茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区SSR分子标记引物及应用的制作方法

茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区ssr分子标记引物及应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，尤其茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)基因启动子区ssr分子标记引物及应用。


背景技术：

2.茶树是中国重要的木本经济作物，茶是世界上最古老、最受欢迎的含咖啡碱饮料。茶树中含有咖啡碱(caffeine)、可可碱(theobromine)和茶叶碱(theophylline)等嘌呤类生物碱，同时也含有少量嘧啶类生物碱。生物碱是一类来源于生物界的含氮有机化合物，在植物界分布较广，目前已知至少有50多个科120属以上的植物含有生物碱，已发现和分离出的生物碱近6000种。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质，其与茶黄素以氢键缔和后形成的复合物具有鲜爽味，因此茶叶咖啡碱含量也常被看做是影响茶叶质量的一个重要因素。此外，咖啡碱对人体具有一定的兴奋作用，因此还具有一定的药理功能。
3.s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)(e.c.2.5.1.6)催化甲硫氨酸和atp反应生成s-腺苷甲硫氨酸(sam)，sam既是植物体内转甲基反应的甲基供体及多胺和乙烯合成的前体，同时也是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体。sam及sam合成酶基因在茶树中可以参与咖啡因生物合成，并能对逆境中的茶树起保护作用。sams是一种胞内酶，除了肺囊虫与沙眼衣原体等之外，它广泛存在于动物、植物及微生物体内，至今已经分别从原核生物细菌和真核生物酵母、拟南芥、烟草、蝴蝶兰、白木香、马铃薯、棉花等克隆到了sams基因。2005年，浙江大学的梁月荣等克隆了茶树的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，序列长1303bp，编码394个氨基酸，该基因与中华猕猴桃、番茄、长春花的sam合成酶基因的核苷酸序列同源性分别为87％，83％和83％；其氨基酸序列(登录号为ab041534)与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的sam氨基酸序列同源性为92％～90％。
4.sam是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体，因此s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)基因是咖啡碱合成重要关键酶，但是针对s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)基因ssr分子标记引物开发及应用研究还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)基因启动子区ssr分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ssr分子标记，分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.2的碱基序列，标记编号为ssr1-sams、ssr2-sams。
8.扩增上述茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ssr分子标记的引物，分子标记ssr1-sams、ssr2-sams的引物分别包括具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4、seq.id.no.5和seq.id.no.6的碱基序列。
9.上述ssr分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总dna进行pcr扩增，得到简单重复序列；引物包括具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4、seq.id.no.5和seq.id.no.6的碱基序列。
10.上述ssr分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
11.《1》提取dna
12.采用试剂盒提取茶树的基因组dna作为模板；
13.《2》pcr反应
14.反应体系：反应总体积为20μl，其中2
×
pcr mix 10μl，茶树dna模板1μl，ddh2o 8μl，正向引物和反向引物各1μl；
15.反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
16.《3》电泳显色
17.取5μl pcr产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
18.正向引物为序列表seq.id.no.3、seq.id.no.5的引物，反向引物为序列表seq.id.no.4、seq.id.no.6的引物。
19.茶树dna模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/l。
20.上述ssr分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
21.上述ssr分子标记在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
22.上述ssr分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
23.上述ssr分子标记的引物在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
24.针对目前茶树的生物碱合成途径关键酶研究尚少的问题，发明人在
‘
云抗10号’大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ssr分子标记(ssr1-sams、ssr2-sams)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其ssr引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、ssr分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及qtl定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
25.图1是茶树ssr1-sams和ssr2-sams引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：m：2000bp dna marker；各泳道对应茶种质材料分别为：1，7是德保茶；2，8是黄金茶；3，9是紫鹃；4，10是湘波绿；5，11是金牡丹；6，12是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为ssr1-sams引物扩增片段；泳道7-12为ssr2-sams引物扩增片段。
26.图2是位于sams基因间区(intergenic)的其它ssr-sams引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：各泳道对应茶种质材料分别为：1，7，13，19，25，31是德保茶；2，8，14，20，
26，32是黄金茶；3，9，15，21，27，33是紫鹃；4，10，16，22，28，34是湘波绿；5，11，17，23，29，35是金牡丹；6，12，18，24，30，36是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为ssr13-sams引物扩增片段；泳道7-12为ssr14-sams引物扩增片段；泳道13-18为ssr15-sams引物扩增片段；泳道19-24为ssr16-sams引物扩增片段；泳道25-30为ssr17-sams引物扩增片段；泳道31-36为ssr18-sams引物扩增片段；
27.图3是位于sams基因间区intergenic的其它ssr-sams引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：各泳道对应茶种质材料分别为：1，7，13，19，25，31是德保茶；2，8，14，20，26，32是黄金茶；3，9，15，21，27，33是紫鹃；4，10，16，22，28，34是湘波绿；5，11，17，23，29，35，是金牡丹；6，12，18，24，30，36是罗香2号；m 4为m(2000bp dna marker)与湘波绿pcr产物混合样。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为ssr37-sams引物扩增片段；泳道7-12为ssr38-sams引物扩增片段；泳道13-18为ssr39-sams引物扩增片段；泳道19-24为ssr40-sams引物扩增片段；泳道25-30为ssr41-sams引物扩增片段；泳道31-36为ssr42-sams引物扩增片段。
具体实施方式
28.茶树生物碱合成途径s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)基因ssr分子标记研究
29.(1)从ncbi上下载茶树生物碱合成途径s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)(genbank:ab041534)基因序列。
30.(2)下载茶树
‘
云抗10号’全基因组序列(下载地址：http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/dat)。在茶树全基因组中运用ssr search软件寻找其ssr标记，提取ssr序列及其上下游特定长度(默认100bp)的序列。运用primer3进行引物设计，获得引物序列、ssr重复基元和重复长度、预扩增片段长度等。据此合成制备s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相关的50对ssr分子标记引物序列。
31.(3)采用天根生物有限责任公司生产的试剂盒hyqspin tm ct plant dna kit提取德保茶、紫鹃、黄金茶、湘波绿、金牡丹和罗香2号共6个茶树种质资源的基因组dna。
32.(4)从步骤(2)中获得的50对ssr引物中，以步骤(3)提取的6个茶树种质资源基因组dna为模板开展ssr-pcr反应，并利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及快速银染法检测pcr扩增产物。
33.pcr反应体系：反应总体积为20μl，其中2
×
pcr mix 10μl，茶树dna模板(1～50ng)1μl，ddh2o 8μl，正向引物(10μmol/l)和反向引物(10μmol/l)各1μl。
34.pcr反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存。
35.电泳显色：取5μl pcr产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min。电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
36.pcr扩增电泳染色部分结果如图1至图3所示，50对ssr引物中，仅有图1的2对ssr引物(表1)扩增的片段有差异性，其多态性好、主带清晰，它们位于sams基因启动子upstream区域。
37.表1基于茶树sams基因筛选获得的2对多态性好的ssr分子标记引物信息
38.