，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌；vse，万古霉素敏感肠球菌；vre，万古霉素耐药肠球菌；esbl( )，产超广谱β-内酰胺酶；esbl(-)，不产超广谱β-内酰胺酶；mcr-1( )，携带多粘菌素耐药基因mcr-1；ndm-1( )，产新德里金属-β-内酰胺酶1；crpa，碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌；crab，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌。
[0031]
实施例2k-b纸片法联合药敏实验
[0032]
将受试菌株画线接种于琼脂培养皿中，于37℃恒温培养箱内静置过夜培养。次日从琼脂平皿中挑取至少3个分离良好、形态相同的菌落，接种于适当肉汤培养基中，35℃培养2～6小时，使用浊度仪调整菌液浓度至0.5麦氏浊度(1～2
×
108cfu/ml)，使用无菌棉签
蘸取菌液，轻压挤干水份后均匀涂布在mh琼脂培养基上，晾干表面水份待用。两纸片中心点间距离根据药物敏感性调整，两药均敏感则相距24mm，两药中1个耐药1个敏感则相距15mm，2药都耐药则相距10mm，直径90mm的mh平皿最多贴4片。然后放35℃孵育24小时后取出观察结果。根据抑菌环形态分为协同、累加、无关和拮抗作用。
[0033]
如图1所示，链脲菌素(32μg/片)和杆菌肽(10iu/片)联合应用对肠杆菌科细菌，包括大肠埃希菌(e.coli)、肺炎克雷伯菌(k.pnuemoniae)、福氏志贺菌(s.flexneri)，具有一定的协同或相加抗菌活性。在受试的9株肠杆菌科细菌中，有6株菌的链脲菌素抑菌圈明显向杆菌肽药敏纸片方向偏移(黑框标记)，其中包括产esbl菌株(e.coli atcc 35218)、碳青霉烯耐药菌株(e.coli atcc baa-2469和k.pnuemoniae atcc baa-2146)和多粘菌素耐药菌株(e.coli 08-85)。另外发现两者联合应用对金黄色葡萄球菌(s.aureus atcc 29213)也有一定程度协同抗菌效应(黑框标记)。但两者联合应用对鲍曼不动杆菌(a.baumannii)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、阴沟肠杆菌(e.coloacae)、粘质沙雷氏菌(s.marcescens)、表皮葡萄球菌(s.epidermidis)无明显协同抗菌效应。
[0034]
如图2所示，以大肠埃希菌敏感菌株e.coli atcc 25922和产esbl的耐药菌株e.coli atcc 35218为受试菌株采用k-b纸片联合药敏的方法研究链脲菌素与利奈唑胺、万古霉素、达托霉素、罗红霉素、泰利霉素、新生霉素、诺氟沙星、复方新诺明8种抗菌药物联合应用抗菌活性。实验结果显示链脲菌素与罗红霉素、泰利霉素、诺氟沙星、万古霉素、新生霉素联合应用对受试大肠埃希菌均有一定程度协同或相加抗菌活性。
[0035]
实施例3棋盘法联合药敏实验
[0036]
将受试菌株画线接种于琼脂培养皿中，于37℃恒温培养箱内静置过夜培养。次日从琼脂平皿中挑取至少3个分离良好、形态相同的菌落，接种于适当肉汤培养基中，35℃培养2～6小时，使用浊度仪调整菌液浓度至0.5麦氏浊度(1～2
×
108cfu/ml)，再稀释20倍备用。联合用药中的两个化合物分别在两块圆底96孔板进行横向二倍稀释(drug a)和纵向二倍稀释(drug b)，稀释好的药物浓度均为最终实验浓度的2倍，其中在每个药物稀释最后一个浓度梯度后加入不含药的空白camh肉汤培养基。将稀释好的两种药物以不同浓度完全组合，按1:1体积(各50μl)加入96孔板中，使得每孔中的含药camh肉汤培养基为100μl。吸取10μl稀释菌液加入以上含药camh肉汤培养基微孔中，将96孔板用封口膜密封，置37℃恒温静置培养16～18小时。读取结果时，将96孔板置于采光良好处，观察孔中肉汤浊度及孔底是否有菌落沉积，记录96孔板中两药物单用mic值和联合用药时无菌生长的mic值。fic指数(fici)的计算及判断标准：fici＝mic
甲药联用
/mic
甲药单用
mic
乙药联用
/mic
乙药单用
。fici≤0.5，协同作用；fici》0.5-1，相加作用；fici》1-2，无关作用；fici》2，拮抗作用。
[0037]
采用棋盘法联合药敏实验对k-b纸片联合药敏中所提示的一部分协同或相加作用进行定量验证。表2研究结果提示，链脲菌素与杆菌肽组合抗g-菌(包括耐药菌)的联合用药指数(fici)范围为0.312～0.750，可将两药单独应用的mic值分别降低2～16倍和8～16倍。两药联合对受试大肠埃希菌均体现协同抗菌活性，包括e.coli atcc 25922(fici＝0.312)、产esbl菌株e.coli atcc 35218(fici＝0.375)、碳青霉烯耐药菌株e.coli atcc 2469(fici＝0.312)、多粘菌素耐药菌株e.coli 08-85(fici＝0.375)。
[0038]
表2棋盘法联合药敏实验结果
[0039][0040]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。