常染色体显性遗传型多囊肾病检测的试剂组合物及检测方法与流程

1.本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种常染色体显性遗传型多囊肾病检测的试剂组合物。


背景技术：

2.肾脏是一种排泄在体内代谢的并因此存在于血液中的各种物质的器官，特别是通过肾小球过滤和肾小管吸收和再吸收过滤血液，从而以尿液形式排出体内不必要的废物的器官。肾脏重量仅为体重的约0.5％，但流入肾脏的血液量为总心脏输出量的20％至25％。因此，由于血液中存在多种有毒的异生素，所以肾脏是最脆弱的器官之一。例如，当将过量的药物注入体内时，或者发生诸如心脏病、糖尿病和高血压等各种类型的代谢疾病时，肾脏可能非常缓慢地受损，并且最终停止肾功能而没有主观症状，例如有毒的异生素不会排泄到体外，从而导致额外的并发症。
3.常染色体显性遗传性多囊肾病(adult polycystic kidney disease，apkd，又称成人多囊肾病)是一种常见的先天遗传疾病，成人多囊肾病常于青中年时期被发现，也可在任何年龄发病，为常见的遗传性多发性囊肿性肾病，发病率约为1/1,000-1/400，约占末期肾脏病的5％。该疾病于中年时期在肾脏会慢慢形成囊肿及肿大，最后导致肾衰竭。常染色体显性多囊肾的诊断主要依靠影像学或分子遗传学检测来明确。对于影像学检测，在年龄30岁以上的患者或pkd1突变的年轻患者，检测的敏感度接近100％；而在30岁以下的pkd2突变年轻患者，检查的敏感度仅有67％。婴儿或者儿童在影像学检查中没有看到明显的囊肿。常染色体显性多囊肾患者虽然在胎儿时期和/或出生时就已经发生基因突变，但却在以后的生活中才出现多囊肾病的表现，许多患者在30岁前常因b超结果表现正常而漏诊。因此，连锁分析或直接突变筛查等分子遗传检测有临床价值，通过基因检测提早诊断成人多囊肾病成为新的研究热点之一。此外，对胎儿的多囊肾病产前基因筛查还可以进行早期诊断，有助于早期处理并发症。


技术实现要素：

4.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种常染色体显性遗传型多囊肾病检测的试剂组合物，以达到快速获得pkd1真基因的突变，并确保检测的特异性。
5.具体方案如下：
6.常染色体显性遗传型多囊肾病检测的试剂组合物，包括引物组；用于从样品提取基因组dna的第一试剂；利用所述引物组进行长片段pcr反应的第二试剂；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的第三试剂；以及用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的第四试剂。
7.进一步的，所述第一试剂包括：
8.第一缓冲液：0.2m edta2na，0.1m tris-hcl，1.5m nacl，0.1m nah2po4和0.1m na2hpo4，ph调成7.5，去离子水定容成1l，高温高压灭菌；
9.30mg/ml溶菌酶：20mm tris-hcl，2mm edta，体积分数为1.2％的triton x-100；
10.10wt％ctab；
11.第二缓冲液：称取0.5g ctab，用第一缓冲液定容至50ml；
12.20％阴离子表面活性剂：称取5g硬脂酸钠和5g十二烷基硫酸钠，用无菌水定容至50ml，68℃水浴加热溶解，ph调成7.5；
13.苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)；
14.氯仿：异戊醇(24：1)；
15.异丙醇(4℃)预冷，70％乙醇；
16.rnase-free water；
17.omega bacterial dna kit；
18.蛋白酶k 20mg/ml。
19.进一步的，所述引物组包括用于扩增pkd1基因外显子2-7的引物，其正向引物和反向引物分别如seq id no:1和seq id no:2所示；
20.用于扩增pkd1基因外显子8-12的引物，其正向引物和反向引物分别如seq id no:3和seq id no:4所示；
21.用于扩增pkd1基因外显子13-21的引物，其正向引物和反向引物分别如如seq id no:5和seq id no:6所示；
22.用于扩增pkd1基因外显子22-34的引物，其正向引物和反向引物分别如seq id no:7和seq id no:8所示；
23.用于扩增pkd1基因外显子35-46的引物，其正向引物和反向引物分别如seq id no:9和seq id no:10所示。
24.进一步的，所述第二试剂包括模板dna、dna聚合酶、缓冲液和dntp混合物，其中dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
25.进一步的，所述dna模板含量≥100ng、上下游引物各2μl、dna聚合酶ⅱ0.5μl、10
×
bufferⅱ5μl，dntp混合物8μl。
26.本发明提供一种常染色体显性遗传型多囊肾病基因检测方法，包括以下步骤：
27.s1：使用权利要求1～7任一项的试剂组合物通过长片段pcr扩增pkd1基因；
28.s2：对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序；
29.s3：将步骤(2)获得的测序结果与pkd1基因参考序列比对，确定突变位点；
30.s4：通过生物信息学分析排除假基因位点干扰，确定pkd1真基因突变位点；
31.s5：将步骤s4确定的真基因突变位点与已知的pkd1基因突变位点进行比较，确定pkd1基因上的新突变位点。
32.进一步的，所述步骤s1中长片段扩增反应条件优选是98℃1min，然后进行10个循环，每个循环为98℃10s、68℃10min，然后进行20个循环，每个循环为98℃10s、68℃10min20s，随后72℃10min，然后置于4℃直至使用；和/或其中高通量测序优选为ion torrent测序。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
34.本发明可以检测pkd1基因上2-46号外显子区域的全部突变，本发明实验方法简单，操作人员能很快熟悉流程并实现高效的检测；解决了临床上的难题，已可大规模产业化
应用。其检测结果不仅可以辅助诊断成人多囊肾病，还可以获得多个pkd1真基因上的之前未知的新突变，并将其提供给医生或研究者以对这些突变与成人多囊肾病之间的关联性进行研究。
具体实施方式
35.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。实施例1
36.使用pkd1基因第2-46号外显子区域真基因特异性引物(e2、t3、k3、r5、k5)进行长片段pcr并进行高通量测序检测pkd1基因突变在征得受检者知情同意的前提下，针对70例受检者使用长片段pcr结合高通量测序检测pkd1基因突变。
37.采用omega基因组dna提取试剂盒(购自美国omega公司)提取受检者外周血的基因组dna，采用第一试剂提取基因组dna；提取的dna用分光光度计或其它检测仪器检测dna浓度和纯度，dna浓度大于50ng/μl，体积大于30μl，a260/a280在1.6-2.0之间，作为dna模板。
38.将来自每一个受检者的dna模板等分加入五个单独的反应管中，在五个反应管的每一个中加入长片段pcr引物e2、t3、k3、r5、k5(序列如表1所示)之一，按表2所述反应体系加入各项试剂，在ptc-200pcr仪(bio-rad公司)中反应进行长片段pcr反应，反应条件为：98℃1min，然后进行10个循环，每个循环为98℃10s、68℃10min，然后进行20个循环，每个循环为98℃10s、68℃10min 20s，随后72℃10min，然后置于4℃直至使用；其中高通量测序优选为ion torrent测序；针对多个受检者样品的、针对不同外显子区域的长片段pcr反应可在同一台pcr仪中以相同的反应条件进行。
39.表1引物序列
40.表2反应体系
41.扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.8％，点样5μ1pcr产物，并检测扩增是否达到目的长度，本次结果显示检测到单一条带后进行切胶回收纯化，其中4个样本的pkd l基因2-46号外显子区域扩增产物电泳图，其中2、8、14、20泳道为用e2引物扩增2-7号外显子区域的结果，大小为4041bp；3、9、15、21泳道为用t3引物扩增8-12号外显子区域的结果，大小为4200bp；4、10、16、22泳道为用k3引物扩增12-21号外显子区域的结果，大小为7800bp；5、11、17、23泳道为用r5引物扩增22-34号外显子区域的结果，大小为7503bp；6、13、18、24泳道为用k5引物扩增35-46号外显子区域的结果，大小为5200bp；l泳道m为15kb marker，片段长度至下而上依次为500bp、l000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、l0000bp、15000bp。
42.表2-46号外显子区域片段长度目的片段长度(kb)2-7号外显子区域48-12号外显子区域4.213-21号外显子区域7.822-34号外显子区域7.535-46号外显子区域5.2
43.然后根据现有技术中的试剂盒进行文库的构件以及高通量测序以及分析。
44.将经过上述分析的pkd1基因突变位点与dbsnp138数据库进行比较，确定哪些突变位点为己报道的突变位点，哪些位点为新突变位点。
45.经多次样本验证，发现该方法能够确定新突变位点，准确率高。
46.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。