一种深层过滤介质及其用途的制作方法

1.本发明涉及过滤技术领域。具体地，本发明涉及一种深层过滤介质或深层过滤系统及其在过滤水相待过滤液体中的应用。


背景技术：

2.深层过滤是血浆蛋白制品制备中应用最广泛的一种过滤技术，也常用于细胞培养物的澄清。深层过滤的介质通常具有一定的厚度或深度，其内部结构为迂回曲折的迷宫结构，可以阻挡比过滤介质孔隙更小的颗粒。通常认为，深层过滤有多种截留机理，颗粒物保留通过疏水、离子和其他相互作用来实现大小排阻和吸附。深层过滤滤器通常具有梯度密度结构的材料，一般在靠近顶部具有较大的孔，其污染机制可以包括孔阻塞、团块形成和/或孔收缩。
3.工业用深层过滤的介质通常主要以纤维做成过滤板，通称滤板，纤维作为一种深层过滤介质,在酒类、口服液、医用药液等的澄清处理中得到广泛应用。常见的过滤板一般分为两种:一种是由合成纤维和植物纤维材料制造的过滤板；另一种是由石棉和纸浆制成的过滤板。前者造价较高,且过滤精度低,通量小,易堵塞；后者造价虽不高但过滤精度和通量同样不高,过滤效果也不好,特别是石棉制品是国家限制使用的材料。
4.传统深层过滤介质由以下组成：(1)纤维素，(2)助滤剂，以及(3)湿强树脂，其中滤剂可选基于二氧化硅等矿物来源的助滤剂比如珍珠岩或沙子，或可选源自天然材料如木材或椰子壳的活性炭助滤剂，其制成的滤板含灰率高。目前全球使用的助滤剂中,硅藻土占75％～80％,如啤酒的第一级过滤大多采用硅藻土过滤，少见到微晶纤维素作为深层过滤介质的助滤剂用于细胞培养物以及血浆及其衍生物(血浆级分组分)的过滤。微晶纤维素(microcrystallinecellulose，mcc)是天然纤维素经稀酸水解至极限聚合度(loop)的可自由流动的极细微的短棒状或粉末状多孔状颗粒，颜色为白色或近白色，无臭、无味，颗粒大小一般在20～80μm，极限聚合度(lodp)在15～375，不具纤维性而流动性极强。微晶纤维素不溶于水、稀酸、有机溶剂和油脂，在稀碱溶液中部分溶解、润涨，在羧甲基化、乙酰化、酯化过程中具有较高的反应性能。由于具有较低聚合度和较大的比表面积等特殊性质，微晶纤维素被广泛应用于医药、食品、化妆品以及轻化工行业。在制药工业中，微晶纤维素常用作吸附剂、助悬剂、稀释剂、崩解剂，尤其广泛应用于药物制剂，主要在口服片剂和胶囊中用作稀释剂和粘合剂，不仅可用于湿法制粒也可用于干法直接压片。微晶纤维素因具有一定的润滑和崩解作用，在片剂制备中非常有用，也可用作药品的缓释剂。
5.实际工业上可用的深层过滤介质含灰率高且不完全适用于过滤性差的血浆人凝血因子viii(fviii，factor viii)或血管性血友病因子(vwf，von willebrand factor)或fviii与vwf的复合物等分离纯化过程中样品的过滤。
6.目前国内外血液制品企业所使用的滤板主要由美国3m、pall、eaton等公司生产，其常用的型号有3m公司的sp系列滤板、pall公司的p系列滤板，以及eaton公司的beco系列滤板等。这些滤板为了解决血液样品的可滤过性问题，滤板的含灰率仍十分高，如eaton公
司beco pr steril40滤板含灰率49％，pall公司专为血制品分离开发的50p滤板，高纯度滤材，湿强度高，纤维脱落少，al/fe离子析出量低，易于操作，滤板表面具有疏水性，易于蛋白回收，提高效率，但其滤板含灰率仍高达23％。
7.包含fviii和/或vwf的血浆或血浆衍生物过滤性差，一方面与样品本身粘度大的性质有关，比如s/d病毒灭活前后的液体因含有大量的吐温80、纤连蛋白(fn，fibronection)、脂质蛋白等杂质而异常粘稠难过滤。其中吐温80本身是高度粘稠的液体，而血浆纤连蛋白广泛的生物活性使得含有纤连蛋白的液体粘度较普通蛋白溶液高。血浆纤连蛋白则是一种分子量为440-500kda的糖蛋白，以二聚体的形式存在于血浆中，具有相对高的含糖量(约5％)和可溶性，可与多种细胞外物质比如肝素、纤维蛋白原、胶原、唾液酸等相互作用。再比如血浆冷沉淀溶解液经铝凝胶吸附后所得铝凝胶沉淀呈粘稠浆糊状，非常难分离。另一方面，人凝血因子viii(fviii，factor viii)或血管性血友病因子(vwf，von willebrand factor)或fviii与vwf的复合物分离纯化样品过滤性差可能与活性组分分子量过大有关。人凝血因子fviii是由a1-a2-b、a3-c1-c2两个结构域构成的异二聚体，具有2351个氨基酸残基，通常与vwf因子形成复合物。人血浆中vwf单体分子量约为250kda，多聚体分子量为500～20000kda，是目前血浆中已知的分子量最大的蛋白。因此，在人血浆fviii或vwf或fviii与vwf的复合物的制备过程中，深层过滤介质堵塞情况严重，而频繁更换过滤器使得生产不连续、成本大幅增加，因此fviii或vwf或fviii与vwf的复合物的分离纯化多采用离心或膜过滤法，较少采用深层过滤法。比如专利cn10534838a公开了一种高纯人凝血因子viii的制备方法，其各工艺步骤主要通过0.45μm滤芯过滤(膜过滤法)相互衔接；再比如专利cn107226859a公开了一种高纯人凝血因子viii的制备方法，仅在s/d病毒灭活前采用了美国cuno公司的delp深层滤芯(cuno delp深层滤芯)过滤样品，其他各工艺步骤采用压滤法替代高速离心以提高分离效果。但是如产品使用说明书公开，cuno delp深层滤芯与血浆及其级分组分中的脂类产生亲和吸附作用以去除脂类杂质，无法进一步应用到其他纯化步骤中，且过滤速率有限，难以实现产业化。
8.其它样品粘度大的血浆蛋白比如纤维蛋白原、人凝血因子ix、人凝血酶原复合物等的分离纯化，以及样品粘度大的细胞培养物的过滤面临同样的问题，因此选择合适的过滤介质是困难的。高粘度液体过滤的主要目的是除去其中的颗粒状杂质。这些颗粒大部分是多种形态的胶粒和半胶粒、非均质性杂质或来自原料的固体颗粒，颗粒力度范围大致0-100μm，大部分小于20μm，极易堵塞过滤介质的空隙。因此选择适合高粘度液体过滤的过滤介质是比较困难的，必须考虑过滤前后的堵塞程度、粘度、侵蚀性、时稳性(因为一些聚合物溶液有触变性)、耐热性、过滤速率的极限、介质-颗粒-滤液间的荷电和电位差、安全条件、生产规模等(2003上海国际产业用纺织品和非织造布研讨会暨第二届高新技术在产业用纺织品领域推广应用研讨会，《高粘度液体的过滤》，东北大学，徐新阳等)。
9.而无论是重组来源还是血浆来源的凝血因子类蛋白的分离纯化，较少考虑添加助滤剂以提高过滤效果。原因在于，制药领域常用助滤剂主要有两种，一种是珍珠岩，一种是硅藻土，二者均含有一定量的ca
2
、al、fe、k

等金属离子。而一旦将过量al、fe、ca
2
、k

引入纯化体系，凝血因子将被不同程度地激活，不可避免地形成纤维蛋白凝块，进而影响中间品的过滤性以及最终制剂的性能和收率(《输血疗法与血液制剂》，刘隽湘)。
10.因此，药品生产领域存在进一步提高粘度较大样品的过滤性的现实需求，对应的
深层过滤方法或深层过滤介质有待进一步研究。


技术实现要素：

11.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了一种深层过滤介质以及深层过滤系统以用于粘度较大样品的过滤，该深层过滤介质或过滤系统可有效提高粘度较大样品的过滤性，进而提高生产效率，降低生产成本，适于规模化生产和应用。
12.需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
13.一直以来，血浆来源的、包含人凝血因子viii或vwf或凝血因子viii与vwf复合物的血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀因为其粘稠浆糊状的特点非常难过滤，工业上通常利用管式冷冻连续流离心机，通过高速离心的方法或压滤法来实现固液分离，但是离心的分离方法缺点明显：一是工作环境差、设备要求高，二是离心产生的剪切力不利于蛋白质的稳定性，人源凝血因子viii或vwf活性损失较大。另外一些现实的情况是，血浆冷沉淀凝胶吸附后得到的上清液经s/d病毒灭活后为了避免后续层析工艺中层析柱堵塞，也需要进一步过滤以除去其中的固体颗粒。但是因为s/d病毒灭活后样品含有高度粘稠的吐温80以及高糖含量的纤连蛋白，同样非常难过滤，工业上多采用膜过滤方法过滤s/d病毒灭活样品，但是过滤效率低，过滤成本高。
14.发明人尝试在深层过滤用滤板的进液端增设微晶纤维素助滤剂层以过滤血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀，相比于单独使用深层过滤用滤板过滤，过滤效率显著提高。比如用supradur50p滤板进液端加微晶纤维素助滤剂层过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀，过滤效率大幅提高。进一步地，发明人对血浆冷沉淀铝凝胶吸附离心后样品、s/d病毒灭活样品等过滤性差的样品进行了类似的尝试并观察到了一致的过滤效果。
15.因此，本发明的第一个方面，本发明提出了一种深层过滤介质，包含助滤剂，所述助滤剂包含微晶纤维素。
16.进一步地，按质量百分比计，所述微晶纤维素的含量不低于助滤剂总质量的2％。
17.根据本发明实施例，所述微晶纤维素的粒径不高于500μm。
18.根据本发明实施例，所述微晶纤维素的粒径不高于200μm。
19.根据本发明实施例，所述微晶纤维素的粒径为20μm～100μm。
20.根据本发明实施例，所述深层过滤介质可以是梯度式分布或混合式分布。
21.进一步地，所述深层过滤介质适应的过滤器可以是滤板过滤器、滤盘过滤器、滤芯过滤器或滤堆过滤器。
22.根据本发明的实施例，所述深层过滤介质还包括膜过滤层。
23.根据本发明的实施例，所述膜过滤层的过滤孔径优选0.1～10μm。
24.在具体的实施方式中，所述深层过滤介质层任选自supradur p滤板、k300滤板、becopad p 270滤板中的一种或多种。
25.进一步地，所述微晶纤维素可选自α
–
微晶纤维素、改性微晶纤维素或微晶纤维素的衍生物中的一种或多种。
26.更进一步地，所述α-微晶纤维素是从含纤维素植物的纤维浆制得的结晶α-纤维素。
27.在具体地应用场景中，上述深层过滤介质可以用于过滤水相待过滤液体，尤其适用粘度高或有效成分复杂、过滤效率差的水相液体过滤。具体地，可以用于过滤细胞培养物或细胞培养物的衍生物，也可以用于血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
28.在一些具体实施方式中，上述深层过滤介质可以用于过滤包含人凝血因子viii和/或vwf的血浆或血浆级分组分或以其为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
29.在一些具体实施方式中，上述深层过滤介质可以用于过滤cohn法级分组分，也可以用于过滤nk法级分组分。
30.在另一些实施方式中，上述深层过滤介质还可以用于包含人凝血因子viii或vwf或人凝血因子viii与vwf复合物或人纤维蛋白原或人凝血因子ix或人凝血酶原复合物的血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀或血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀过滤溶液及其纯化中间品或病毒灭活后的样品。
31.在具体实施方式中，当微晶纤维素的含量占助滤剂总质量的质量百分比增高时，所述待过滤液体的过滤效率随之提高。
32.在具体实施方式中，当微晶纤维素的粒径过小，所述待过滤液体的过滤效率提高程度有限。
33.本发明的第二个方面，本发明提出了能基本实现上述深层过滤介质过滤效果的深层过滤系统，包括微晶纤维素助滤剂层和含或不含微晶纤维素的深层过滤介质层。
34.优选地，所述深层过滤介质层如本发明第一方面所述。
35.优选地，按单位面积滤材含有微晶纤维素的质量计，所述微晶纤维素的含量不低于10g/m2。
36.在具体地应用场景中，上述深层过滤系统可以用于过滤水相待过滤液体，尤其适用粘度高或有效成分复杂、过滤效率差的水相液体过滤。所述水相液体依次通过微晶纤维素助滤剂层和含或不含微晶纤维素的深层过滤介质层和/或膜过滤层，进一步改善难过滤样品的过滤效率和或对胶粒、半胶粒、非均质性杂质或其他颗粒物的去除。
37.具体地，可以用于过滤细胞培养物或细胞培养物的衍生物，也可以用于血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
38.在一些具体实施方式中，上述深层过滤系统可以用于过滤包含人凝血因子viii和/或vwf的血浆或血浆级分组分或以其为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
39.在一些具体实施方式中，上述深层过滤介质可以用于过滤cohn法级分组分，也可以用于过滤nk法级分组分。
40.在另一些实施方式中，上述深层过滤系统还可以用于包含人凝血因子viii或vwf或人凝血因子viii与vwf复合物或人纤维蛋白原或人凝血因子ix或人凝血酶原复合物的血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀或血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀过滤溶液及其纯化中间品或病毒灭活后的样品。
41.本发明的再一个方面，本发明提出了一种利用上述深层过滤介质或深层过滤系统在过滤水相待过滤液体中的应用。
42.根据本发明实施例，所述待过滤液体来自细胞培养物或细胞培养物的衍生物。
43.根据本发明实施例，所述待过滤液体来自血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆
级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
44.根据本发明实施例，所述细胞培养物或细胞培养物的衍生物含有重组凝血因子viii和/或vwf。
45.根据本发明实施例，所述血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品含有人凝血因子viii和/或vwf。
46.根据本发明实施例，所述血浆级分组分来自cohn
′
s低温乙醇反应系统或nk低温乙醇改良反应系统。
47.在一些具体实施方式中，所述细胞培养物的衍生物可以是包含重组凝血因子viii或重组vwf或重组凝血因子viii与重组vwf复合物的细胞培养物的纯化中间品或病毒灭活或去除后的样品。
48.在一些具体实施方式中，以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品可以是蛋白纯化中间品或病毒灭活或去除后的中间品。
49.在一些具体实施方式中，血浆级分组分可以是包含人凝血因子viii或vwf或人凝血因子viii与vwf复合物或人纤维蛋白原或人凝血因子ix或人凝血酶原复合物的血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀或血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀过滤溶液及其纯化中间品或病毒灭活后的样品。
50.在一些具体实施方式中，上述血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀是血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀。
51.在一些具体实施方式中，上述病毒灭活是s/d病毒灭活。
52.与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：
53.1、本发明公开的深层过滤介质或深层过滤系统可用于粘度较大样品的过滤，过滤效率高。如本发明实施例公开，与现有深层过滤介质相比，当本发明公开的深层过滤介质或深层过滤系统用于过滤包含重组或人源凝血因子viii或vwf或凝血因子viii与vwf复合物的生物样品时，过滤效率显著提高，过滤量普遍调高约50％以上。
54.2、本发明公开的深层过滤介质或深层过滤系统过滤粘度较大的样品，相对活性回收率高。如本发明实施例公开，与常见的滤板 硅藻土深层过滤方法相比，本发明公开的滤板 微晶纤维素过滤方法，不仅过滤量显著提高，而且fviii、vwf等活性成分回收率大幅提高。
55.3、本发明公开的深层过滤方法可替代或部分替代传统高速离心的方法或压滤法以实现样品的固液分离，降低对生产设施设备的要求，加之过滤效率高，因此过滤成本相应降低。
56.4、本发明公开的深层过滤介质可与膜过滤介质联合应用，一方面多种过滤原理的综合运用有助于进一步提高血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀、s/d病毒灭活溶液等复杂样品的过滤效果，有效去除胶粒、半胶粒、非均质性杂质或来自其他颗粒物，可获得符合要求的澄清溶液，利于工艺步骤间的相互衔接，避免后续层析过程中层析柱堵塞等问题发生，提高大规模生产过程的自动化操作的可行性。另一方面，多种过滤方法的巧妙组合，也保证了s/d病毒灭活的效果、提高了产品质量的可靠性。根据本发明实施例，利用本发明公开的深层过滤介质或方法制备得到的人凝血因子viii成品按中国药典成品检定项主要质量指标检测结果合格，可见异物指标符合药典要求。
57.本发明公开的助滤剂包含微晶纤维素的深层过滤介质，降低了二氧化硅等传统矿物质来源的助滤剂的应用，可一定程度上降低深层过滤介质的含灰率。
58.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
59.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
60.一方面，本发明提出了一种包含助滤剂的深层过滤介质，其中助滤剂包含微晶纤维素。
61.传统深层过滤介质由以下组成：(1)包含纤维的材料，(2)助滤剂(比如硅藻土等硅质吸附剂颗粒)，以及(3)粘结剂(比如湿强树脂等粘结剂树脂)。根据不同的待过滤样品对过滤性能的不同要求，本领域技术人员可以通过调整优化过滤介质各组分的含量以及配比从而得到特定性能改善的过滤介质。本发明所使用术语“湿强树脂”是本领域已知的，它们是水溶性合成聚合物，具有阴离子和/或阳离子基团，用来在湿润时赋予材料强度，比如可以是基于尿素或三聚氰胺-甲醛的聚合物、聚氨基聚酰胺-表氯醇(pae)聚合物和乙醛酸化的聚丙烯酰胺(gpam)。
62.吸附型深层过滤介质使用多种材料来过滤流体，包括包含纤维的材料和各种吸附剂颗粒物，还可以包括其他材料，例如玻璃纤维或合成纤维(例如，聚丙烯纤维或聚乙烯纤维)。已知的吸附型深层过滤介质通常包括30％至50％的纤维。有些情况下，纤维占总过滤介质重量的百分比可以低至10％。通过最大化深层过滤介质层中的细颗粒吸附剂颗粒的数量，可以增强过滤器的性能。常用的细颗粒吸附剂颗粒包括硅藻土、珍珠岩，滑石粉，硅胶，活性炭，石棉，分子筛，粘土等。在工业应用领域，使用最广泛的是硅质材料，例如硅藻土或珍珠岩。
63.根据本发明实施例，按质量百分比计，本发明的深层过滤介质，助滤剂包含微晶纤维素。
64.进一步地，发明人研究发现，为了获得预期的过滤性，微晶纤维素的含量和粒径大小对于不同的待过滤液体是不同的。
65.根据本发明实施例，所述微晶纤维素的含量不低于助滤剂总质量的2％。根据待过滤液体的粘性、蛋白含量及分子量大小等性能，可提高微晶纤维素在助滤剂中的含量占比以获得预期的过滤性。
66.进一步地，根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，所述微晶纤维素的含量可以是100g/m2，在一些具体实施方式中，所述微晶纤维素的含量可以是1000g/m2，在另一些具体实施方式中，所述微晶纤维素的含量可以是2000g/m2。
67.根据本发明实施例，所述微晶纤维素的粒径不高于500μm。根据待过滤液体的粘性、蛋白含量及分子量大小等性能，选择合适大小粒径的微晶纤维素以获得预期的过滤性。
68.进一步地，根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，所述微晶纤维素的粒径不高于200μm；
69.进一步地，根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，包括端点值，所述微晶纤
维素的粒径在20μm～100μm之间。
70.进一步地，本发明的深层过滤介质可以是梯度式分布或混合式分布。具体地，本发明的深层过滤介质适应的过滤器，包括不限于，可以是滤板过滤器、滤盘过滤器、滤芯过滤器或滤堆过滤器。
71.根据本发明实施例，对于本领域技术人员来说，将包含纤维的材料、包含微晶纤维素的助滤剂以及湿强树脂制成加工规模的、可用于过滤粘度较大样品的深层过滤介是可实现的。进一步地，可选的加工方法包括不限于：气流成网(air-laying)、熔压(melt-pressing)、机械压缩和湿法成网等。根据实际研发生产需要，任选地可以通过碾压机进行压缩以调整过滤介质的厚度。
72.根据本发明实施例，本领域技术人员可将上述深层过滤介质根据实际需要进一步加工成或组装成滤板、滤盘、滤芯或滤堆等适应研发或生产活动开展的不同形式的过滤器。这些过滤器的形式是本领域常见的，对于本领域技术人员来说，也是可以实现的。
73.根据本发明实施例，本发明深层过滤介质还包括膜过滤层。
74.进一步地，所述膜过滤层的过滤孔径优选0.1～10μm。
75.在一些具体实施方式中，所述膜过滤层设置在深层过滤介质的出液端。
76.在一些具体实施方式中，所述膜过滤层设置在深层过滤介质的进液端。
77.根据本发明实施例，本发明所述微晶纤维素可选自α
–
微晶纤维素、改性微晶纤维素或微晶纤维素的衍生物中的一种或多种。
78.进一步地，在一些具体实施方式中，所述α-微晶纤维素是从含纤维素植物的纤维浆制得的结晶α-纤维素。
79.进一步地，在一些具体实施方式中，所述微晶纤维素可选惰性更强的硅化微晶纤维素，或生物兼容性更好以及机械性能优良的纳米级微晶纤维素，进一步得到本发明的性能改良的深层过滤介质。
80.进一步地，在一些具体实施方式中，所述微晶纤维素可选可作为药物辅料的从含纤维素植物的纤维浆制得的结晶α-纤维素，进一步得到本发明的深层过滤介质。
81.另一个方面，根据本发明实施例，本发明提出了能基本实现本发明深层过滤介质过滤效果的深层过滤系统，包含微晶纤维素助滤剂层和含或不含微晶纤维素助滤剂的深层过滤介质层。
82.在一些具体实施方式中，所述深层过滤介质层可以是本发明的深层过滤介质。
83.在一些具体实施方式中，按单位面积滤材含有微晶纤维素的质量计，所述微晶纤维素的含量不低于10g/m2。针对某些特定液体的过滤，比如层析前的包含viii和/或vwf的样品，微晶纤维素的含量低至10g/m2可观察到过滤效率明显提高。
84.在一些具体实施方式中，根据本发明实施例，深层过滤介质层可选，包括不限于supradur p滤板、k300滤板、becopad p 270滤板中的一种或多种。
85.进一步地，根据本发明实施例，本发明深层过滤系统还包括膜过滤层。
86.进一步地，所述膜过滤层的过滤孔径优选0.1～10μm。
87.在一些具体实施方式中，所述膜过滤层设置在深层过滤系统的出液端。
88.在一些具体实施方式中，所述膜过滤层设置在深层过滤系统的进液端。
89.发明人在实践中发现，上述深层过滤系统尤其适用于血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀类
粘稠浆糊状样品的过滤，其过滤量得到有效提高。根据本发明实施例，可以预见上述深层过滤系统对于其它高粘度样品，尤其对于包含重组或人源凝血因子viii或vwf或凝血因子viii与vwf复合物的生物样品的过滤是有利的。
90.发明人在实践中，还将本发明公开的深层过滤介质与膜过滤介质联合应用以尝试提高过滤效果。根据本发明实施例，本发明公开的深层过滤介质或深层过滤系统与膜过滤介质联合应用，有助于进一步提高血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀、s/d病毒灭活溶液等复杂样品的过滤效果，有效去除胶粒、半胶粒、非均质性杂质或来自其他颗粒物，获得符合要求的澄清溶液。
91.本发明的上述探索发现，从优化药品的生产工艺来看，有利于工艺步骤间的相互衔接，避免后续层析过程中层析柱堵塞等问题发生，提高大规模生产过程的自动化操作的可行性；从提高产品质量水平来看，确保了s/d病毒灭活的效果、提高了产品质量的可靠性。根据本发明实施例，利用本发明公开的深层过滤介质或方法制备得到的人凝血因子viii成品按中国药典成品检定项全检结果合格率高，可见异物指标符合药典要求，合格率高。
92.再一方面，根据本发明实施例，本发明提出了利用上述深层过滤介质或深层过滤系统在过滤水相待过滤液体中的应用。
93.根据本发明实施例，所述待过滤液体可以来自细胞培养物或细胞培养物的衍生物。
94.根据本发明实施例，所述待过滤液体可以来自血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品。
95.根据本发明实施例，所述细胞培养物或细胞培养物的衍生物含有重组凝血因子viii和/或vwf。
96.根据本发明实施例，所述血浆或血浆级分组分，或以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品含有人凝血因子viii和/或vwf。
97.根据本发明实施例，所述血浆级分组分来自cohn
′
s低温乙醇反应系统或nk低温乙醇改良反应系统。
98.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，所述细胞培养物的衍生物可以是包含重组凝血因子viii或vwf或凝血因子viii与vwf复合物的细胞培养物的纯化中间品或病毒灭活或去除后的样品。
99.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，以血浆或血浆级分组分为原料分离纯化血浆蛋白的中间品可以是蛋白纯化中间品或病毒灭活或去除后的中间品。
100.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，所述血浆级分组分可以是血浆cohn法级分组分。
101.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，所述血浆级分组分可以是血浆nk法级分组分。
102.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，血浆级分组分可以是包含人源凝血因子viii或vwf或凝血因子viii与vwf复合物或人纤维蛋白原或人凝血因子ix或人凝血酶原复合物的血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀或血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀过滤溶液及其纯化中间品或病毒灭活后的样品。
103.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，上述血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀是血
浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀。
104.根据本发明实施例，在一些具体实施方式中，上述病毒灭活是s/d病毒灭活。
105.本发明所述的“包含纤维的材料”指可用于制成深层过滤材料的包含纤维的材料，其与水性介质接触时通常会膨胀。由包含纤维的材料制成的深层过滤材料可被压缩，当过滤材料被压缩低于其原始厚度后，在一定范围内不破坏滤层的完整性。最大压缩程度取决于过滤材料的其他组分，比如湿强树脂、助滤剂含量的多少以及与纤维的结合程度等。已知的吸附深度型过滤介质通常包括30％至50％的纤维。有些情况下，纤维占总过滤介质重量的百分比可以低至10％。
106.本发明所述的“微晶纤维素”(microcrystallinecellulose，mcc)是天然纤维素经稀酸水解至极限聚合度(loop)的可自由流动的极细微的短棒状或粉末状多孔状颗粒，颜色为白色或近白色，无臭、无味，颗粒大小一般在20～80μm，极限聚合度(lodp)在15～375，不具纤维性而流动性极强。
107.本发明所述的“微晶纤维素”在一些具体实现形式中，可以延伸至α
–
微晶纤维素、改性微晶纤维素或微晶纤维素的衍生物。比如惰性更强的硅化微晶纤维素、生物兼容性更好以及机械性能优良的纳米级微晶纤维素等。
108.本发明所称“血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀”通常来源于健康人血浆的血浆冷沉淀，将其用中性ph缓冲液或注射用水溶解后，加al(oh)3凝胶或a50凝胶比如deae sephadex a-50凝胶吸附，得到粘稠浆糊状物。血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀可进一步用于制备fviii制品或vwf制品。
109.本发明所使用的术语“s/d病毒灭活方法”指用有机溶剂/去污剂混合物(s/d)破坏包膜病毒的脂膜的方法。一旦破坏脂膜的病毒不可能再与感染细胞结合。该法能有效的灭活脂包膜病毒，但不能灭活非包膜病毒。通常s/d的工作液浓度是tnbp 0.3％、tween-80 1.0％。
110.本发明所使用的术语“cohn
′
s低温乙醇反应系统”指cohn低温乙醇法级分血浆蛋白的方法，是血液制品可工业化生产的方法。经典cohn低温乙醇法有cohn 6法、cohn 9法、cohn 10法。对应分馏得到的包含特定种类和数量血浆蛋白组分即“血浆级分组分”有fi、fii、fiii、fiv、fv和fvi等。
111.本发明所使用的术语“nk低温乙醇改良反应系统”也是一种低温乙醇级分血浆蛋白的方法，有时也称为“nk变法”、“nk法”，与cohn原法主要不同在于：1、沉淀相当于cohn fii iii的沉淀a时降低了ph和乙醇的浓度；2、从相当于cohn s
2,3
中直接沉淀白蛋白，省略了分离fiv1的步骤；3、参考cohn10法，从沉淀a中萃取丙球蛋白，而不是将沉淀溶后再沉淀。nk变法比cohn原法减少40％的乙醇消耗，缩短了工作体积22％，工艺周期缩短了2天，回收率提高(白蛋白可达90％，丙球可达89％)，纯度与原法相当。
112.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
113.实施例1血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀、fviii和/或vwf复合物溶液s/d病毒灭活样品获得
114.来源于健康人血浆的血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀可参照专利us5714590，通过如下方法获得：取血浆冷沉淀用2倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m醋酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。然后按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.5-6.6，获得混悬液即血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀。
115.进一步将血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀高速离心并收集上清液，然后加入tween 80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24～26℃，保温6小时，获得fviii/vwf复合物溶液s/d病毒灭活样品。
116.可选地，fviii或vwf或fviii与vwf的复合物溶液可以通过重组技术在转基因细胞或动物中生物合成获得。
117.如未特别说明，实施例2-8样品过滤，样品先经过微晶纤维素或硅藻土，然后经过滤板。
118.实施例2深层过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀
119.按实施例1折合血浆冷沉淀10kg投料，取血浆冷沉淀铝凝胶吸附混悬液过滤。裁取等面积滤材分组过滤试验：取商业滤材0.1m2，助滤剂为1.微晶纤维素(粒径180μm～200μm)、2.硅藻土，各约200g，16～26℃条件下，以大约0.1～0.5mpa压力下的流速深层过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀直至压降显著升高，即不能继续过滤。
120.商业滤材及具体过滤方案如下：
121.a：supradur50p滤板
122.b：k300滤板
123.c：becopad p 270滤板
124.a1：supradur50p滤板 微晶纤维素
125.a2：supradur50p滤板 硅藻土
126.b1：k300滤板 微晶纤维素
127.b2：k300滤板 硅藻土
128.c1：becopad p 270滤板 微晶纤维素
129.c2：becopad p 270滤板 硅藻土
130.上述几种过滤方案过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀直至压降显著升高无法过滤时的过滤量、fviii/vwf相对平均活性回收率见下表。
[0131][0132]
*过滤效率用百分比(％)表示，过滤效率＝压降显著升高无法过滤时的过滤量/总待过滤量*100％，下同。
[0133]
上述实验结果表明，相对滤板深层过滤，在特定情况下，增加助滤剂层可提高过滤量和fviii、vwf相对平均活性回收率。滤板 微晶纤维素的过滤量普遍提高约50％以上，尤其是当选用supradur50p滤板或k300滤板 微晶纤维素过滤方案时，过滤量超过85％。
[0134]
出乎发明人预料的是，相对滤板 硅藻土深层过滤，增加了微晶纤维素的深层过滤，过滤量显著提高，fviii、vwf相对平均活性回收率大幅提高。
[0135]
为了进一步去除颗粒物，获得更澄清的液体以保证s/d病毒灭活效果，发明人进一步将实施例2过滤方案a1深层过滤后得到的滤液经(a1-1)0.45μm、(a1-2)0.8μm、(a1-3)1μm滤芯过滤：16～26℃条件下，以大约0.05～0.3mpa压力下的流速深层过滤a1滤液直至压降升高，不能继续过滤。
[0136]
滤板 微晶纤维素深层过滤串联不同孔径滤芯的过滤量、fviii/vwf相对平均活性回收率见下表：
[0137][0138]
上述实验结果表明，本实施例的深层过滤方案串联0.45μm、0.8μm、1μm滤芯过滤，过滤效率未见明显降低，且fviii、vwf相对平均活性回收率未见明显降低。
[0139]
实施例3深层过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀的高速离心后的上清液
[0140]
按实施例1折合血浆冷沉淀10kg投料，取血浆冷沉淀铝凝胶吸附混悬液离心上清液过滤。裁取等面积滤材分组过滤试验：取商业滤材0.1m2，助滤剂为1.微晶纤维素(粒径100μm～150μm)、2.硅藻土，各约100g，16～26℃条件下，以大约0.1～0.5mpa压力下深层过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀直至压降显著升高，即不能继续过滤。
[0141]
过滤方案同实施例2。
[0142]
上述几种过滤方案过滤血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀直至压降显著升高无法过滤时的过滤量、fviii/vwf相对平均活性回收率见下表：
[0143][0144]
上述实验结果表明，当微晶纤维素与滤材的重量面积比为1000g/m2时，本发明的深层过滤方案的过滤效率和fviii、vwf相对平均活性回收率进一步提高。
[0145]
为了进一步去除颗粒物，获得更澄清的液体以保证s/d病毒灭活效果，发明人进一步将实施例3过滤方案a1深层过滤后得到的滤液经(a1-1)0.45μm、(a1-2)0.8μm、(a1-3)1μm滤膜过滤，即“一张板一张膜”，16～26℃条件下，以大约0.05～0.3mpa压力下的流速深层过滤a1滤液直至压降升高，即不能继续过滤。
[0146]
滤板 微晶纤维素深层过滤串联不同孔径滤膜的过滤量、fviii/vwf相对平均活性回收率见下表：
[0147][0148]
上述实验结果表明，本实施例的深层过滤方案串联0.45μm、0.8μm、1μm滤膜过滤，过滤效率大，且fviii、vwf相对活性回收率与实施例2相比未见降低。
[0149]
实施例4深层过滤fviii/vwf复合物溶液s/d病毒灭活样品
[0150]
通过0.1m2的supradur50p滤板(a)，以及0.1m2的supradur50p滤板和0.1kg的微晶纤维素(a1)，以及0.1m2的supradur50p滤板和0.2kg的微晶纤维素(a2)，16～26℃条件下，以大约0.05～0.3mpa压力下的流速深层过滤实施例1获得的fviii/vwf复合物溶液经s/d病毒灭活后的样品直至压降升高，不能继续过滤。
[0151]
微晶纤维素粒径：80μm～150μm。
[0152]
上述3种深层过滤方式的过滤效率、fviii/vwf相对平均活性回收率见下表：
[0153][0154]
上述实验结果表明，本发明的深层过滤方案也适用于高去污剂含量的粘稠液体过滤。
[0155]
在s/d病毒灭活步骤后，fviii和/或vwf的制备，通常接离子交换层析纯化步骤。而层析样品上样前如果未充分过滤，一方面容易发生层析介质堵塞、层析柱爆管的现象，另一方面层析介质频繁再生处理影响其使用寿命。因此，发明人在上述研究基础上，进一步考察了本实施例过滤方案a1深层过滤后得到的滤液经(a1-1)0.45μm、(a1-2)0.65μm、(a1-3)0.8μm滤膜过滤的过滤效率和fviii/vwf相对平均活性回收率。实验结果见下表：
[0156][0157]
上述实验结果表明，本实施例的深层过滤方案串联0.45μm、0.65μm、0.8μm滤膜过滤，过滤量大，且fviii、vwf相对平均活性回收率未见明显降低。
[0158]
实施例5本发明深层过滤法从血浆中制备fviii
[0159]
冷沉淀溶解：取血浆冷沉淀用2倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m醋酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。
[0160]
铝凝胶吸附并深层过滤：按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.0-6.6，获得血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀。然后经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.8μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0161]
s/d病毒灭活并深层过滤：加入tween80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24-26℃，保温6小时。然后经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.45μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0162]
阴离子交换层析：上述澄清滤液上fractogel tmae 650m阴离子交换层析，层析柱凝胶高度不高于柱子的直径。装填阴离子凝胶的层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡(120mm氯化钠，10mm柠檬酸钠
·
5h2o，120mm甘氨酸，1mm氯化钙
·
2h2o，ph 6.5-7.5)然后上样。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗涤缓冲液(120-200mm的氯化钠，10mm柠檬酸钠
·
5h2o，120mm甘氨酸，1mm氯化钙
·
2h2o，ph 6.9-7.0)洗涤柱子，再用洗脱缓冲液(400mm氯化钠，20mm柠檬酸钠
·
5h2o，200mm甘氨酸，1.0mm氯化钙
·
2h2o，ph值6.8至7.4)洗脱，收集纯化的fviii溶液。
[0163]
阴离子层析纯化洗脱液进一步经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.45μm滤膜16～26℃过滤、超滤、除菌过滤。
[0164]
超滤透析液含：20mm枸橼酸钠，10g/l白蛋白，35g/l盐酸精氨酸；ph 7.2。
[0165]
除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂200mm的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)后即得f
ⅷ
成品。
[0166]
实施例6本发明深层过滤法从血浆中制备fviii
[0167]
冷沉淀溶解：取血浆冷沉淀用3倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m醋酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。
[0168]
铝凝胶吸附并深层过滤：按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.0-6.6，获得血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀，高速离心并收集上清液。离心上清液经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.65μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0169]
s/d病毒灭活并深层过滤：加入tween80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24-26℃，保温6小时。然后经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.8μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0170]
阴离子交换层析：同实施例5。
[0171]
阴离子层析纯化洗脱液进一步经超滤、除菌过滤。
[0172]
超滤透析液含：10mm枸橼酸钠，10g/l甘氨酸；ph 7.2。
[0173]
分装前按成品配制并除菌过滤，分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃
×
30min或80℃
×
7 2h)后即得fviii成品。
[0174]
实施例7本发明深层过滤法从血浆中制备fviii
[0175]
冷沉淀溶解：取血浆冷沉淀用2倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m醋酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。
[0176]
铝凝胶吸附并深层过滤：按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.0-6.6，获得血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀，高速离心并收集上清液。离心上清液然后经p270滤板 微晶纤维素串联1.0μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0177]
s/d病毒灭活并深层过滤：加入tween80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24-26℃，保温6小时。然后经supradur50p滤板 微晶纤维素串联0.8μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0178]
阴离子交换层析：上述澄清滤液上captoq柱，柱子预先用平衡缓冲液充分平衡(缓冲液组成为0.02m tris-hcl，0.1m nacl，甘氨酸1.5％(wt％)，0.005m cacl2，ph6.80-7.40)；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.02m tris-hcl，0.25m nacl，甘氨酸1.5％(wt％)，0.005m cacl2，ph6.80-7.40)洗涤柱子，再用洗脱缓冲液(0.02m tris-hcl，2.0m nacl，甘氨酸1.5％(wt％)，0.00l m cacl2，ph6.50-6.60)洗脱，收集纯化的fviii溶液。
[0179]
阴离子层析纯化洗脱液进一步经超滤、除菌过滤。
[0180]
超滤透析液含：50mm氯化钠，10mm枸橼酸钠，1mm氯化钙，甘氨酸1.5％(wt％)；ph 7.0。
[0181]
除菌过滤后按成品规格配制。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)后即得fviii成品。
[0182]
实施例8本发明深层过滤法从血浆中制备fviii
[0183]
冷沉淀溶解：取血浆冷沉淀用5倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m盐酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。
[0184]
铝凝胶吸附并深层过滤：按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.0-6.6，获得血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀，高速离心并收集上清液。离心上清液然后经k300滤板 微晶纤维素串联1.0μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0185]
s/d病毒灭活并深层过滤：加入tween80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24-26℃，保温6小时。然后经k700滤板 微晶纤维素串联0.8μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0186]
阴离子交换层析：上述澄清滤液上q-sepharose-ff离子交换柱，上样完毕后用洗涤液洗涤柱子直至成基线，用洗脱液洗脱，收集纯化的fviii溶液。
[0187]
平衡液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，17.5g氯化钠，补加注射用水至1l，调节ph为6.5～7.5；洗涤液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，19.5g氯化钠，补加注射用水至1l，调节ph为6.5～7.5；洗脱液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，58.5g氯化钠，补加注射用水至1l，调节ph为6.5～7。
[0188]
阴离子层析纯化洗脱液进一步经超滤、除菌过滤。
[0189]
超滤透析液包含：120mm氯化钠，20mm枸橼酸钠，1mm氯化钙，10g/l组氨酸；ph 7.2。
[0190]
除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂100mm的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)后即得fviii成品。
[0191]
按《中国药典》的规定，检测实施例5～8制得的人凝血因子viii成品的主要质量指标，尤其关注检测可见异物。主要质量指标检测结果如下：
[0192][0193]
实施例2-8所采用的过滤方案，可通过助滤剂包含微晶纤维素的深层过滤介质，如实施例9或实施例10描述的深层过滤介质获得基本相近的技术效果。
[0194]
实施例9
[0195]
一种本发明所述的深层过滤介质，按质量份计，由下述原料组成：
[0196]
纤维：0.5份
[0197]
α-微晶纤维素：0.1份，粒径60μm：
[0198]
含硅助滤剂：0.2份
[0199]
聚氨基聚酰胺-表氯醇聚合物：0.05份
[0200]
通过本领域已知的湿法成网方法制得厚度为0.1cm-1.0cm的滤片，并进一步组装成滤板深层过滤器。
[0201]
进一步地，可参考cn102489075b公开的方法制成梯度式分布的滤片，并进一步组装成滤板深层过滤器。
[0202]
实施例10
[0203]
一种本发明所述的深层过滤介质，按质量份计，由下述原料组成：
[0204]
纤维：0.5份
[0205]
α-微晶纤维素：0.006份，粒径500μm：
[0206]
含硅助滤剂：0.294份
[0207]
聚氨基聚酰胺-表氯醇聚合物：0.05份
[0208]
通过本领域已知的湿法成网方法制得厚度为0.1cm-1.0cm的滤片，并进一步组装成滤板深层过滤器。
[0209]
进一步地，可参考cn102489075b公开的方法制成梯度式分布的滤片，并进一步组装成滤板深层过滤器。
[0210]
实施例9-10制得的深层过滤器用于过滤富含凝血因viii或vwf或其复合物的可过滤性差的血浆或血浆级分组分，过滤流速快，不易堵塞，优于市面常见不含微晶纤维素的深层滤板过滤效果。
[0211]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0212]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。