一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统的构建及其应用

一种海洋微拟球藻转录激活crispra系统的构建及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻转录激活crispra系统及其的构建方法和应用。


背景技术：

2.海洋拟球藻微拟球藻是一种单细胞光合微藻，广泛分布于海洋、湖泊、沼泽等不同水环境水域。由于它的油脂含量高、较好的环境适应性及适于烟道气培养等特性，在微藻生物能源、微藻功能食品、微藻饲料等领域备受青睐，是“蓝色粮仓”的重要生物资源之一。随着近些年合成生物学的兴起，微拟球藻已经崛起为新一代的合成生物学光合底盘细胞之一，发展到与模式藻株如莱茵衣藻、小球藻等同等重要的位置。截至目前，已有多株微拟球藻的全基因组被测序，基本涵盖了本属内的已知代表物种，包括n.oceanica imet1，n.oceanica ccmp1779，n.oceanica ccmp526，n.oceanica ccmp526等。尽管对其开展了全基因组测序，但是它们基因绝大多数(占50％以上)都是未知功能的，对于代谢过程的理解仍然是一个“黑箱”。这就需要我们发展遗传转化方法和基因操作工具去揭开这个“黑箱”之谜。值得庆幸的是，基于电转化或基因枪等遗传转化方法在几株微拟球藻(n.oceanica imet1，n.oceanica ccmp1779，n.oceanica ccmp526，n.oceanica ccmp526等)代表种也基本已经建立，正反向遗传学工具如随机插入突变、过表达、rnai技术和同源重组的方法在不同种(如n.salina)里面也有报道。另外，基因编辑技术在几株代表物种(如n.salina)也已经建立，如基于episome的无选择压力基因编辑等。
3.基因编辑crispr-cas9是目前应用最广泛的crispr系统，除了被用于在细胞系、干细胞和诱导多功能干细胞水平上快速高效的编辑原核细胞和真核细胞的基因外，还在很多其他领域被广泛使用。比如，利用失活的crispr-cas9蛋白(简称dcas9蛋白)与特定的功能的结构域蛋白(如转录激活结构域vp64，转录抑制结构域krab，表观遗传调控乙酰化结构域p300和甲基化结构域dnmt3a等)融合表达，再结合使用特异性引导rna，可以达到特异性调控某一基因表达水平的目的。这一技术体系已经成功用于哺乳动物和植物研究体系。目前，高覆盖量的sgrna库已经诞生，可以覆盖到细胞的每一个基因，再通过正负筛选的方法，筛选到感兴趣的通路或基因，这一技术大大拓展了科学家研究功能基因组学的方法。但这一技术在植物，尤其是在微藻中，由于基因编辑方法建立的较慢，并且对转录激活复合体系的认识和其它常用转录激活结构域能不能在微藻中应用还是不清楚，进而转录激活系统在微藻中建立还是十分少见。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种海洋微拟球藻转录激活crispra系统及其的构建方法和可用于微拟球藻的代谢工程改造和合成生物学研究，优化藻种特异经济性状的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
6.一种海洋微拟球藻转录激活crispra系统，系统载体含cas9失活蛋白、转录激活效
应蛋白vp64、抗性选择标记基因、至少一个grna支架序列和增强转录激活的特异序列(suntag序列)。
7.所述系统以微拟球藻用cas9表达载体(pnoc-ars-crispr)作为骨架，其含有内源启动子和终止子，其中，启动子为ribi双向启动子和ldsp启动子，终止子为ldsp终止子。
8.所述骨架载体ribi双向启动子一端依次连接dcas9蛋白、增强转录激活的特异序列和转录激活效应蛋白；另一端连接grna支架序列，其驱动grna表达；潮霉素抗性基因位于骨架载体ldsp启动子下游；所述dcas9蛋白、增强转录激活的特异序列和转录激活效应蛋白之前均通过前导核定位信号连接。
9.进一步的说，针对微拟球藻骨架载体pnoc-ars-crispr，串联设计融合表达用于特定靶基因转录激活的关键结构dcas9-suntag-vp64。即在微拟球藻中融合表达dcas9-suntag-vp64三个蛋白置于同一读码框的三联复合物(微拟球藻密码子优化，改变了gc含量，使其更适合在微拟球藻中表达或表达效率更高)，并在每个结构之前连接前导核定位信号(slv40；用于核定位表达，提高dcas9蛋白和转录激活结构域表达拷贝数)。此外，suntag序列(选用10xgcn4)用以提高转录激活效率，增强转录激活vp64，也是用核定位表达提高表达效率。
10.所述载体中含至少一个grna支架序列，多个grna支架序列由多个靶基因设计的grna串联形成；所述每个grna支架序列为针对特定靶基因设计的引导序列；其中，特定靶基因为与性状相关的候选基因。
11.上述多个grna串联以实现多个基因的同时转录激活，也可以设计在同一代谢通路的基因作为靶基因，达到整个代谢通路被激活。
12.上述与性状相关的候选基因为直接或间接参与光合、固碳、抗逆、油脂积累、耐高温、耐高co2浓度、耐酸、耐氧胁迫、耐水胁迫相关的基因
13.上述提及dcas9蛋白是由点突变获得的失活切割靶序列功能的蛋白，只保留此基因的靶向功能，而切割dna序列的功能消失，并且为了提高表达效率，经密码子优化改变了gc含量，使其更适合在微拟球藻中表达；
14.grna敲除序列为微拟球藻甲基转移酶基因以及基因组上的任何dna序列(可以针对不同靶基因设计grna序列)；
15.抗性基因为潮霉素基因以及所有对应于微拟球藻敏感的抗生素、农药的基因；
16.转录激活效应蛋白vp64为微拟球藻密码子优化(使其适合在微拟球藻中表达)的外源蛋白结构域，并且包含经密码子优化的核定位信号序列；
17.所述cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白、抗性选择标记基因、grna支架序列和增强转录激活的特异序列分别为经微拟球藻密码子优化后的相应基因序列；其中，密码子优化的dcas9蛋白的碱基为seq id no:1中从6279bp到10379bp，密码子优化的转录激活效应蛋白vp64为seq id no:1中从5187bp到5336bp，密码子优化的抗性选择标记基因为seq id no:1中从2617bp到3642bp，密码子优化的增强转录激活的特异序列为seq id no:1中从5397bp到6101bp。
18.一种所述系统的构建方法：
19.(1)利用骨架载体构建包含有cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白vp64和增强转录激活的suntag序列的表达载体，并由同一启动子驱动表达；
20.(2)构建特异的grna序列连接到上述载体，构成转录激活载体。
21.所述步骤(1)重组质粒的构建，即(1)利用骨架载体构建包含有cas9失活蛋白、启动子和终止子，以及潮霉素抗性基因，将原载体cas9蛋白失活为dcas9蛋白；(2)将转录激活效应蛋白vp64和增强转录激活的suntag序列连接到dcas9蛋白下游，并由同一启动子驱动表达；(3)将至少一个grna支架序列连接到所述上述重组质粒上，构建获得转录激活系统。
22.一种微拟球藻基因转录激活crispra系统在基因转化中的应用。
23.一种宿主细胞，宿主细胞为包含所述的载体。
24.所述宿主细胞为海洋微拟球藻。
25.本发明方法成功构建了微拟球藻的基于crispra(dcas9-suntag-vp64介导的转录调控)转录激活表达系统。通过本发明设计特定靶基因的grna或多个靶基因的grna串联，能够有效的激活微拟球藻靶基因的转录水平，并通过分子和生理表型筛选获得转基因突变藻株。与现有技术相比，本发明实现了微拟球藻基因组工程技术的重点突破，具有如下有益效果：
26.1.本发明在海洋微拟球藻中建立基于dcas9-vp64/grna基因转录激活平台，其使用失活dcas9联合使用转录激活结构域vp64，在grna引导下，利用dcas9的招募功能从而实现靶基因转录激活，并且此载体可串联多个grna，也就是可用于多基因的转录激活，用于基因功能研究及大规模遗传筛选，特别是非编码rna研究的首选工具。
27.2.本发明提供用于微拟球藻代谢工程改造或合成生物学底盘细胞设计的dcas9-suntag-vp64/grna(crispra)系统。利用该crispra系统可用于解析微拟球藻基因组中所有相关蛋白、酶和非编码rna的调控机理并用于改良特异的生物性状(如提高光的捕获、吸收与利用和能量转化效率，改善多元抗逆性能、大幅提高生物质产量和提高油脂产量等)。
28.3.本发明提供用于微拟球藻基因转录激活(crispra)的dcas9-suntag-vp64/grna序列，包含设计并密码子优化的suntag序列，可用于微拟球藻通用的遗传修饰体系或多个种属单细胞微藻通用的遗传改造体系，也可用于微拟球藻表观基因组编辑体系的构建。
29.4.本发明能够靶向转录激活微拟球藻的內源基因，利用甲基转移酶基因构建微拟球藻的dcas9-suntag-vp64/grna基因转录激活体系。
30.5.本发明利用微拟球藻对潮霉素的敏感性，采用一种可行的选择标记基因-选择压力组合(hyg基因-潮霉素；此基因已经经过微拟球藻密码子优化)用于dcas9-suntag-vp64/grna基因转录激活体系的构建。
31.6.本发明crispra系统能够调控微拟球藻內源基因的转录水平，从而影响到靶基因的代谢途径。
32.7.借助本发明构建的转基因工程微藻，可具备更加优越的多元抗逆性能，如抗虫性、抗病性、抗盐耐旱、抗除草剂等。设计与构建针对特定工程微藻的低成本高光效反应设施，降低规模培养成本。并且微拟球藻是积累高附加值底物(多不饱和脂肪酸如epa和dha、色素、虾青素、甾醇等)，借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提高其高附加值产物的产量；同时微拟球藻具有光合效率高、繁殖快、环境适应性强的特点，借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提其固碳效率，从而可以有效的固定二氧化碳，降低大气中二氧化碳的浓度；
33.8.微拟球藻核基因组序列、叶绿体基因组序列以及non-coding rna组序列已经测
定，借助本发明可以在微拟球藻对其进行功能基因组学研究以及核基因组和叶绿体基因组之间的相互作用；还可以在微拟球藻对其进行功能基因组学研究；同时，可以在微拟球藻中对其进行功能基因组学研究，对于非编码rna的研究，借助crispra系统；
34.9.微拟球藻可筛选条件特异启动子，驱动本方法所属转录激活系统，即可实现条件特异转录激活。另外也可筛选特定细胞器表达的启动子再驱动本方法所属转录激活系统，即可实现叶绿体或线粒体基因的转录激活。因此，本系统可用于开发时空特异的转录激活表达。
附图说明
35.图1为本发明实施例提供的人工合成可同时表达dcas9蛋白、密码子优化vp64转录激活结构域、密码子优化suntag序列、grna和潮霉素基因的转录激活系统表达载体物理图谱。
36.图2为本发明实施例提供的靶基因甲基转移酶激活转化子的dna水平鉴定。
37.图3为本发明实施例提供的靶基因甲基转移酶在微拟球藻(野生型和突变株)中转录水平鉴定，其中wt为野生型。
38.图4为本发明实施例提供的微拟球藻甲基转移酶转录激活突变株的生长情况。
39.图5为本发明实施例提供的微拟球藻甲基转移酶转录激活突变株(m4和m7)以及野生型(白色圆圈)的生长曲线表型鉴定。
40.图6为本发明实施例提供的微拟球藻甲基转移酶转录激活突变株的光合参数测量。
具体实施方式
41.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
42.本发明基于基因编辑在海洋微拟球藻中建立dcas9-vp64/grna基因转录激活系统，其中，转录crispra催化失活的cas9(dcas9)连上转录激活子，可以有效促进基因组特定位点的转录，即在微拟球藻中引入suntag和vp64系统，其中suntag系统类似一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其它的分子的蛋白质支架上，而vp64催化结构域具有转录激活功能，将二者融合并在dcas9蛋白靶向作用下实现特定基因的转录激活。
43.所获得获得的微拟球藻转基因转录激活系统突变株，是通过高压电击法或基因枪法等其他直接导入方法，将含有本发明的dcas9-suntag-vp64/grna载体导入微拟球藻,通过利用dcas9蛋白在grna的指导下的靶向功能和利用vp64转录激活结构域的激活功能，定向提高靶基因的转录水平。
44.其与cdna过表达相比，crispra使用起来更加简单，而且可以同时激活多个基因，cdna过表达通常是上调个别基因的表达水平的常用方法。此外，crispra更是非编码rna研究强有力的武器。
45.实施例：
46.实现内源基因甲基转移酶基因(g1248)在微拟球藻中的靶向转录激活系统的构
no:1所示，再转化e.coli dh5α，最后得到阳性克隆psv64。经液体培养psv64后，提取质粒并用限制性内切酶asei酶切，达到线性化片段(浓度在1μg/μl以上)用于下一步电转化。
59.eq id no:1转录激活载体全序列
60.转录激活载体全序列(反向)
61.accggtttcttagacggatcgcttgcctgtaacttacacgcgcctcgtatcttttaatgatggaataatttgggaatttactctgtgtttatttatttttatgttttgtatttggattttagaaagtaaataaagaaggtagaagagttacggaatgaagaaaaaaaaataaacaaaggtttaaaaaatttcaacaaaaagcgtactttacatatatatttattagacaagaaaagcagattaaatagatatacattcgattaacgataagtaaaatgtaaaatcacaggattttcgtgtgtggtcttctacacagacaagatgaaacaattcggcattaatacctgagagcaggaagtacaagataaaaggtagtatttgttggcgatccccctagagtcttttacatcttcggaaaacaaaaactattttttctttaatttctttttttactttctatttttaatttatatatttatattaaaaaatttaaattataattatttttatagcacgtgatgaaaaggacccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggtttaaaccaggtcactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataagaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattctggagaaaaatagagagagatagatttgtagagagagactggtgatttttgcggactccggtcggcatctactactagcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcg
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atgattttcaggagatcgtgatacgttcccagggatgcgttgaagcgatcctccactccgctgatttcaacagagtcgaaacattcaatctttttgaaatagtcttctttgagctgtttcacggtaactttccggttcgtcttgaagaggaggtccacgatagctttcttctgctctccagacaggaatgctggctttctcatcccttctgtgacgtatttgaccttggtgagctcgttataaactgtgaagtactcgtacagcagagagtgtttaggaagcaccttttcgttaggcagatttttatcaaagttagtcatcctttcgatgaaggactgggcagaggcccccttatccacgacttcctcgaagttccagggagtgatggtctcttctgatttgcgagtcatccacgcgaatctggaatttccccgggcgagggggcctacatagtagggtatccgaaatgtgaggattttctcaatcttttccctgttatctttcaaaaaggggtagaaatcctcttgccgcctgaggatagcgtgcagttcgcccaggtgaatctggtgggggatgcttccattgtcgaaagtgcgctgtttgcgcaacagatcttctctgttaagctttaccagcagctcctcggtgccgtccattttttccaagatgggcttaataaatttgtaaaattcctcctggcttgctccgccgtcaatgtatccggcgtagccatttttagactgatcgaagaaaatttccttgtacttctcaggcagttgctgtctgacaagggccttcagcaaagtcaagtcttggtggtgctcatcatagcgcttgatcatactagcgctcagcggagctttggtgatctccgtgttcactcgcagaatatcactcagcagaatggcgtctgacaggttctttgccgccaaaaaaaggtctgcgtactggtcgccgatctgggccagcagattgtcgagatcatcatcgtaggtgtctttgctcagttgaagcttggcatcttcggccaggtcgaagttagatttaaagttgggggtcagcccgagtgacagggcgataagattaccaaacaggccgttcttcttctccccagggagctgtgcgatgaggttttcgagccgccgggatttggacagcctagcgctcaggattgctttggcgtcaactccggatgcgttgatcgggttctcttcgaaaagctgattgtaagtctgaaccagttggataaagagtttgtcgacatcgctgttgtctgggttcaggtccccctcgatgaggaagtgtccccgaaatttgatcatatgcgccagcgcgagatagatcaaccgcaagtcagccttatcagtactgtctacaagcttcttcctcagatgatatatggttgggtacttttcatggtacgccacctcgtccacgatattgccaaagattgggtggcgctcgtgctttttatcctcctccaccaaaaaggactcctccagcctatggaagaaagagtcatccaccttagccatctcattactaaagatctcctgcaggtagcagatccgattctttctgcgggtatatctgcgccgtgctgttcttttgagccgcgtggcttcggccgtctccccggagtcgaacaggagggcgccaatgaggttcttctttatgctgtggcgatcggtattgcccagaactttgaattttttgctcggcaccttgtactcgtccgtaatgacggcccagccgacgctgtttgtgccgatggcgagcccaatggagtacttcttgtccaccttccgctttttcttgggcatgctcgagggttgcgtgtgtatctgtgtgcagtggatattgttaccgagtttggtgagcgtgagtccgttagtgccctggtggtggtggattaggagagtgggtgactcggtgtccatggctttcttcgctcattataggaggggaaaggaatgagggagggtggggagaccgcgtctgttgttgaccaccgatttacttcttgcctcccttcccctccctcccctcaatccgtacgacacaaatagtagccgagtgtctgctgcagagcgcatgattagtgtggtagacaacgagggagggaaggatgtacagggcatggcacggagaagcgatggtggccaggaagaggagaggtcgcgagaacaggatgtgttgcgaatggataaaaacagaaagcgatggctctgggcttcgaaagcaggggacattaggacgtgtagaccatctcgacggatccctctgtatctctgttgtgcgtgaatgttttctgtgcacgtgtagtgtgtgagagtagaacccgggaactcgaacagagaaaagcatgggtggctgtggtgtggaggcttcgttcccaccacatgcccttctccttcgcctcgcctctccctgccttcttccacgcacccttgcgcccctcgttctcaatacctggctcacttccaccattcaaacaaccatcacgatacaggcatttatctatcgttgaagacttcttcctccggtagatcttagccaaggtaagaagaggggcatgcagcaaggagaaagaaatgatgcatgatgaggaatagaaggggaggagggagggatatgatgggaagcgaaagcgcatattctggtggtctgctgcctgatggggacgcgtctagctgtgacactgaggacggtggctgctggtggctgcgggcgctgccttggtgatcaatgggagtaaagggagggaaggaggtagcgtgaacggatgacgcggagaagtttaggggtctctttacgtatcgcccctgccgcccgcctctctgcgataaatgtgcctgttaccctgcagcctctattcttcactgtgttcctgttttccaacagcctctattcttccctgtcttttgttgcagtggcgtcatcctctctttgccccagtcgtcg
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62.dna序列长度：12782bp
63.dcas9序列(3
’-5’
)：从6279bp到10379bp，长度为4101bp
64.vp64序列(3
’-5’
)：从5187bp到5336bp，长度为150bp
65.suntag序列(3
’-5’
)：从5397bp到6101bp，长度为705bp
66.抗性基因hyg序列(3
’-5’
)：从2617bp到3642bp，长度为1026bp
67.启动子ribi序列(3
’-5’
)：从10411bp到11594bp，长度为1184bp
68.核定位信号slv40序列为：ccgaaaaagaagaggaaggtc
69.三、电穿孔方法将线性化载体片段导入微拟球藻中并挑选单克隆
70.在转化前1h，取培养至对数生长期的微拟球藻藻液，其浓度约为1-3
×
107cells/ml，然后以4500g转速在4℃离心5min，弃上清，再用375mm山梨醇溶液(提前预冷至4℃)漂洗2次，最后用375mm山梨醇调整细胞浓度到2
×
108cells/ml。将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入3-10μg上述步骤二获得线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精dna(使其终浓度为15μg/ml)，混匀后在冰上放置10min。预冷完后，将藻液与载体的混合物转移入2mm电击转化杯，以2200v(hv)，50μf进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml新鲜f/2培养基。25℃摇床中低速50rpm培养复苏，通常弱光或黑暗复苏48h。微藻细胞被均匀地涂布到潮霉素(5μg/ml)的f/2固体平板，培养15-25天之后，挑10-20个单克隆放到一个24孔培养板进行培养14天。用菌落pcr方法验证转化子是否转化成功。
71.四、藻落或藻液pcr方法筛选转化株和靶基因表达水平的qpcr验证
72.通过藻落或藻液pcr方法筛选转化株，即使用neb公司生产的q5缓冲液作为裂解液，吸取2μl藻液，2μl的q5缓冲液，再加水补充至10μl，将此混合液在沸水中煮沸10min或在thermocycler上加热10min，待冷却到室温或4℃后，再加入引物和pcr用taq酶的预混液进行聚合酶链式反应pcr扩增，电泳pcr产物验证转化子(图2)。对阳性转化子进行液体扩大培
养，用于靶基因的表达水平验证。
73.将上述获得突变株和野生型分别在空气水平co2浓度下培养，光强控制一致在50umol/m2/s，通气速率在100ml/min。待微藻培养至对数生长期时收集微藻，5000g离心5min，然后用液氮迅速冷冻，保存在-80℃备用。
74.突变株表达丰度实验测量分为以下三步：
75.第一步rna的提取，将冷冻保存的藻细胞(突变株或野生型)进行rna提取，首先采用液氮研磨的方式破碎藻细胞，一般液氮研磨5-10min，然后加入1ml trizol(invitrogen公司)迅速充分混匀并加入200ul氯仿在12000rpm下离心10min，吸取上清液转入新的eppendorf管中再加入等体积氯仿，充分振荡混匀，静置2-3min后以12000rpm下离心10min，将上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇室温沉淀15min，离心15min后，再用75％乙醇洗涤沉淀后，吹干加入50ul depc处理的ddh2o，测量rna浓度后，保存于-80℃备用；
76.第二步，cdna的制备，将上述获得rna样本按照takara试剂rt reagent kit with gdna eraser kit的流程说明使用随机引物进行cdna的合成，备注基因组dna去除反应体系为20ul，其中包括2ug的总rna、5x reaction buffer和gdna eraser酶；
77.第三步，荧光定量pcr反应，通过(采用罗氏的快速启动通用绿色荧光)荧光定量qrt-pcr进行定量。pcr的反应体系为1ul的cdna(来自上一步的反转录制备)、正反向引物各1ul、10ul的2x roche faststart sybr green master(rox)、ddh2o添加7ul补足至20ul，其中引物序列为正向引物：5’tccgagaatattgcgtccatgg3’；反向引物：5’taatttcctcagcaccaggtga3’。反应条件参照roche试剂盒说明执行。实时荧光qpcr结果数据的分析使用2-δδct
方法,其中δδct值为(ct
ca-2209基因-ct
内参基因
)
突变株-(ct
ca-2209基因-ct
内参基因
)
野生型
。
78.通过以上方法计算g1248基因在突变株中的相对野生型的基因表达丰度，结果证实突变株(m4或m7)的g1248基因表达丰度在空气水平co2浓度培养条件下显著高于野生型g1248的表达，证实g1248基因在转录水平被激活，大约上调2-7倍(图3)。
79.五、靶基因甲基转移酶转录激活突变株的生理表型鉴定
80.将野生型微藻和上述突变株(选用m4和m7；图4)分别在200ml柱式反应器中接种到新鲜f/2液体培养基中，并在通空气条件下培养，每天测量生长曲线和培养6天测光合作用参数fv/fm等生理指标。
81.测量结果如图5所示，发现突变株在空气水平co2浓度下生长明显快于野生型，经10天培养生长速率增加20％以上(图4和5)。另外，突变株的光合作用参数fv/fm也比野生型提高15％(图6)，进一步证实该基因可能通过影响光合作用基因的甲基化来调控其功能。因此，通过基因转录激活的方法初步验证了甲基转移酶g1248的基因功能，这个基因在微拟球藻生长中扮演重要角色，可能是能够间接调控co2固定或光合作用的重要酶，此基因的具体功能有待深入的研究。
82.六、多基因同时转录激活的设计
83.为实现多基因的同时转录激活，可以设计多个基因的grna序列，然后将设计的多个grna序列(即，根据性状相关的不同的靶基因对应设计不同的grna)用短的中间序列串联起来(短的中间序列可以是20-40bp随机序列，可以不用考虑读码框，没有特殊要求，例如
cttaccgcatgactaatctttaaggcta)，再去合成并在这多个grna串联序列两端设计bspqi酶切位点，利用此位点可与前面所述载体连在一起，在启动在的驱动下可同步表达多个grna。然后利用其引导功能，将dcas9蛋白和相应的转录激活结构域靶向到多个特定基因，以实现多个基因的同时转录激活，也可以设计在同一代谢通路的基因作为靶基因，达到整个代谢通路被激活。