涉及治疗性抗体和白介素2(IL2)的治疗的制作方法

涉及治疗性抗体和白介素2(il2)的治疗
技术领域
1.本公开内容涉及治疗患有癌症的对象的方法，该癌症例如由于癌症的mhc-i缺陷或癌症在ifn信号传导方面的缺陷而对基于mhc依赖性t细胞的治疗没有充分应答。这些方法尤其可用于治疗特征在于病变细胞在其细胞表面表达抗原的癌症疾病。具体地，本公开内容涉及治疗患有对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症的对象的方法，其包括向该对象施用：a.包含il2或其功能性变体的多肽(本文中统称为“il2”)或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；和b.针对癌症的基于抗体的免疫治疗。本公开内容还涉及在患有癌症的对象中防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性的方法，其包括向该对象施用：a.包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；和b.针对癌症的基于抗体的免疫治疗。本公开内容的方法还可以包括向对象施用另外的癌症治疗，例如化学治疗或放射治疗，特别是化学治疗。


背景技术：

2.免疫系统在癌症的发生、进展和治疗期间起着至关重要的作用。cd8

t细胞和nk细胞可以直接裂解肿瘤细胞，这些细胞的高肿瘤浸润通常被认为有利于各种肿瘤疾病的结局。cd4

t细胞通过分泌ifnγ或抗原呈递树突状细胞(dc)许可并转而致敏和激活cd8

t细胞而有助于抗肿瘤免疫应答(kreiter等，nature 520,692-6(2015))。cd8

t细胞对肿瘤细胞的识别和消除取决于通过i类主要组织相容性复合体(mhc)的抗原呈递。mhc i类分子位于细胞表面并包含α链和β2微球蛋白(b2m)。每个人个体都携带编码α链的基因的六个不同等位基因和编码b2m的基因的两个冗余等位基因。虽然b2m是复合物的稳定性所需要的，但α链形成容纳肽抗原的凹槽，肽抗原原则上可以由任何内源性蛋白质衍生。如果抗原是免疫原性的(例如，因为它源于突变或病毒基因产物)，携带与这种特定肽-mhc i类复合物匹配的t细胞受体(tcr)的cd8

t细胞可以将肿瘤细胞识别为外来的。如果cd8

t细胞被致敏和激活，它将裂解肿瘤细胞并分泌ifnγ。周围的肿瘤细胞能够感知ifnγ，通过上调mhc i类导致生长抑制和增强抗原呈递，使得肿瘤细胞更容易被cd8

t细胞识别。此外，位于肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)中的cd4

t细胞和nk细胞可以为ifnγ的来源，而dc和巨噬细胞可以分泌对肿瘤细胞的生长和抗原呈递具有类似作用的i型ifn。
3.数种免疫治疗，例如过继性t细胞转移、重组细胞因子或免疫检查点阻断(icb)被批准用于治疗癌症患者。尤其是icb彻底改变了癌症治疗领域，在患者群中产生了持久的应答(larkin等，n engl j med 373,23-34(2015))。icb依赖于重新激活先前存在的针对肿瘤细胞的cd8

t细胞应答。由于icb的成功，另外的基于t细胞的免疫治疗方法非常有前景，目前许多都在临床试验中进行研究。然而，基于cd8

t细胞的治疗具有依赖于肿瘤细胞的功能性抗原呈递的固有缺点，这为抗性机制的发生开辟了道路。
4.肿瘤细胞经常在遗传上不稳定(burrell等，nature 501,338-45(2013))。出于这个原因，它们积累了突变，这可导致非功能性基因产物(例如通过错义突变或无义突变)或导致整个基因的缺失。对癌症治疗应答至关重要的基因的功能性丧失可涉及原发性抗性、
适应性抗性或获得性抗性(sharma等，cell 168,707-23(2017))。获得性抗性的发生导致治疗抗性肿瘤细胞克隆的选择和生长，并经常导致受影响的患者的死亡。特别地，观察到损害抗原呈递的突变为针对免疫治疗的抗性机制，所述免疫治疗包括过继性t细胞转移、icb和疫苗接种(restifo等,j natl cancer inst 88,100-8(1996),zaretsky等,n engl j med 375,819-29(2016),sahin等,nature 547,222-6(2017))。例如，mhc i类丧失，特别是通过b2m的突变的mhc i类丧失导致抗原呈递完全关闭。因此，肿瘤细胞逃脱了cd8

t细胞的识别和消除。根据肿瘤实体，在高至93％的肿瘤中观察到mhc i类等位基因部分或全部丧失(garrido等，cancer immunol immunother 66,259-271(2017))，而特别是b2m的丧失已显示影响近30％对icb无应答的患者(sade-feldman等,nat commun 8,1136(2017))。此外，与ifn信号传导途径有关的几个基因的突变与对icb的抗性有关(zaretsky等,n engl j med 375,819-29(2016),gao等,cell 167,397-404(2016)))。例如，中枢ifn信号传导分子janus激酶1(janus kinase 1，jak1)的功能性丧失阻碍对i型ifn和ifnγ二者的应答。除了免疫治疗之外，抗原呈递的损害也是针对经典癌症治疗(化学-和放射治疗)的抗性的潜在机制，因为最近的报告表明，经典癌症治疗依赖于激活对肿瘤细胞的细胞免疫应答(galluzzi等,cancer cell 28,690-714(2015),weichselbaum等,nat rev clin oncol 14,365-379(2017))。
5.本公开内容证实，通过丧失mhc i类而受损的抗原呈递是鼠肿瘤模型中针对免疫治疗的抗性的综合机制。除此之外，提供的数据显示mhc i类的丧失介导了针对经典癌症治疗的抗性。到目前为止，没有治疗被描述为对这样的抗性肿瘤有效，所述抗性肿瘤通过经由功能性mhc i类完全或部分丧失或功能性ifn信号传导丧失损害抗原呈递来逃避免疫识别。出于该原因，对恢复免疫识别和消除抗性肿瘤细胞的新策略有高的医学需求。
6.本文描述了针对通过改变获得抗性的肿瘤的免疫治疗干预策略，所述改变通过mhc i类的丧失或受损的ifn信号传导路径而损害抗原呈递。治疗包括结合肿瘤抗原的抗体与细胞因子il2组合。所描述的联合治疗导致多种免疫细胞浸润肿瘤，并在鼠模型中完全排斥抗性肿瘤。此外，本公开内容表明诸如化学治疗的经典癌症治疗通过抗体与il2联合免疫治疗进一步改善了对抗性肿瘤的控制。


技术实现要素：

7.本发明总体上包括对象的免疫治疗性治疗，其包括施用包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸和针对癌症的基于抗体的免疫治疗，以治疗通过改变获得抗性的肿瘤，或治疗肿瘤以防止肿瘤通过改变获得抗性，该改变通过mhc i类的丧失或受损的ifn信号传导路径损害抗原呈递。
8.如果il2与药代动力学修饰基团连接(以下称为“药代动力学(pk)延长的il2”)，则本文中所述的方法和药剂特别有效。如果编码il2例如pk延长的il2的多核苷酸是rna，则本文所述的方法和药剂特别有效。在一个实施方案中，所述rna靶向肝以获得全身可用性。肝细胞可被有效地转染并且能够产生大量的蛋白质。
9.在一个方面中，本文提供了治疗患有对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症的对象的方法，其包括向对象施用：
10.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多
核苷酸；和
11.b.针对癌症的基于抗体的免疫治疗。
12.在一个实施方案中，癌症对基于(即涉及)t细胞(例如mhc依赖性t细胞，特别是cd8

t细胞)的治疗没有充分应答。在一个实施方案中，癌症对疫苗接种、免疫检查点抑制、和t细胞转移中一者或更多者没有充分应答。在一个实施方案中，癌症在加工和/或呈递抗原方面存在缺陷。在一个实施方案中，癌症是mhc-i缺陷型的。在一个实施方案中，mhc-i的缺陷是由于mhc-i等位基因或β2-微球蛋白(b2m)的突变或部分丧失或全部丧失。在一个实施方案中，癌症在刺激t细胞方面存在缺陷。在一个实施方案中，癌症在ifn信号传导例如i型ifn或ifnγ信号传导方面存在缺陷。这种ifn信号传导缺陷可能是由于参与ifn信号传导途径的一种或更多种基因的一种或更多种突变所致。在一个实施方案中，所述基因是janus激酶1(jak1)。
13.在一个方面中，本文提供了在患有癌症的对象中防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性的方法，其包括向对象施用：
14.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；和
15.b.针对癌症的基于抗体的免疫治疗。
16.在一个实施方案中，抗性包括癌症不对基于(即涉及)t细胞(例如mhc依赖性t细胞，特别是cd8

t细胞)的治疗充分应答。在一个实施方案中，抗性包括癌症不对疫苗接种、免疫检查点抑制、和t细胞转移中一者或更多者充分应答。在一个实施方案中，抗性包括癌症在加工和/或呈递抗原方面存在缺陷。在一个实施方案中，抗性包括癌症是mhc-i缺陷型的。在一个实施方案中，mhc-i的缺陷是由于mhc-i等位基因或β2-微球蛋白(b2m)的突变或部分丧失或全部丧失导致。在一个实施方案中，抗性包括癌症在刺激t细胞方面存在缺陷。在一个实施方案中，抗性包括癌症在ifn信号传导例如i型ifn或ifnγ信号传导方面存在缺陷。这种ifn信号传导缺陷可能是由于参与ifn信号传导途径的一种或更多种基因的一种或更多种突变所致。在一个实施方案中，所述基因是janus激酶1(jak1)。
17.在一个实施方案中，编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸是rna。
18.在一个实施方案中，针对癌症的基于抗体的免疫治疗包括施用针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，针对癌症的治疗性抗体定向针对由癌症细胞表达的肿瘤抗原。在一个实施方案中，编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸是rna。
19.在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用：
20.a.编码包含il2或其功能性变体的多肽的rna；和
21.b.针对癌症的治疗性抗体。
22.在一个实施方案中，癌症与抗原的表达或表达升高有关。在一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中，针对癌症的基于抗体的免疫治疗定向针对所述抗原。
23.在一个实施方案中，包含il2或其功能性变体的多肽是药代动力学(pk)延长的il2。在一个实施方案中，pk延长的il2包含融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白包含为il2或其功能性变体的部分和选自血清白蛋白、免疫球蛋白片段、转铁蛋白、fn3、及其变体的部分。在一个实施方案中，血清白蛋白包含小鼠血清白蛋白或人血清白蛋白。在一个实施
方案中，免疫球蛋白片段包含免疫球蛋白fc结构域。
24.在一个方面中，本文中提供了药物制剂，其包含：
25.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；
26.b.针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸；和
27.c.使用药物制剂治疗或预防对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症的说明。
28.在一个方面中，本文中提供了药物制剂，其包含：
29.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；和
30.b.针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸；
31.所述药物制剂用于治疗或预防对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症。
32.在一个方面中，本文中提供了药物制剂，其包含：
33.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；
34.b.针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸；和
35.c.使用药物制剂防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性的说明。
36.在一个方面中，本文中提供了药物制剂，其包含：
37.a.包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；和
38.b.针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸；
39.所述药物制剂用于防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性。
40.在一个实施方案中，所述药物制剂是药盒。
41.在一个实施方案中，药物制剂包含含有il2或其功能性变体的多肽或编码含有il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸，以及针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸，它们处于分开的容器中。
42.在一个实施方案中，所述药物制剂是药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
43.在一个方面中，本文提供了用于治疗或预防对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症的包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸，其中所述包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸用于与针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸一起施用。
44.在一个方面中，本文提供了用于治疗或预防对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症的针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸，其中所述针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸用于与包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸一起施用。
45.在一个方面中，本文提供了用于防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性的包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸，其中所述包
含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸用于与针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸一起施用。
46.在一个方面中，本文提供了用于防止癌症对mhc依赖性t细胞应答产生抗性的针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸，其中所述针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸用于与包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸一起施用。
47.在一个实施方案中，药物制剂、包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸、或针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸用于如上所述的本发明方法中。
48.药物制剂、包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸、或针对癌症的治疗性抗体或编码针对癌症的治疗性抗体的多核苷酸的一些优选实施方案如上所述用于本发明方法。
附图说明
49.图1：不同鼠肿瘤模型中cd8

t细胞和cd45

免疫细胞的肿瘤浸润。
50.用5
×
105ct26细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠。用5
×
105mc38细胞、3
×
105b16f10细胞或1
×
105tc1细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定肿瘤内cd8

t细胞(a)和总免疫细胞(b)的比例。点代表个体小鼠，线代表组平均值。
51.图2：ct26鼠结肠癌和mc38鼠结肠腺癌肿瘤细胞系在b2m基因敲除之后mhc i类表面表达的丧失。
52.对照和b2m-/-ct26(a)和mc38细胞(b)的mhc i类表面表达。用cas9 mrna和b2m靶向sgrna瞬时转染产生b2m-/-克隆。通过流式细胞术测定细胞表面上mhc i类的表达。
53.图3：b16f10鼠黑色素瘤和tc1鼠肺上皮癌肿瘤细胞系在b2m基因敲除之后mhc i类表面表达的丧失。
54.对照和b2m-/-b16f10(a)和tc1细胞(b)的mhc i类表面表达。b2m-/-克隆如图2中所述产生。通过流式细胞术测定细胞表面上mhc i类的表达。在流式细胞术分析之前，用25ng/ml ifnγ处理b16f10细胞24小时。
55.图4：b16f10鼠黑色素瘤细胞的ifn应答诱导pd-l1和mhc i类上调。
56.用1000u/ml ifn-α刺激24小时之后通过流式细胞术测定b16f10细胞的pd-l1(a)和mhc i类(b)表达。对照未受刺激。
57.图5：在jak1基因敲除之后b16f10鼠黑色素瘤细胞的受损ifn应答。
58.在如图4所述的ifn刺激之后通过流式细胞术测定b16f10-jak1-/-细胞的pd-l1(a)和mhc i类(b)的表达。对照未受刺激。b16f10-jak1-/-细胞如图2中所述用靶向jak1的sgrna产生。
59.图6：亲本ct26鼠结肠癌和mc38鼠结肠腺癌肿瘤与b2m-/-变体的生长比较。
60.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞(a)皮下(s.c.)接种的balb/c小鼠(每组n＝5)和用5
×
105mc38或mc38-b2m-/-细胞(b)皮下(s.c.)接种的c57bl/6小鼠(n＝5)的肿瘤生长。显示的数据是组平均值
±
sem。使用双因素anova随后进行sidak多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《
0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
61.图7：亲本b16f10鼠黑色素瘤和tc1鼠肺上皮肿瘤与b2m-/-变体的生长比较。
62.用3
×
105b16f10或b16f10-b2m-/-细胞(a)皮下(s.c.)接种的c57bl/6小鼠(每组n＝10)和用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞(b)皮下(s.c.)接种的c57bl/6小鼠(n＝10)的肿瘤生长。显示的数据是组平均值
±
sem。使用双因素anova随后进行sidak多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
63.图8：ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤的免疫细胞浸润的比较。
64.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c鼠。在肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化的肿瘤内淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
65.图9：取自ct26或ct26-b2m-/-鼠结肠癌荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结的免疫细胞组成的比较。
66.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c鼠。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定肿瘤引流淋巴结中淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
67.图10：mc38和mc38-b2m-/-鼠结肠腺癌肿瘤的免疫细胞浸润的比较。
68.用5
×
105mc38或mc38-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。在肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
69.图11：取自mc38或mc38-b2m-/-鼠结肠腺癌荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结的免疫细胞组成的比较。
70.用5
×
105mc38或mc38-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定肿瘤引流淋巴结中淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
71.图12：b16f10和b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤肿瘤的免疫细胞浸润的比较。
72.用3
×
105b16f10或b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。在肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
73.图13：取自b16f10和b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结的免疫细胞组成的比较。
74.用3
×
105b16f10或b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定肿瘤引流淋巴结中淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
75.图14：tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤的免疫细胞浸润的比较。
76.用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。在肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
77.图15：取自tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤携带小鼠的肿瘤引流淋巴结的免疫细胞组成的比较。
78.用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定肿瘤引流淋巴结中淋巴(a)、骨髓(b)和树突细胞(dc)亚组(c)的数量。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用grubb检验去除异常值。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
79.图16：t细胞和nk细胞在不同时间点对ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤的差异浸润。
80.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组和每个时间点n＝5)。在肿瘤接种之后第8、12天(仅nk细胞)、20天和26天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤体积归一化肿瘤内cd3

t细胞(a)和nk细胞(b)的数目。显示的数据是组平均值
±
sem。使用混合效应分析随后进行sidak多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
81.图17：ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤或tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤的瘤内cd8

t细胞的不同表型。
82.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠。用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6。在肿瘤接种之后20天通过流式细胞术确定来自ct26和ct26-b2m-/-肿瘤的肿瘤内gp70特异性(a)和pd-1

cd8

t细胞(b)的频率以及来自tc1和tc1-b2m-/-肿瘤的肿瘤内pd-1

cd8

t细胞(c)的频率。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
83.图18：来自ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤的瘤内巨噬细胞(tam)和肿瘤细胞的不同表型。
84.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组n＝8)。肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定肿瘤内tam的mhc ii类(a)和pd-l1表达(b)以及肿瘤细胞
的pd-l1表达(c)。数据为平均值 sem。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
85.图19：来自tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤的瘤内巨噬细胞(tam)和肿瘤细胞的不同表型。
86.用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6(每组n＝8)。肿瘤内tam的mhc ii类(a)和pd-l1表达(b)以及肿瘤细胞的pd-l1表达(c)如图18中所述确定。数据为平均值 sem。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
87.图20：ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤的tme中ifng和趋化因子的不同表达水平。
88.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠。在肿瘤接种之后19天通过qrt-pcr测定ifng(a)、cxcl9(b)、cxcl10(c)、cxcl11(d)、ccl5(e)和xcl1(f)的瘤内相对基因表达水平。数据是每组n＝3小鼠的平均值 sem。
89.图21：mc38和mc38-b2m-/-鼠结肠腺癌肿瘤的tme中ifng和趋化因子的不同表达水平。
90.用5
×
105mc38或mc38-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。ifng(a)、cxcl9(b)、cxcl10(c)、cxcl11(d)、ccl5(e)和xcl1(f)的瘤内相对基因表达水平如图20所述确定。数据是每组n＝5小鼠的平均值 sem。使用曼-惠特尼u检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
91.图22：b2m缺陷导致ct26鼠结肠癌模型中针对抗pd-1、抗ctla4和抗4-1bb抗体治疗的抗性。
92.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组n＝10)。在肿瘤达到32mm3至36mm3的平均体积之后的第0、3、7和10天，向小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg靶向pd-1、ctla4或4-1bb的抗体。对照组注射了与无关抗原结合的抗体。ct26(a)或ct26-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的肿瘤生长。显示的数据是平均值 sem。统计学显著性使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
93.图23：用抗pd-1、抗ctla4和抗4-1bb抗体治疗进行处理之后ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤中cd8

t细胞的差异浸润。
94.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠并如图22中所述进行处理。来自用抗pd-1或抗ctla4(a)或抗4-1bb(b)处理的ct26肿瘤和用抗pd-1或抗-ctla4(c)或抗4-1bb(d)处理的ct26-b2m-/-肿瘤的肿瘤内cd8

t细胞的数目通过流式细胞术测定并相对于肿瘤体积或肿瘤重量归一化。在第一次处理之后7天分析用抗4-1bb抗体处理的肿瘤，在第一次处理之后第10天分析用抗pd-1或抗ctla4抗体处理的肿瘤。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验(a和c)或未配对student t检验(b和d)确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
95.图24：b2m缺陷导致mc38鼠结肠腺癌模型中针对抗pd-1、抗ctla4和抗4-1bb抗体治
疗的抗性。
96.用5
×
105mc38或mc38-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)。在第0、4、7、和10天，如图22中所述用抗体处理小鼠。携带mc38的小鼠在第14天和第17天再接受两次注射。mc38(a)或mc38-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的肿瘤生长。显示的数据是平均值 sem。统计学显著性使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
97.图25：b2m缺陷导致ct26鼠结肠癌模型中针对治疗性rna疫苗接种的抗性。
98.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组n＝10)。在肿瘤接种之后的第5、8、12和19天，用40μg gp70ah5 rna-lpx或不编码任何抗原的rna-lpx(无关rna)对小鼠进行静脉内(i.v.)注射。对照组未进行处理。ct26(a)或ct26-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的肿瘤生长。显示的数据是平均值 sem。统计学显著性使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
99.图26：治疗性rna疫苗接种之后ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤中cd8

t细胞的差异浸润和抗原特异性。
100.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠并如图25中所述进行处理。在第一次处理之后17天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化来自ct26(a)和ct26-b2m-/-(b)肿瘤的肿瘤内cd8

t细胞的数目。来自ct26(c)和ct26-b2m-/-(d)肿瘤的gp70特异性cd8

t细胞的频率。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
101.图27：b2m缺陷导致tc1鼠肺上皮肿瘤模型中针对治疗性rna疫苗接种的抗性。
102.用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)。在肿瘤达到约20mm3的平均体积之后的第0天和第7天，用20μg e7 rna-lpx或不编码任何抗原的rna-lpx(无关rna)对小鼠进行静脉内(i.v.)注射。对照组未进行处理。tc1(a)或tc1-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的肿瘤生长。显示的数据是平均值 sem。统计学显著性使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
103.图28：治疗性rna疫苗接种之后tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤中cd8

t细胞的差异浸润和抗原特异性。
104.用1
×
105tc1或tc1-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)并如图27所述进行处理。在第一次处理之后9天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化来自tc1(a)和tc1-b2m-/-(b)的肿瘤内cd8

t细胞的数目。来自tc1(c)和tc1-b2m-/-(d)肿瘤的e7特异性cd8

t细胞的频率。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
105.图29：在ct26鼠结肠癌模型中，b2m缺陷防止用化学治疗处理之后的肿瘤排斥。
106.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组n＝9至10)。在
肿瘤达到约6mm3的平均体积之后的第0、7和14天，对小鼠腹膜内(i.p.)注射5mg/kg奥沙利铂(ox)和静脉内(i.v.)注射60mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-fu)。对照组接受载剂。肿瘤生长曲线作为荷瘤小鼠的平均值 sem(a)和存活率(b)显示。统计学显著性使用双因素anova随后进行sidak多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
107.图30：用化学治疗处理之后ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤中cd8

t细胞的差异浸润和抗原特异性。
108.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠并如图29中所述进行处理。在第一次处理之后13天通过流式细胞术测定来自ct26(a)和ct26-b2m-/-(b)肿瘤的肿瘤内cd8

t细胞的数目。来自ct26(c)和ct26-b2m-/-(d)肿瘤的gp70特异性cd8

t细胞的频率。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
109.图31：在ct26鼠结肠癌模型中，b2m缺陷防止用放射治疗处理之后的肿瘤排斥。
110.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠(每组n＝10)。在肿瘤达到约30mm3的平均体积后，用12gy对肿瘤进行局部照射。对照组未处理。肿瘤生长曲线作为荷瘤小鼠的平均值 sem(a)和存活率(b)显示。统计学显著性使用双因素anova随后进行sidak多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点显示。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
111.图32：用放射治疗处理之后ct26和ct26-b2m-/-鼠结肠癌肿瘤中cd8

t细胞的差异浸润和抗原特异性。
112.用5
×
105ct26或ct26-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种balb/c小鼠并如图31中所述进行处理。在处理之后8天通过流式细胞术测定来自ct26(a)和ct26-b2m-/-(b)肿瘤的肿瘤内cd8

t细胞的数目。来自ct26(c)和ct26-b2m-/-(d)肿瘤的gp70特异性cd8

t细胞的频率。点表示单个小鼠，线表示组平均值
±
sem。使用未配对student t检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
113.图33：抗trp1抗体和malb-mil2 rna联合治疗降低b16f10和b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤肿瘤的生长。
114.用3
×
105b16f10或b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝9至10)。在肿瘤接种之后第5、8、12、15、19、22和26天对小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg抗trp1抗体(ta99)或同种型对照，并在第5、12、19和26天静脉内(i.v.)注射用配制的1μg编码malb-mil2或malb(不编码任何细胞因子)的rna。对照组用同种型和malb rna(不编码任何细胞因子)处理。b16f10(a)或b16f10-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的肿瘤生长。显示的数据是平均值 sem。使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
115.图34：抗trp1抗体和malb-mil2 rna联合治疗在b16f10和b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中导致长期存活。
116.用3
×
105b16f10或b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝9至10)并如图33所述进行处理。b16f10(a)或b16f10-b2m-/-(b)荷瘤小鼠的存活率。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
117.图35：malb-mil2 rna单独或与抗trp1抗体组合提高b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中cd4

t细胞和cd8

t细胞的浸润。
118.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内cd4

th细胞(a)、treg细胞(b)和cd8

t细胞(c)的数目。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用kruskal-wallis检验随后进行dunn多重比较检验确定显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
119.图36：malb-mil2 rna单独或与抗trp1抗体组合提高b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中γδt细胞、nk细胞和nkt细胞的浸润。
120.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠，在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。肿瘤接种之后20天通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内δγt细胞(a)、nk细胞(b)和nkt细胞(c)的数目。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用kruskal-wallis检验随后进行dunn多重比较检验确定显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
121.图37：malb-mil2 rna单独或与抗trp1抗体组合提高b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中巨噬细胞的浸润。
122.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内巨噬细胞(a)、单核细胞(b)和中性粒细胞(c)的数目。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用kruskal-wallis检验随后进行dunn多重比较检验确定显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
123.图38：malb-mil2 rna单独或与抗trp1抗体组合提高b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中嗜酸性粒细胞和dc的浸润。
124.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定并相对于肿瘤重量归一化肿瘤内嗜酸性粒细胞(a)、cdc1(b)和cd11b

dc(c)的数目。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用kruskal-wallis检验随后进行dunn多重比较检验确定显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
125.图39：malb-mil2 rna在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中诱导通过肿瘤内巨噬细
胞的fcγr上调。
126.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6(每组n＝7至8)小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定肿瘤内巨噬细胞的fcγri(a)、fc fcγrii/iii(b)和fcγriv(c)的表达。显示的数据是平均值 sem。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
127.图40：malb-mil2 rna在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中诱导通过肿瘤内单核细胞的fcγr上调。
128.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6(每组n＝7至8)小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在肿瘤接种之后20天，通过流式细胞术测定肿瘤内巨噬细胞的fcγri(a)、fc fcγrii/iii(b)和fcγriv(c)的表达。显示的数据是平均值 sem。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
129.图41：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，巨噬细胞的耗竭而不是nk细胞或中性粒细胞的耗竭显示损害经malb-mil2 rna与抗trp1抗体联合处理的小鼠的存活率。
130.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(对照组n＝10，所有其他组n＝8至15)并在肿瘤接种之后如图33中所述用抗trp1(ta99)抗体在第5、8、12、15、19、22天处理，并在第5、12和19天用编码malb-mil2的rna处理。对照组接受同种型对照抗体和编码malb的rna(不编码任何细胞因子)。在肿瘤接种之后，在第4天以400μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对nk1.1、csf1r或ly6g的耗竭抗体或不相关的对照抗体(非耗竭的)，随后在第7、11、14、18和20天注射200μg剂量(不相关抗体、nk1.1或ly6g)或300μg(csf1r)。
131.图42：对血液样品进行流式细胞术分析以确认免疫细胞耗竭。
132.在注射耗竭抗体一天之后，对来自如图41中所述处理的小鼠的血液中nk1.1(nk细胞)(a)或ly6g(中性粒细胞)(b)耗竭进行流式细胞术分析。上图显示来自注射有对照抗体的代表性小鼠的血液，下图显示注射有耗竭抗体的代表性小鼠。
133.图43：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，通过化学治疗增强了malb-mil2 rna与抗trp1抗体组合的肿瘤生长降低。
134.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝12至13)，并在肿瘤接种之后第6天用200mg/kg环磷酰胺(ctx)或载剂作为对照腹膜内(i.p.)注射。在肿瘤接种之后，在具有或不具有抗trp1(ta99)抗体(在第7、10、14、17和21天)和编码malb-mil2的rna(在第7、14和21天)的情况下如图33所述处理小鼠。对照组用同种型对照抗体或编码malb的rna(不编码任何细胞因子)处理。显示的数据是平均值 sem。使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
135.图44：抗trp1抗体和malb-mil2 rna联合治疗降低b16f10-jak1-/
鼠黑色素瘤肿瘤的生长。
136.用3
×
105b16f10-jak1-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)以及在肿
瘤接种之后如图33中所述在第5、8、12、15和19天用抗trp1(ta99)抗体处理和在第5、12和19天用编码malb-mil2的rna处理。对照组用同种型对照抗体或编码malb的rna(不编码任何细胞因子)处理。荷瘤小鼠的肿瘤生长(a)和存活率(b)。显示的数据是平均值 sem。使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
137.图45：tc1和tc1-b2m-/-鼠肺上皮肿瘤的免疫细胞浸润的比较。
138.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。在肿瘤接种之后，在第10天以600μg的剂量和在第12天以350μg的剂量腹膜内(i.p.)注射抗csf1r抗体。在肿瘤接种之后13天，通过流式细胞术分析gr-1-cd11b

f4/80

巨噬细胞群的存在。上图代表未处理的对照，下图示出注射有抗体的单个小鼠。
139.图46：对血液样品进行流式细胞术分析以确认cd4

t细胞和总淋巴细胞耗竭。
140.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(对照组n＝10，所有其他组n＝15)并在肿瘤接种之后如图33中所述用抗trp1(ta99)抗体在第5、8、12、15和19天处理，并在第5、12和19天用编码malb-mil2的rna处理。在肿瘤接种之后，在第3天以400μg的负荷剂量，以及随后在第7、10、14和20天(在第20天仅对照和抗cd4)以200μg的剂量腹膜内(i.p.)注射针对cd4或cd90.2的耗竭抗体或不相关的对照抗体(非耗竭的)。在肿瘤接种之后，在第2天以600μg的负荷剂量以及随后在第5、7、10、12和14天以350μg的剂量腹膜内(i.p.)注射针对csf1r的耗竭抗体。注射耗竭抗体之后2天，对来自小鼠的血液中cd4(cd4

t细胞)(a)或cd90.2(总淋巴细胞)(b)耗竭进行流式细胞术分析。上图示出来自注射有对照抗体的代表性小鼠的血液，下图显示注射有耗竭抗体的代表性小鼠。
141.图47：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，巨噬细胞或总淋巴细胞的耗竭损害用malb-mil2 rna与抗trp1抗体联合处理的小鼠的存活率。
142.按照图46中描述对c57bl/6小鼠进行接种和处理。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
143.图48：对血液样品进行流式细胞术分析以确认cd8

t细胞耗竭。
144.如图46中所述，接种并用抗-trp1(ta99)和用编码malb-mil2的rna对c57bl/6小鼠(对照组n＝8，接受无关对照抗体的组n＝14，接受抗ifnγ的组n＝15，接受抗cd8的组n＝13)进行处理。在肿瘤接种之后，在第3天以400μg的负荷剂量以及随后在第7天和第10天以200μg抗cd8的剂量或者在第5、7和10天以250μg对照抗体或抗ifnγ的剂量腹膜内(i.p.)注射针对cd8的耗竭抗体或针对ifnγ的中和抗体或不相关的对照抗体(非耗竭的)。注射抗cd8抗体之后2天对小鼠血液中cd8(cd8

t细胞)耗竭进行流式细胞术分析。上图显示来自注射有对照抗体的代表性小鼠的血液，下图显示了注射有耗竭抗体的代表性小鼠。
145.图49：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，cd8

t细胞的耗竭或ifnγ中和损害用malb-mil2 rna与抗trp1抗体联合处理的小鼠的存活率。
146.按照图47中的描述对c57bl/6小鼠进行接种和处理。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
147.图50：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，cd8

t细胞和ifnγ是巨噬细胞响应于malb-mil2单独或与抗trp1抗体的组合的促炎性极化所需要的。
148.用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠，并在肿瘤接种之后9天开始如图33中所述的处理。在(b)中，在肿瘤接种之后，再在第7天以400μg的负荷剂量，然后在第11天和第14天以200μg抗cd8的剂量或在第9、11和14天以250μg对照抗体或抗ifnγ的剂量向小鼠注射抗ifnγ、抗cd8或不相关的对照抗体。在肿瘤接种之后20天用malb-mil2和抗trp1(ta99)联合治疗、仅相应的单一治疗或对照处理之后(a)以及在肿瘤接种之后18天用malb-mil2和抗trp1(ta99)联合治疗并注射抗cd8或抗ifnγ抗体处理之后(b)肿瘤内巨噬细胞的极化。
149.图51：抗体和malb-mil2联合治疗提高了抗pd-1和抗ctla4治疗对由b16f10和b16f10-b2m-/-细胞组成的异质性肿瘤的抗肿瘤活性。
150.用包含75％b16f10和25％b16f10-b2m-/-细胞的混合物的3
×
105个细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝15)。在肿瘤接种之后，用抗trp1(ta99)抗体(在第3、7、10、14和17天)和编码malb-mil2的rna(在第3、10和17天)如图33所述处理小鼠。在第3、7、10、14和17天以200μg抗pd-1并用抗ctla4在第3天以200μg负荷剂量、随后在第7、10、14和17天以100μg的剂量再对小鼠进行腹膜内(i.p.)注射。同种型和malb rna用作对照。荷瘤小鼠的单肿瘤生长曲线(a)和存活率(b)。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
151.图52：抗体和malb-mil2联合治疗防止b16f10鼠黑色素瘤模型中针对pd-1和抗ctla4的获得性抗性。
152.按照图51中的描述对c57bl/6小鼠进行接种和处理。当小鼠达到终点标准时获取肿瘤，并在用25ng/ml ifnγ刺激24小时之后通过流式细胞术测定肿瘤细胞悬液中mhc i类

肿瘤细胞的分数。使用单因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
153.图53：mc38-her2-b2m-/-细胞的her2表面表达。
154.将mc38-her2-b2m-/-细胞用20μg/ml抗her2抗体在4℃下孵育20分钟，并使用抗小鼠二抗检测抗体的结合并通过流式细胞术进行分析。
155.图54：抗her2抗体与malb-mil2 rna联合治疗在mc38-her2-b2m-/-鼠结肠腺癌模型中降低肿瘤生长并导致长期存活。
156.用5
×
105mc38-her2-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)。在肿瘤接种之后，在第3、6、10、13、17和24天对小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg抗her2抗体(7.16.4)或同种型对照，并如图33所述在第3、10、17和24天注射编码malb-mil2或malb(不编码任何细胞因子)的rna。对照组用同种型和malb rna处理。肿瘤生长显示为荷瘤小鼠的平均值 sem(a)和存活率(b)。统计学显著性使用双因素anova随后进行dunnet多重比较检验确定，并针对最后描述的时间点(a)或通过对数秩(mantel-cox)检验(b)显示。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
157.图55：在mc38鼠结肠腺癌模型中，b2m缺陷防止用化学治疗处理之后的肿瘤排斥。
158.用5
×
105mc38(每组n＝15)或mc38-b2m-/-(每组n＝10)细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠。在肿瘤接种之后的第4、11和18天，对小鼠腹膜内(i.p.)注射5mg/kg奥沙利铂。对照组接受载剂。荷瘤小鼠的存活率。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
159.图56：在mc38-her2-b2m-/-鼠结肠腺癌模型中抗trp1抗体和malb-mil2 rna联合治疗与化学治疗协同作用。
160.如图55中所述，用5
×
105mc38-her2-b2m-/-细胞对c57bl/6小鼠(每组n＝15)皮下(s.c.)接种并用奥沙利铂(ox)处理。如图54中所述，在第5、8、12、15和19天用抗her2(7.16.4)抗体以及在第7、14和21天用编码malb-mil2的rna再处理小鼠。对照组用载剂、同种型对照抗体或编码malb的rna(不编码任何细胞因子)处理。荷瘤小鼠的存活率。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
161.图57：在b16f10-b2m-/-鼠黑色素瘤模型中，化学治疗增强了malb-mil2 rna与抗trp1抗体组合的肿瘤生长降低。
162.用5
×
105b16f10-jak1-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(对于仅接受对照的组，n＝14，对于所有其他组，n＝15)并在肿瘤接种之后第7天用150mg/kg环磷酰胺(ctx)或载剂作为对照进行腹膜内(i.p.)注射。在肿瘤接种之后，如图33所述用抗trp1(ta99)抗体(在8、11、15、18和22天)和编码malb-mil2的rna(在第8、15和22天)处理小鼠。对照组用载剂、同种型对照抗体或编码malb的rna(不编码任何细胞因子)处理。荷瘤小鼠的存活率。使用对数秩(mantel-cox)检验确定存活率的显著性差异。所有分析是双尾的，并使用graphpad prism 8进行。ns p》0.05，*p≤0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
163.尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
164.优选地，本文中使用的术语如“a multilingual glossary of biotechnological terms:(iupac recommendations)”,h.g.w.leuenberger,b.nagel和h.编辑,helvetica chimica acta,ch-4010basel,switzerland,(1995)中所述进行定义。
165.除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组dna技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如molecular cloning:a laboratory manual,2nd edition,j.sambrook et al.eds.,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor 1989)。
166.在下文中，将描述本公开内容的一些要素。这些要素随一些具体实施方案列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些
实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。
167.术语“约”意指大约或接近，并且在本文中所列的数值或范围的情况下在一个实施方案中意指所记载或要求保护的数值或范围的
±
20％、
±
10％、
±
5％、或
±
3％。
168.除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本公开内容所必需的任何未要求保护的要素。
169.除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以指示除由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，作为本公开内容的具体实施方案认为，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个实施方案的目的，“包含/包括”应理解为具有“由......组成”的含义。
170.在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。
171.下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
172.定义
[0173]“对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性”的癌症意指与正常情况相比，针对癌症的mhc依赖性t细胞应答降低，特别是因为癌症产生本文所述的抗性机制，所述正常情况例如以下情况：其中癌症对mhc依赖性t细胞应答不具有抗性，例如其中可以发生针对癌症的生产性mhc依赖性t细胞应答，最终导致攻击和杀伤肿瘤细胞和/或其中癌症确实对基于即涉及t细胞的治疗具有应答。不是对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的此类癌症优选显示抗原的正常加工和/或呈递以及正常的ifn信号传导。因此，“对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性”的癌症可部分或完全逃避针对癌症的生产性mhc依赖性t细胞应答和/或通过mhc依赖性t细胞的肿瘤细胞杀伤。mhc依赖性t细胞应答可以为针对癌症的内源性反应和/或可以为由诱导mhc依赖性t细胞应答例如由于涉及t细胞的免疫治疗引起的反应。
[0174]
术语“不充分响应”意指与正常情况相比，应答降低，所述正常情况例如其中癌症不是对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性并且确实对基于即涉及t细胞的治疗作出响应的情况。这样的不是对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症优选显示抗原的正常加工和/或呈递以及正常的ifn信号传导。术语“缺陷”意指对象具有缺陷与不存在这种缺陷的正常情况相比的特性或活性降低。
[0175]
优选地，对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性和/或对基于t细胞的治疗不充分应答的癌症：1)可在导致加工和/或呈递抗原的机制方面存在缺陷，例如癌症可能是mhc-i缺陷型的，其中mhc-i的缺陷可能是由于mhc-i等位基因或β2-微球蛋白(b2m)的突变或部分丧失或完全丧失；2)可能在刺激t细胞方面存在缺陷，例如由于在ifn信号传导例如i型ifn或ifnγ信号传导方面存在缺陷；或3)可能已经丧失了用于例如被cd8

t细胞识别的在mhc环境中呈递的抗原；或其组合。
[0176]
本文中使用的例如“减少”、“降低”、“抑制”或“损害”的术语涉及水平(例如，结合水平)的总体降低或导致总体降低的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，更优选75％或更大且最优选100％。
[0177]
例如“提高”、“增强”或“超过”的术语优选涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％，至少200％，至少500％，或甚至更多。
[0178]
根据本公开内容，术语“肽”是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约150个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
[0179]“治疗性蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病或病症、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于细胞因子。
[0180]
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在n端和/或c端缩短的氨基酸序列的序列。在c端缩短的片段(n端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在n端缩短的片段(c端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
[0181]
本文中的“变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于野生型蛋白质的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(wild type，wt)多肽，或者可以是野生型多肽的经修饰形式。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5个氨基酸修饰。
[0182]
本文中使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指随后被修饰以产生变体的未经修饰多肽。亲本多肽可以是野生型多肽，或者野生型多肽的变体或经
改造形式。
[0183]
本文中的“野生型”或“wt”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型蛋白或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。
[0184]
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体和物种同源物，特别是由细胞天然表达的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列片段。
[0185]
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，但是随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的n端和/或c端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为n端和/或c端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另外残基。优先考虑的是修饰发生在氨基酸序列中在同源蛋白或肽之间非保守的位置中和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸的家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
[0186]
甘氨酸、丙氨酸；
[0187]
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
[0188]
天冬氨酸、谷氨酸；
[0189]
天冬酰胺、谷氨酰胺；
[0190]
丝氨酸、苏氨酸；
[0191]
赖氨酸、精氨酸；以及
[0192]
苯丙氨酸、酪氨酸。
[0193]
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于
确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用align，使用标准设置，优选emboss::needle，矩阵:blosum62，空位开放(gap open)10.0，空位延伸(gap extend)0.5来完成。
[0194]“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
[0195]
术语“百分比同一性”旨在表示待比较的两个序列之间在最佳比对之后获得的相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除了人工之外，可借助于smith and waterman,1981,ads app.math.2,482的局部同源性算法、借助于neddleman and wunsch,1970,j.mol.biol.48,443的局部同源性算法，借助于pearson and lipman,1988,proc.natl acad.sci.usa 85,2444的相似性检索方法，或者借助于使用这些算法的计算机程序(wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science drive,madison,wis.中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)来产生。
[0196]
百分比同一性通过确定待比较的两个序列之间相同的位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100来计算，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
[0197]
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98％或至少99％同一性。
[0198]
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组dna操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的dna序列的操作在例如sambrook et al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
[0199]
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及以下任何片段或变体，其表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的一种或更多种功能特性相同或相似的一种或更多种功能特性(即，其是功能等同的)。关于细胞因子例如il2，一种特定功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列所表现出的一种或更多种免疫调节活性和/或与该片段或变体所来源的氨基酸序列所结合的受体的结合。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如，与靶分子结合或有助于与靶分子结合)的氨基酸序列的变体分子或序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的结合特性。在一些不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的结合可降低但仍显著存在，例如，功能性变体的结合可为亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的结合可以是增强的。
[0200]“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)
是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的il2化合物可以被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
[0201]
本文中使用的“说明材料”或“说明”包括可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其他表达媒介。例如，本发明的药盒的说明材料可标附到含有本发明组合物的容器上，或者与含有所述组合物的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，目的是让接受者合作使用说明材料和组合物。
[0202]“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全从其天然状态的共存物质中分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以充分纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。
[0203]
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物质”例如重组细胞是非天然存在的。
[0204]
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
[0205]
术语“遗传修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是rna引入细胞中。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或由这样的细胞摄入核酸，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合至核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定转染可通过使用用于转染的基于病毒的系统或基于转座子的系统来实现。通常，将编码细胞因子如il2的核酸瞬时转染到细胞中。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
[0206]
在本发明上下文中，术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应物功能的细胞。例如，免疫效应细胞包括t细胞(细胞毒性t细胞、辅助t细胞、肿瘤浸润t细胞)、b细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括t辅助细胞(cd4

t细胞)和包括细胞裂解t细胞的细胞毒性t细胞(ctl，cd8

t细胞)。术语“mhc依赖性t细胞”或类似术语涉及当在mhc环境中呈递时识别抗原并优选发挥t细胞效应功能例如杀伤表达抗原的靶细胞的t细胞。
[0207]
t细胞属于被称为淋巴细胞的白细胞的组群，并且在细胞介导的免疫中发挥主要作用。它们可以通过其细胞表面上被称为t细胞受体(tcr)的特殊受体的存在与其他淋巴细胞类型(例如b细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责t细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的t细胞亚群，每种具有独特的功能。
[0208]
t辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括b细胞成熟成浆细胞以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为cd4

t细胞，因为它们在其表面上表达cd4糖蛋白。当辅助t细胞通过在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，apc)表面上表达的mhc ii类分子呈递肽抗原时，其被活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，所述小蛋白调节或辅助主动免疫应答。
[0209]
细胞毒性t细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移植排斥。这些细胞也被称为cd8

t细胞，因为它们在其表面上表达cd8糖蛋白。这些细胞通过与存在于身体几乎每个细胞的表面上的mhc i类缔合的抗原结合来识别它们的靶标。
[0210]
所有t细胞都具有作为数种蛋白质的复合物存在的t细胞受体(tcr)。t细胞的tcr能够与同主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)分子结合并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。tcr的特异性结合触发t细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应t细胞。在大多数t细胞中，实际的t细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的t细胞受体α和β(tcrα和tcrβ)基因产生，并被称为α-tcr链和β-tcr链。γδt细胞(gamma delta t细胞)是很不常见(总t细胞的2％)的t细胞组群，其表面上具有由一条γ链和一条δ链构成的独特t细胞受体(tcr)。
[0211]
所有t细胞都来源于骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达cd4也不表达cd8，并因此分类为双阴性(cd4-cd8-)细胞。随着它们通过发育过程进展，它们变成双阳性胸腺细胞(cd4

cd8

)，并且最终成熟成单阳性(cd4

cd8-或cd4-cd8

)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。
[0212]
本文中使用的术语“nk细胞”或“自然杀伤细胞”是指由cd56或cd16的表达和t细胞受体的缺失定义的外周血淋巴细胞亚群。
[0213]
人体内mhc分子通常称为hla(人白细胞抗原)分子。mhc分子有两个主要类别：i类和ii类。几乎在身体的所有有核细胞上都发现了mhc i类抗原。这类mhc分子的主要功能是将细胞内蛋白的肽片段展示(或呈递)给ctl。基于这种展示，ctl将攻击展示mhc结合的肽(包括疾病相关肽(抗原)，例如癌症抗原)的那些。cd8阳性t细胞通常具有细胞毒性(因此称为细胞毒性t细胞＝ctl)，识别由任何亚细胞定位的蛋白质在细胞内加工而来并通过mhc i类分子呈递在细胞表面的具有9至10个氨基酸的肽。因此，mhc i类分子的表面表达在决定靶细胞对ctl的敏感性方面起着至关重要的作用。
[0214]
癌症免疫治疗中经常遇到的一个问题是癌症组织中免疫原性的损害，例如，导致对癌症的mhc依赖性t细胞应答具有抗性。这种所谓的“免疫逃逸”可以根据在肿瘤细胞中遇到的表型差异来理解。例如，肿瘤细胞表现出加工和呈递抗原的能力降低；刺激t细胞例如自体t细胞的能力降低，例如，由于在ifn信号传导方面存在缺陷；表现出与转化细胞相关的免疫原性蛋白的完全下调和/或白细胞粘附分子或其他辅助分子不表达或低表达，以及某些mhc i类和ii类等位基因或b2m的选择性下调。mhc功能或表达丧失可由单个mhc等位基因、mhc单倍型的丧失或由于双等位基因b2m基因丧失引起的mhc i类完全丧失引起的。因此，失去mhc表达的肿瘤对任何基于mhc依赖性t细胞的治疗都具有抗性。事实上，mhc功能的损害是肿瘤细胞的关键“免疫逃逸”机制之一，因此限制了t细胞介导的免疫治疗的应用。根据本发明，对mhc依赖性t细胞应答具有至少部分抗性的癌症可能已经获得了这些免疫逃逸
机制中的一种或更多种。
[0215]
基因组不稳定性是癌症的标志。它能够使肿瘤进化、适应和发生对治疗的抗性。与宿主免疫系统的相互作用决定了给定的肿瘤细胞克隆生存和传播的能力。因此，“选择”，尤其是由于对例如mhc-i缺陷型肿瘤变体的t细胞免疫压力而“选择”的过程，可代表自然过程。许多治疗(例如疫苗接种)针对抗性选择，因此不能有效地解决障碍。本文公开了一种治疗，其中对癌细胞进行通过转换癌细胞靶向而产生的替代选择压力。这种替代选择压力还使得避免对mhc依赖性t细胞应答产生抗性。
[0216]
干扰素
[0217]
干扰素(ifn)是由宿主细胞响应于多种病原体(例如病毒、细菌、寄生虫还有肿瘤细胞)的存在而产生和释放的一组信号传导蛋白。在一种典型情况下，病毒感染的细胞将释放干扰素，导致附近的细胞增强其抗病毒防御。
[0218]
基于受体(通过其干扰素发出信号)的类型，干扰素通常分为三类：i型干扰素、ii型干扰素和iii型干扰素。
[0219]
所有i型干扰素均与称为ifn-α/β受体(ifnar)的特定细胞表面受体复合体结合，所述ifn-α/β受体(ifnar)由ifnar1和ifnar2链组成。
[0220]
人中存在的i型干扰素为ifnα、ifnβ、ifnε、ifnκ和ifnω。一般来说，i型干扰素是在身体识别入侵身体的病毒时产生的。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。一旦释放，i型干扰素与靶细胞上的特定受体结合，这导致表达将防止病毒产生和复制其rna和dna的蛋白质。
[0221]
ifnα蛋白主要由浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pdc)产生。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫。负责其合成的基因以被称为以下的13种亚型出现：ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17、ifna21。这些基因在9号染色体上成簇一起被发现。
[0222]
ifnβ蛋白由成纤维细胞大量产生。它们具有主要参与先天免疫应答的抗病毒活性。已经描述了两种类型的ifnβ，ifnβ1和ifnβ3。ifnβ1的天然和重组形式具有抗病毒、抗菌和抗癌特性。
[0223]
ii型干扰素(人中的ifnγ)也称为免疫干扰素，并且由il12活化。此外，ii型干扰素由细胞毒性t细胞和t辅助细胞释放。
[0224]
iii型干扰素通过由il10r2(也称为crf2-4)和ifnlr1(也称为crf2-12)组成的受体复合体发出信号。尽管比i型和ii型干扰素发现得更晚，但最近的信息表明了iii型干扰素在一些类型的病毒或真菌感染中的重要性。
[0225]
一般来说，i型和ii型干扰素负责调节和活化免疫应答。
[0226]
术语“自体”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。这样的程序是有利的，因为它们克服了免疫屏障，而免疫屏障在其他情况下会导致排斥。
[0227]
术语“同种异体的”用于描述来源于相同物种的不同个体的任何事物。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
[0228]
术语“同基因的”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双胞胎或同一近交系的动物，或其组织)的任何事物。
[0229]
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植。异源基因是来源于除对象之外的来源的基因。
[0230]
核酸
[0231]
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括dna和rna，例如基因组dna、cdna、mrna、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。rna包括体外转录的rna(in vitro transcribed rna，ivt rna)或合成的rna。
[0232]
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，其包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)，或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，bac)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，yac)或p1人工染色体(p1 artificial chromosome，pac))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体并且一般含有期望编码序列和用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或者在体外表达系统中可操作地连接的编码序列之表达所必需的合适的dna序列。克隆载体一般用于改造和扩增某期望dna片段，并可缺乏表达所期望dna片段所需要的功能性序列。
[0233]
在本发明所有方面的一个实施方案中，例如编码il2的核酸或编码抗体的核酸的核酸在经处理以提供il2或抗体的对象细胞中表达。在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸在对象的细胞中瞬时表达。因此，在一个实施方案中，核酸未整合到细胞的基因组中。在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸为rna，优选体外转录的rna。
[0234]
本文中所述核酸可为重组和/或分离的分子。
[0235]
在本公开内容中，术语“rna”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，rna包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2
’‑
位具有羟基的核苷酸。rna包括但不限于双链rna、单链rna、分离的rna(例如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成的rna、重组产生的rna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的rna之经修饰的rna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或rna的末端。本文中还考虑了rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的rna被认为是天然存在rna的类似物。
[0236]
在本公开内容的某些实施方案中，rna是信使rna(mrna)，其是指编码肽或蛋白质的rna转录物。如本领域中认可的，mrna通常包含5’非翻译区(5
’‑
utr)、肽编码区和3’非翻译区(3
’‑
utr)。在一些实施方案中，rna通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mrna通过使用dna模板进行体外转录产生，其中dna是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
[0237]
在一个实施方案中，rna是体外转录的rna(ivt-rna)，并且可通过合适dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。用于体外转录的dna模板可通过克隆核酸，特别是cdna并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cdna可通过rna的反转录获得。
[0238]
在一个实施方案中，本文中所述的rna可具有经修饰的核苷。在一些实施方案中，rna包含代替至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰的核苷。
[0239]
本文中使用的术语“尿嘧啶”描述了可存在于rna的核酸中的核碱基之一。尿嘧啶
的结构是：
[0240]
本文中使用的术语“尿苷”描述了可存在于rna中的核苷之一。尿苷的结构是：
[0241][0242]
utp(5
’‑
三磷酸尿苷)具有以下结构：
[0243][0244]
假-utp(5
’‑
三磷酸假尿苷)具有以下结构：
[0245][0246]“假尿苷”是经修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。
[0247]
另一示例性的经修饰的核苷是n1-甲基-假尿苷(m1ψ)，其具有以下结构：
[0248][0249]
n1-甲基-假-utp具有以下结构：
[0250][0251]
另一示例性的经修饰的核苷为5-甲基-尿苷(m5u)，其具有以下结构：
[0252][0253]
在一些实施方案中，本文中所述的rna中的一个或更多个尿苷被经修饰的核苷替代。在一些实施方案中，经修饰的核苷是经修饰的尿苷。
[0254]
在一些实施方案中，rna包含代替至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方案中，rna包含代替每个尿苷的经修饰的核苷。
[0255]
在一些实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，rna可包含多于一种类型的经修饰的核苷，并且经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。
[0256]
在一些实施方案中，替代rna中的一个或更多个尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、
1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2
’‑
o-甲基-尿苷(um)、5,2
’‑
o-二甲基-尿苷(m5um)、2
’‑
o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2
’‑
o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2
’‑
o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2
’‑
o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2
’‑
f-阿糖-尿苷、2
’‑
f-尿苷、2
’‑
oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
[0257]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
帽。在一个实施方案中，本公开内容的rna不具有未加帽的5'-三磷酸。在一个实施方案中，rna可被5'-帽类似物修饰。术语“5
’‑
帽”是指见于mrna分子的5
’‑
端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸连接与mrna连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的rna可通过体外转录来实现，其中5'-帽共转录表达到rna链中，或者可使用加帽酶转录后与rna连接。
[0258]
在一些实施方案中，rna的构件单元帽为m
27,3
’‑ogppp(m
12
’‑o)apg(有时也称为m
27,3`o
g(5’)ppp(5’)m2’‑oapg)，其具有以下结构：
[0259][0260]
下面是示例性帽1rna，其包含rna和m
27,3`o
g(5’)ppp(5’)m2’‑oapg：
[0261][0262]
下面是另一个示例性的帽1rna(无帽类似物)：。
[0263][0264]
在一些实施方案中，用“帽0”结构修饰rna，所述“帽0”结构在一个实施方案中使用了具有以下结构的帽类似物反逆转帽(arca帽(m
27,3`o
g(5’)ppp(5’)g))：。
[0265][0266]
下面是包含rna和m
27,3`o
g(5’)ppp(5’)g的一个示例性帽0rna：。
[0267][0268]
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-s-arca(m
27,2`o
g(5’)ppsp(5’)g)产生“帽0”结构：。
[0269][0270]
下面是包含β-s-arca(m
27,2`o
g(5’)ppsp(5’)g)和rna的一个示例性帽0rna：。
[0271][0272]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
utr和/或3
’‑
utr。术语“非翻译区”或”utr”涉及dna分子中被转录但不被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及rna分子(例如mrna分子)中的相应区域。非翻译区(utr)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5
’‑
utr)和/或开放阅读框的3’(下游)(3
’‑
utr)。5
’‑
utr(如果存在的话)位于5’端，在蛋白质编码区的起始密码子的上游。5
’‑
utr位于5
’‑
帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3
’‑
utr(如果存在的话)位于3’端，在蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3
’‑
utr”优选不包含poly(a)序列。因此，3
’‑
utr位于poly(a)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(a)序列相邻。
[0273]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含3
’‑
poly(a)序列。本文中使用的术语“poly(a)序列”或“poly-a尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断的序列，其通常位于rna分子的3’端。poly(a)序列为本领域技术人员已知的，并且可在本文中所述rna中紧接3’utr。
poly(a)序列可以是任意长度。在一些实施方案中，poly(a)序列包含以下或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸，特别是约110个核苷酸。在一些实施方案中，poly(a)序列仅由a核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(a)序列基本上由a核苷酸组成，但被四种核苷酸(a、c、g和u)的随机序列间断，如通过引用在此并入的wo 2016/005324 a1中所公开的。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。存在于dna编码链中基本上由da核苷酸组成但被具有平均分布的四种核苷酸(da、dc、dg、dt)且具有例如5至50个核苷酸的长度的随机序列间断的poly(a)盒在dna水平上显示出质粒dna在大肠杆菌(e.coli)中的不断增殖，并且在rna水平上仍然与关于支持rna稳定性和翻译效率的有益特性相关。在一些实施方案中，除a核苷酸之外，poly(a)序列在其3’端没有侧接其他核苷酸，即poly(a)序列在其3’端不被除a之外的核苷酸掩蔽或紧接。
[0274]
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna的过程。随后，rna可被翻译成肽或蛋白质。
[0275]“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中特定核苷酸序列用作模板在生物过程中合成其他聚合物和大分子的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cdna转录模板的非编码链二者均可称为编码蛋白质或该基因或cdna的其他产物。
[0276]
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
[0277]
本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
[0278]
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0279]
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。
[0280]
细胞因子
[0281]
细胞因子是一类在细胞信号传导中重要的小蛋白(约5至20kda)。它们的释放对它们周围细胞的行为有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子(尽管用语有些重叠)。细胞因子由广泛多种的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞，例如巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和多种基质细胞。给定的细胞因子可由多于一种的细胞类型产生。细胞因子通过受体起作用，并且在免疫系统中尤为重要；细胞因子调节体液免疫应答和基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且它们调节特定细胞群体的成熟、生长和反应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制另一些细胞因子的作用。
[0282]
il2
[0283]
白介素-2(il2)是诱导抗原活化的t细胞的增殖并刺激自然杀伤(nk)细胞的细胞因子。il2的生物活性是通过跨细胞膜的以下三个多肽亚基的多亚基il2受体复合体(il2r)
介导的：p55(il2rα，α亚基，在人中也称为cd25)、p75(il2rβ，β亚基，在人中也称为cd122)和p64(il2rγ，γ亚基，在人中也称为cd132)。t细胞对il2的响应取决于多种因素，包括：(1)il2的浓度；(2)细胞表面上il2r分子的数目；以及(3)il2占据的il2r的数目(即，il2和il2r之间的结合相互作用的亲和力(smith,“cell growth signal transduction is quantal”in receptor activation by antigens,cytokines,hormones,and growth factors 766:263-271,1995))。il2:il2r复合体在配体结合之后被内化，并且不同组分进行差异分选。当作为静脉内(intravenous，i.v.)推注施用时，il2具有快速的全身清除(半衰期为12.9分钟的初始清除阶段，接着是半衰期为85分钟的较慢清除阶段)(konrad et al.,cancer res.50:2009-2017,1990)。
[0284]
在真核细胞中，人il2作为153个氨基酸的前体多肽合成，从中去除20个氨基酸以生成成熟的分泌型il2。重组人il2已在大肠杆菌中、昆虫细胞中和哺乳动物cos细胞中产生。
[0285]
根据本公开内容，il2(任选地作为pk延长的il2的一部分)可以是天然存在的il2或其片段或变体。il2可以是人il2，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。本文中使用的“人il2”或“野生型人il2”(无论是天然的还是重组的)具有天然人il2的正常存在的133个氨基酸的序列(少了信号肽，其由另外的20个n端氨基酸组成)(其氨基酸序列描述于fujita等，pnas usa,80,7437-7441(1983)中)，具有或不具有另外的n端甲硫氨酸，当蛋白质在大肠杆菌中作为胞内级分表示时，需要包含所述甲硫氨酸。
[0286]
在一个实施方案中，il2包含seq id no:1或2的氨基酸序列。在一个实施方案中，il2的功能性变体包含与seq id no:1或2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，il2的功能性变体与il2受体或il2受体的亚基(例如α亚基和/或β/γ亚基)结合。一般而言，出于本公开内容的目的，除非与环境相矛盾，否则本文中使用的术语“il2”包括包含天然存在的il2部分或其功能性变体的任何多肽。
[0287]
根据本公开内容，在某些实施方案中，il2与药代动力学修饰基团连接。相对于游离il2，所得分子(下文称为“药代动力学(pk)延长的il2”)具有延长的循环半衰期。pk延长的il2的延长的循环半衰期使体内血清il2的浓度维持在治疗范围内，从而有可能导致许多类型的免疫细胞(包括t细胞)的活化增强。由于pk延长的il2的有利的药代动力学谱，其与未经修饰的il2相比可以以较低的频率给药并且持续更长的时间。
[0288]
因此，在本文中所述的某些实施方案中，il2部分与异源多肽(即，不是il2且优选地不是il2的变体的多肽)融合，并且因此是pk延长的il2。在某些实施方案中，pk延长的il2的il2部分是人il2。在另一些实施方案中，pk延长的il2的il2部分是人il2的片段或变体。异源多肽可提高il2的循环半衰期。如下文进一步详细讨论的，提高循环半衰期的多肽可以是血清白蛋白，例如人或小鼠血清白蛋白。
[0289]
il15
[0290]
在本文公开的涉及使用包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸的那些实施方案中，作为包含il2或其功能性变体的多肽或编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸的补充或替代，可以使用包含il15或其功能性变体的多肽或编码包含il15或其功能性变体的多肽的多核苷酸。
[0291]
白介素-15(il15)是与白介素-2(il2)结构相似的细胞因子。与il2一样，il15与由il-2/il-15受体β链(cd122)和共同γ链(γ-c、cd132)构成的复合物结合并通过其发出信号。il15诱导自然杀伤细胞的细胞增殖。
[0292]
pk延长基团
[0293]
本文中所述的il2多肽可制备为融合多肽或嵌合多肽，其包含il2部分和异源多肽(即，不是il2或其变体的多肽)。il2可与pk延长基团融合，这提高了循环半衰期。下文描述了pk延长基团的一些非限制性实例。应理解，提高细胞因子或其变体的循环半衰期的其他pk基团也适用于本公开内容。在某些实施方案中，pk延长基团是血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
[0294]
本文中使用的术语“pk”是“药代动力学”的首字母缩略词，并且涵盖化合物的包括以下的特性：例如由对象进行的吸收、分布、代谢和清除。本文中使用的“pk延长基团”是指当与生物活性分子融合或一起施用时提高生物活性分子的循环半衰期的蛋白质、肽或部分。pk延长基团的一些实例包括：血清白蛋白(例如，hsa)、免疫球蛋白fc或fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体和人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)结合剂(如美国公开no.2005/0287153和2007/0003549中所公开的)。另一些示例性pk延长基团在kontermann,expert opin biol ther,2016jul；16(7):903-15中公开，其通过引用整体并入本文。本文中使用的“pk延长的细胞因子”是指与pk延长基团组合的细胞因子部分。在一个实施方案中，pk延长的细胞因子是其中细胞因子部分与pk延长基团连接或融合的融合蛋白。本文中使用的“pk延长的il”是指与pk延长基团组合的白介素(il)部分(包括il变体部分)。在一个实施方案中，pk延长的il是其中il部分与pk延长基团连接或融合的融合蛋白。一个示例性的融合蛋白是其中il2部分与hsa融合的hsa/il2融合体。
[0295]
在某些实施方案中，相对于单独的il(即，不与pk延长基团融合的il)，pk延长的il的血清半衰期提高。在某些实施方案中，相对于单独的il的血清半衰期，pk延长的il的血清半衰期为至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％或1000％更长。在某些实施方案中，pk延长的il的血清半衰期是单独的il的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍长。在某些实施方案中，pk延长的il的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
[0296]
本文中使用的“半衰期”是指例如由于通过天然机制的降解和/或清除或螯合而使化合物(例如肽或蛋白质)的血清或血浆浓度在体内降低50％所花费的时间。适用于本文中的pk延长的细胞因子(例如pk延长的白介素(il))在体内是稳定的，并且其半衰期通过例如与抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白(例如hsa或msa)融合而提高。半衰期可以以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来确定。合适的技术对于本领域技术人员而言将是明显的，并且可例如通常包括以下步骤：合适地向对象施用合适剂量的氨基酸序列或化合物；定期收集来自所述对象的血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；以及根据由此获得的数据(的图)计算直至氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药时的初始水平相比降低了50％为止的时间。在例如标准手册，例如
kenneth,a.等,chemical stability of pharmaceuticals:a handbook for pharmacists和在peters等,pharmacokinetic analysis:a practical approach(1996)中提供更多的细节。也参考gibaldi,m.等，pharmacokinetics,2nd rev.edition,marcel dekker(1982)。
[0297]
在某些实施方案中，pk延长基团包括血清白蛋白或其片段或者血清白蛋白或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“白蛋白”包括)。本文中所述的多肽可以与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。这样的白蛋白融合蛋白在美国公开no.20070048282中描述。
[0298]
本文中使用的“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个白蛋白分子(或其片段或变体)与至少一个蛋白质分子(例如治疗性蛋白质，特别是il2(或其变体))融合而形成的蛋白质。白蛋白融合蛋白可通过翻译核酸来产生，其中编码治疗性蛋白质的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸框内连接。治疗性蛋白质和白蛋白一旦是白蛋白融合蛋白的一部分可各自被称为白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如“治疗性蛋白质部分”或“白蛋白蛋白质部分”)。在一个高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个治疗性蛋白质分子(包括但不限于治疗性蛋白质的成熟形式)和至少一个白蛋白分子(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白由用于所施用rna的宿主细胞(例如靶器官的细胞(例如肝细胞))加工并被分泌到循环中。在用于表达rna的宿主细胞分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于：信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；糖类的添加和加工(例如如n-和o-连接糖基化)；特定的蛋白水解切割；和/或组装成多聚体蛋白质。白蛋白融合蛋白优选由rna以特别地在其n端具有信号肽的非加工形式编码，并且在由细胞分泌之后优选以经加工的形式存在，其中特别地信号肽已被切割掉。在一个最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的经加工形式”是指已经经历了n端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。
[0299]
在一些优选实施方案中，包含治疗性蛋白质的白蛋白融合蛋白与未与白蛋白融合的相同治疗性蛋白质的血浆稳定性相比具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指当体内施用治疗性蛋白质并带入血流中与当治疗性蛋白质被降解并从血流中被清除至器官(例如肾或肝)(最终从身体清除治疗性蛋白质)之间的时间段。根据治疗性蛋白质在血流中的半衰期来计算血浆稳定性。治疗性蛋白质在血流中的半衰期可通过本领域已知的常规测定法容易地确定。
[0300]
本文中使用的“白蛋白”统指白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如，生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的变体。白蛋白可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、牛、羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可与治疗性蛋白质部分来自不同的动物。
[0301]
在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(hsa)或其片段或变体，例如在us 5,876,969、wo 2011/124718、wo 2013/075066和wo 2011/0514789中公开的那些。
[0302]
术语人血清白蛋白(hsa)和人白蛋白(ha)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
[0303]
本文中使用的足以延长治疗性蛋白质的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指这样的白蛋白片段：长度或结构足以稳定或延长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性，使得白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的血浆稳定性与非融合状态下的血浆稳定性相比延长或延伸。
[0304]
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含白蛋白序列的全长，或者可包含其一个或更多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这样的片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可包含来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可包含白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的一个或更多个hsa片段。在一个优选实施方案中，hsa片段是hsa的成熟形式。
[0305]
一般而言，白蛋白片段或变体将是至少100个氨基酸长，优选至少150个氨基酸长。
[0306]
根据本公开内容，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。在一个实施方案中，白蛋白包含seq id no:3或4的氨基酸序列或与seq id no:3或4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0307]
优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为n端部分并且包含治疗性蛋白质作为c端部分。或者，也可使用包含白蛋白作为c端部分并且包含治疗性蛋白质作为n端部分的白蛋白融合蛋白。在另一些实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的n端和c端二者融合的治疗性蛋白质。在一个优选实施方案中，在n端和c端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一个优选实施方案中，在n端和c端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在一个实施方案中，不同的治疗性蛋白质均是细胞因子。
[0308]
在一个实施方案中，治疗性蛋白质通过肽接头与白蛋白连接。融合的部分之间的接头肽可在部分之间提供更大的物理分离，并因此使治疗性蛋白质部分的可及性最大化，例如，用于与其同源受体结合。接头肽可由氨基酸组成使得它是柔性的或更刚性的。接头序列可被蛋白酶或化学地切割。
[0309]
本文中使用的术语“fc区”是指天然免疫球蛋白的由其两条重链的各自的fc结构域(或fc部分)形成的部分。本文中使用的术语“fc结构域”是指单个免疫球蛋白(ig)重链的部分或片段，其中fc结构域不包含fv结构域。在某些实施方案中，fc结构域在铰链区中在正好位于木瓜蛋白酶切割位点上游开始，并终止于抗体的c端。因此，完整的fc结构域包含至少铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域。在某些实施方案中，fc结构域包含以下至少之一：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域、ch4结构域，或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，fc结构域包含完整的fc结构域(即，铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域)。在某些实施方案中，fc结构域包含与ch3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，fc结构域包含与ch3结构域(或其部分)融合的ch2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，fc结构域由ch3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，fc结构域由铰链结构域(或其部分)和ch3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，fc结构域由ch2结构域(或其部分)和ch3结构域组成。在某些实施方案中，fc结构域由铰链结构域(或其部分)和ch2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，fc结构域缺少ch2结构域的至少一部分(例如，ch2结构域的全部或部分)。本文中的fc结构域通常是指包
含免疫球蛋白重链的fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整的ch1、铰链、ch2和/或ch3结构域的多肽，以及这样的肽的仅包含例如铰链、ch2和ch3结构域的片段。fc结构域可来源于任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于：人igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗体。fc结构域涵盖天然fc和fc变体分子。如本文中所述，本领域普通技术人员将理解，任何fc结构域可被修饰，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然fc结构域不同。在某些实施方案中，fc结构域具有降低的效应子功能(例如，fcγr结合)。
[0310]
本文中所述的多肽的fc结构域可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的fc结构域可包含来源于igg1分子的ch2和/或ch3结构域和来源于igg3分子的铰链区。在另一个实例中，fc结构域可包含部分地来源于igg1分子且部分地来源于igg3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中，fc结构域可包含部分地来源于igg1分子且部分地来源于igg4分子的嵌合铰链。
[0311]
在某些实施方案中，pk延长基团包含fc结构域或其片段或者fc结构域或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“fc结构域”包括)。fc结构域不包含与抗原结合的可变区。适用于本公开内容的fc结构域可获自许多不同的来源。在某些实施方案中，fc结构域来源于人免疫球蛋白。在某些实施方案中，fc结构域来自人igg1恒定区。然而，应理解，fc结构域可来源于其他哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述物种包括例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、猕猴)物种。
[0312]
此外，fc结构域(或其片段或变体)可来源于任何免疫球蛋白种类，包括igm、igg、igd、iga和ige，并且可来源于任何免疫球蛋白同种型，包括iggl、igg2、igg3和igg4。
[0313]
多种fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)均可以以公共可获得的保藏物的形式得到。可选择缺乏特定效应子功能和/或具有特定修饰以降低免疫原性的包含fc结构域序列的恒定区结构域。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公布，并且可使用本领域公认的技术从这些序列中得到合适的fc结构域序列(例如，铰链、ch2和/或ch3序列或其片段或变体)。
[0314]
在某些实施方案中，pk延长基团是血清白蛋白结合蛋白，例如在us2005/0287153、us2007/0003549、us2007/0178082、us2007/0269422、us2010/0113339、wo2009/083804和wo2009/133208中描述的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是转铁蛋白，如在us 7,176,278和us 8,158,579中公开的，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如在us2007/0178082、us2014/0220017和us2017/0145062中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是与血清白蛋白结合的基于纤连蛋白(fn)的支架结构域蛋白，例如us2012/0094909中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在us2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于fn3的pk延长基团的一个非限制性实例是fn3(hsa)，即与人血清白蛋白结合的fn3蛋白。
[0315]
在某些方面中，适合于根据本公开内容使用的pk延长的il，可采用一种或更多种肽接头。本文中使用的术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中将两个或更多个结构域(例如，pk延长部分和il部分，例如il2)连接的肽或多肽序列。例如，肽接头可用于将il2部分与hsa结构域连接。
[0316]
适合于将pk延长基团与例如il2融合的接头是本领域公知的。一些示例性的接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
[0317]
除上述异源多肽之外或代替上述异源多肽，本文中所述的il2变体多肽可包含编码“标志物”或“报道子”的序列。标志物或报道子基因的一些实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，cat)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ada)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，dhfr)、潮霉素-b-磷酸转移酶(hygromycin-b-hosphotransferase，hph)、胸苷激酶(thymidine kinase，tk)、β-半乳糖苷酶以及黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xanthine guanine phosphoribosyltransferase，xgprt)。
[0318]
抗原
[0319]
术语“抗原”涉及包含免疫应答或免疫效应分子如抗体所针对的和/或将要针对的表位的试剂。特别地，术语“抗原”包括蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原为疾病相关抗原，例如肿瘤抗原。
[0320]
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原，其优选包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原、其表位或靶向疾病相关抗原或表位的试剂因此可用于治疗目的。疾病相关抗原可与微生物感染相关(通常是微生物抗原)或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
[0321]
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。肿瘤抗原通常优先地由癌细胞表达(例如，与非癌细胞相比，在癌细胞中其以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，art-4，bage，β-联蛋白/m，bcr-abl camel，cap-1，casp-8，cdc27/m，cdk4/m，cea，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-myc，ct，cyp-b，dam，elf2m，etv6-aml1，g250，gage，gnt-v，gap 100，hage，her-2/neu，hpv-e7，hpv-e6，hast-2，htert(或htrt)，lage，ldlr/fut，mage-a，优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11或mage-a12，mage-b，mage-c，mart-1/melan-a，mc1r，肌球蛋白/m，muc1，mum-1，mum-2，mum-3，na88-a，nf1，ny-eso-1，ny-br-1，pl90小bcr-abl，pml/rara，prame，蛋白酶3，psa，psm，rage，ru1或ru2，sage，sart-1或sart-3，scgb3a2，scp1，scp2，scp3，ssx，存活蛋白，tel/aml1，tpi/m，trp-1，trp-2，trp-2/int2，tpte，wt和wt-1。
[0322]
术语“在细胞表面上表达”、“与细胞表面相关”或类似术语意指例如抗原的分子与细胞质膜相关并位于细胞质膜上，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可从所述细胞的外部接近，例如，通过位于细胞外的抗体。在该背景下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该相关可以是直接的或间接的。例如，该相关可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚的，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上发现的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用的。例如，与细胞表面相关的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是
跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面相关的蛋白质。
[0323]“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可由蛋白质和其他分子结合的细胞外部。
[0324]
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部接近(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
[0325]
术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，即分子(例如抗原)中被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被t细胞、b细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包含b细胞表位和t细胞表位。
[0326]
术语“t细胞表位”是指蛋白质中当在mhc分子的情况下呈递时被t细胞识别的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“mhc”包括mhc i类和mhc ii类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被t细胞上的t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给t细胞。在mhc i类/肽复合体的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的。在mhc ii类/肽复合体的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，然而更长和更短的肽也可以是有效的。
[0327]
治疗性抗体
[0328]“治疗性抗体”为可以结合至抗原，特别是靶细胞例如癌细胞上的细胞表面抗原以引起治疗效应的抗体。治疗性单克隆抗体被认为是一类药物活性剂，其应该允许通过靶向肿瘤选择性抗原或表位来进行肿瘤选择性治疗。在一些优选的实施方案中，治疗性抗体靶向肿瘤或癌症抗原。
[0329]
术语“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，并且包括包含其抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体以及抗体的片段或衍生物(即衍生自抗体的构建体)，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体，例如scfv和抗原结合抗体片段，例如fab和fab’片段，并且还包括所有重组形式的抗体，例如在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体和本文中所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每条重链由重链可变区(本文中缩写为vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为vl)和轻链恒定区构成。vh和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
[0330]
本文中所述的抗体可以是人抗体。如本文中所用，术语“人抗体”旨在包括具有来
源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文中所述的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0331]
术语“人源化抗体”是指具有基本来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区上的互补决定区(complementarity determining region，cdr)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或更多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以使其与人免疫球蛋白更类似。一些形式的人源化抗体保留了全部cdr序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个cdr的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或更多个相对于原始抗体而言发生了改变的cdr。
[0332]
术语“嵌合抗体”是指这样的那些抗体，其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或者属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而该链的其余区段则与另一者中的相应序列同源。通常来说，轻链和重链二者的可变区均模拟来源于一个哺乳动物物种之抗体的可变区，而恒定部分则与来源于另一个的抗体序列同源。这样的嵌合形式的一个明显优点是可使用易于获得的b细胞或来自非人宿主生物体的杂交瘤从目前已知的来源方便地产生可变区，而与其组合的恒定区来源于例如人细胞制备物。尽管所述可变区具有易于制备的优点并且特异性不受来源的影响，恒定区为人的在抗体在注射时引发人对象免疫应答的可能性将比恒定区来自非人来源时更低。然而，定义不限于此特定实例。
[0333]
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称为“结合片段”)或者类似的术语是指抗体中保留与抗原特异性结合之能力的一个或更多个片段。已表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括：(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段，其由vh和ch结构域组成；(iv)fv片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成；(v)dab片段(ward等,(1989)nature 341:544-546)，其由vh结构域组成；(vi)分离的互补性决定区(cdr)；以及(vii)两个或更多个分离的cdr的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，但其可以使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白链的合成接头连接，其中vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等(1988)science 242:423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链ch2恒定区，以及(iii)与ch2恒定区融合的免疫球蛋白重链ch3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在us 2003/0118592和us 2003/0133939中进一步公开。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对用途对片段进行筛选。
[0334]
术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的任何物质，例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面
上的fc受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的任何物质，例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的fc受体和(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不限于针对肿瘤抗原和其他靶标(例如效应细胞上的fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括多价抗体，例如具有两种不同结合特异性的三价抗体、具有两种或三种不同结合特异性的四价抗体等。术语“双特异性抗体”还包括双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而无法使同一条链上的两个结构域之间进行配对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并且形成两个抗原结合位点(参见例如，holliger,p.等(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448；poljak,r.j.等(1994)structure 2:1121-1123)。
[0335]
抗体可以与治疗性部分或药剂(例如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性同位素)缀合。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害并且特别地杀伤细胞的任何药剂。一些实例包括美登素类(例如美登素(mertansine)、ravtansine或emtanside)、奥瑞他汀类(单甲基奥瑞他汀f(mmaf)、单乙基奥瑞他汀e(mmae))、多拉司他汀(dolastatin)、加利车霉素(例如奥佐米星(ozogamicin))、吡咯并苯二氮杂二聚体(例如特司林(tesirine)、tairine)、倍癌霉素类(例如倍癌霉素sa、cc-1065、duocarmazine)和α-鹅膏蕈素、伊立替康或其衍生物sn-38、紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素(anthracin)二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同源物、抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司丁(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(amc))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在又一个实施方案中，治疗剂是gm-csf。在一个优选实施方案中，治疗剂是多柔比星、顺铂、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒蛋白a。
[0336]
抗体还可以与放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)缀合以产生细胞毒性放射性药物。
[0337]
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物应答，并且药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括例如具有酶活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白a、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者，生物应答调节剂，例如，如淋巴因子、白介素-1(“il-1”)、白介素-2(“il-2”)、白介素-6(“il-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他生长因子。
[0338]
用于将这样的治疗性部分与抗体缀合的技术是公知的，参见例如，arnon等,“monoclonal antibodies for immunotargeting of drugs in cancer therapy”,在monoclonal antibodies and cancer therapy中,reisfeld等.(编辑),pp.243-56(alan r.liss,inc.1985)；hellstrom等,“antibodies for drug delivery”,在controlled drug delivery(第2版)中,robinson等(编辑),pp.623-53(marcel dekker,inc.1987)；thorpe,“antibody carriers of cytotoxic agents in cancer therapy:a review”,在monoclonal antibodies'84:biological and clinical applications中,pinchera等(编辑),pp.475-506(1985)；“analysis,results,and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy”,在monoclonal antibodies for cancer detection and therapy中,baldwin等(编辑),pp.303-16(academic press 1985)；以及thorpe等,“the preparation and cytotoxic properties of antibody-toxin conjugates”,immunol.rev.,62:119-58(1982)。
[0339]
如本文中所用，如果抗体是通过对动物进行免疫接种或通过筛选免疫球蛋白基因文库从系统获得的，则抗体“来源于”特定种系序列，并且其中所选抗体的氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常来说，来源于特定种系序列的抗体将显示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异，更优选地，不超过5个，或甚至更优选地，不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异。
[0340]
如本文中所用，术语“异抗体”是指连接在一起的两个或更多个抗体、其衍生物或抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的fc受体的结合特异性，以及对靶细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原或表位的结合特异性。
[0341]
本文中所述的抗体可以是单克隆抗体。如本文中所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体显示单一的结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，杂交瘤包括与永生化细胞融合的从非人动物(例如，小鼠)中获得的b细胞。
[0342]
本文中所述的抗体可以是重组抗体。如本文中所用，术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的、组合的抗体文库分离的抗体，以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
[0343]
本文中所述的抗体可以来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
[0344]
本文中所述的抗体包括多克隆和单克隆抗体，并且包括iga，例如iga1或iga2、igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igm和igd抗体。在多个实施方案中，抗体是igg1抗体，更具体地，igg1，κ或igg1，λ同种型(即igg1，κ、λ)、igg2a抗体(例如igg2a，κ、λ)、igg2b抗体(例如igg2b，κ、λ)、igg3抗体(例如igg3，κ、λ)或igg4抗体(例如igg4，κ、λ)。
[0345]
如本文中所用，术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如cho细胞、ns/0细胞、hek293细胞、hek293t细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
[0346]
如本文中所用，“异源抗体”相对于产生这样的抗体的转基因生物体进行定义。该术语是指这样的抗体，其具有对应于不由所述转基因生物体组成的生物体中可见的那些的
氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来源于与所述转基因生物体不同的物种。
[0347]
如本文中所用，“异源杂合抗体”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异源杂合抗体。
[0348]
本发明包括如本文中所述的所有抗体和抗体衍生物，出于本发明的目的，术语“抗体”涵盖了这些抗体和抗体衍生物。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何经修饰形式，例如，抗体与其他药剂或抗体的缀合物，或抗体片段。
[0349]
本文中所述的抗体优选是分离的。如本文中所用，“分离的抗体”旨在还包括基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与肿瘤抗原特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合肿瘤抗原以外的抗原的抗体)。然而，与人肿瘤抗原的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原，例如来自其他物种(例如，肿瘤抗原的物种同源物)的相关抗原具有交叉反应性。
[0350]
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
[0351]
根据本发明，如果在标准测定中抗体对预定靶标具有显著亲和力并且与所述预定靶标结合，则其能够与所述预定靶标结合。通常通过平衡解离常数(kd)测量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著亲和力”是指以10-5
m或更低、10-6
m或更低、10-7
m或更低、10-8
m或更低、10-9
m或更低、10-10
m或更低、10-11
m或更低、或者10-12
m或更低的解离常数(kd)与预定靶标结合。
[0352]
如果在标准测定中抗体对靶标不具有显著亲和力并且不与所述靶标显著地结合，特别是不与之可检出地结合，则所述抗体(基本上)不能与所述靶标结合。优选地，如果抗体以高至2μg/ml、优选10μg/ml、更优选20μg/ml、特别是50μg/ml或100μg/ml或更高的浓度存在，则其不能与所述靶标可检出地结合。优选地，如果抗体与靶标以为与预定靶标(所述抗体能够与其结合)结合之kd的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍高的kd结合，则所述抗体对所述靶标不具有显著亲和力。例如，如果抗体与所述抗体能够结合的靶标结合的kd为10-7
m，则与所述抗体对其无显著亲和力的靶标结合的kd将为至少10-6
m、10-5
m、10-4
m、10-3
m、10-2
m或10-1
m。
[0353]
如果在标准测定中抗体能够与预定靶标结合同时其不能与其他靶标结合，即对其他靶标不具有显著亲和力并且不与其他靶标显著结合，则所述抗体对所述预定靶标具有特异性。根据本发明，如果抗体能够与肿瘤抗原结合，但(基本上)不能与其他靶标结合，则所述抗体对该肿瘤抗原具有特异性。优选地，如果对这样的其他靶标的亲和力和结合没有显著超过与肿瘤抗原不相关蛋白(例如牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、人血清白蛋白(hsa)或非肿瘤抗原跨膜蛋白例如mhc分子或转铁蛋白受体或任何其他指定的多肽)的亲和力或结合，则所述抗体对肿瘤抗原具有特异性。优选地，如果抗体与预定靶标以为与非特异性靶标结合之kd的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍低的kd结合，则所述抗体对所述靶标具有特异性。例如，如果抗体与其特异性靶标结合的kd为10-7
m，则抗体与其非特异性靶标结合的kd将为至少10-6
m、10-5
m、10-4
m、10-3
m、10-2
m或10-1
m。
[0354]
可以使用任何合适的方法实验性测定抗体与靶标的结合；参见例如berzofsky等,“antibody-antigen interactions”在fundamental immunology中,paul,w.e.,编辑,raven press new york,n y(1984),kuby,janis immunology,w.h.freeman and company new york,n y(1992)和本文中描述的方法。可以使用常规技术容易地测定亲和力，例如，通
过平衡透析；通过使用biacore 2000仪器，使用制造商所描述的通用方法；通过使用放射标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。例如，可以通过scatchard等,ann n.y.acad.scl,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件(例如，盐浓度、ph)下测量，则所测量的具体抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其他抗原-结合参数(例如，kd、ic
50
)的测量优选地用抗体与抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液进行。
[0355]
如本文中所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，igm或igg1)。
[0356]
如本文中所用，术语“同种型转换(isotype switching)”是指抗体的类别或同种型从一个ig类别变成其他ig类别之一的现象。
[0357]
如本文中所用，术语“重排”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中v区段在编码基本完整vh或vl结构域的构象中分别位于紧邻d-j或j区段。重排的免疫球蛋白(抗体)基因座可以通过与种系dna进行比较来鉴定；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
[0358]
提及v区段时，如本文中所用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中v区段未重组从而未与d或j区段紧邻的构型。
[0359]
根据本发明，抗肿瘤抗原抗体是能够与肿瘤抗原中存在的表位(优选位于肿瘤抗原胞外结构域内的表位)结合的抗体。根据本发明，抗肿瘤抗原抗体优选为对肿瘤抗原具有特异性的抗体。优选地，抗肿瘤抗原抗体是与细胞表面上表达的肿瘤抗原结合的抗体。在一些具体优选实施方案中，抗肿瘤抗原抗体与存在于活细胞表面上的肿瘤抗原的天然表位结合。优选地，抗体与癌细胞结合，并且基本上不与非癌细胞结合。优选地，抗肿瘤抗原抗体与表达肿瘤抗原的细胞的结合诱导或介导对表达肿瘤抗原的细胞的杀伤。表达肿瘤抗原的细胞优选为癌细胞。优选地，抗体通过诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)介导的裂解、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)介导的裂解、补体依赖性细胞毒性(cdc)介导的裂解、凋亡和抑制表达肿瘤抗原之细胞增殖中的一种或更多种来诱导或介导细胞杀伤。
[0360]
在一些优选实施方案中，本文中所述的抗体可以通过以下特性中的一种或更多种表征：
[0361]
a)对肿瘤抗原的特异性；
[0362]
b)对肿瘤抗原的为约100nm或更小，优选地，约5nm至10nm或更小，更优选地，约1nm至3nm或更小的结合亲和力；
[0363]
c)在肿瘤抗原阳性细胞上诱导或介导adcc的能力；
[0364]
d)在肿瘤抗原阳性细胞上诱导或介导adcp的能力；
[0365]
e)在肿瘤抗原阳性细胞上诱导或介导cdc的能力；
[0366]
f)抑制肿瘤抗原阳性细胞生长的能力；
[0367]
g)诱导肿瘤抗原阳性细胞凋亡的能力。
[0368]
本文中所述的抗体优选地与免疫系统的组分相互作用，优选地通过adcc、adcp或cdc。本文中所述的抗体还可用于靶向负荷(例如，放射性同位素、药物或毒素)以直接杀伤肿瘤细胞，或者可与传统化学治疗剂一起使用，通过互补作用机制攻击肿瘤，所述互补作用机制可包括由于化学治疗剂对t淋巴细胞的细胞毒性副作用而已经受到损害的抗肿瘤免疫
应答。然而，本文中所述的抗体也可以简单地通过与细胞表面上的肿瘤抗原结合来发挥作用，因此，例如阻断细胞增殖。
[0369]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
[0370]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，其特征在于释放细胞毒性颗粒的内容物或表达细胞死亡诱导分子。adcc独立于免疫补体系统，免疫补体系统也裂解靶标，但不需要任何其他细胞。adcc是通过靶标结合抗体(属于igg或iga或ige类)与某些fc受体(fcr)的相互作用触发的，fcr是存在于效应细胞表面上的与免疫球蛋白(ig)的fc区结合的糖蛋白。介导adcc的效应细胞包括自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞。adcc是一种快速效应机制，其功效取决于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和fcr结合亲和力)。涉及人igg1(治疗性抗体最常用的igg亚类)的adcc高度依赖于其fc部分的糖基化谱和fcγ受体的多态性。
[0371]
抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)
[0372]
adcp是许多抗体治疗的一种重要作用机制。它被定义为这样的高度调节的过程，通过该过程，抗体通过将其fc结构域与吞噬细胞上的特定受体连接并引发吞噬作用来消除结合的靶标。与adcc不同，adcp可以由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞通过fcγriia、fcγri和fcγriiia介导，其中巨噬细胞上的fcγriia(cd32a)代表主要途径。
[0373]
补体依赖性细胞毒性(cdc)
[0374]
cdc是可通过抗体指引的另一种细胞杀伤方法。igm是用于补体活化的最有效同种型。igg1和igg3在通过经典补体活化途径指引cdc方面也都非常有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合体的形成导致紧邻参与的抗体分子(例如，igg分子)的ch2结构域的多个c1q结合位点暴露出来(c1q是补体c1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的c1q结合位点将先前的低亲和力c1q-igg相互作用转变为一种高亲合力相互作用，这触发了涉及一系列其他补体蛋白的级联事件并且导致效应细胞趋化剂/活化剂c3a和c5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合体，其在细胞膜中产生孔，这有利于水和溶质自由地进入和离
[0375]
本文中所述的抗体可以通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体法，例如，kohler and milstein,nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方案，但是也可以采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，b淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
[0376]
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统为鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是已经非常成熟的方案。免疫接种方案和分离用于融合的经免疫接种脾细胞的技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。
[0377]
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一些优选动物系统为大鼠系统和兔系统(例如，描述于spieker-polet等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:9348(1995)，还参见rossi等,am.j.clin.pathol.124:295(2005))。
[0378]
在又一个优选实施方案中，可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括分别称为humab小鼠和km小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。可以按照wo2004 035607中对cd20
的详细描述在这样的转基因小鼠中进行人抗体的产生。
[0379]
用于产生单克隆抗体的又一策略为直接从产生具有确定特异性之抗体的淋巴细胞中分离编码抗体的基因，例如，参见babcock等,1996；a novel strategy for generating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities。重组抗体工程的细节还参见welschof and kraus,recombinant antibodes for cancer therapy isbn-0-89603-918-8and benny k.c.lo antibody engineering isbn 1-58829-092-1。
[0380]
为了产生抗体，如所述，可以利用来源于抗原序列(即，抗体待针对的序列)的载体缀合肽、重组表达的抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞来免疫接种小鼠。或者，可以利用编码抗原或其片段的dna来免疫接种小鼠。在使用抗原的纯化制备物或富集制备物的免疫接种不产生抗体的情况下，还可以用表达抗原的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠来促进免疫应答。
[0381]
可以用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品在免疫接种方案的进程中监测免疫应答。可以使用具有足够效价的免疫球蛋白的小鼠来进行融合。可以在处死并移出脾之前3天，利用抗原表达细胞腹膜内或静脉内对小鼠进行加强免疫以提高分泌特异性抗体之杂交瘤的比例。
[0382]
为了产生生产单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫接种小鼠中分离脾细胞和淋巴结细胞，并将其与合适的永生化细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后，可以针对抗原特异性抗体的产生来筛选所得的杂交瘤。然后可以通过elisa对单个孔筛选分泌抗体的杂交瘤。使用抗原表达细胞通过免疫荧光和facs分析，可以鉴定对抗原具有特异性的抗体。可以将分泌抗体的杂交瘤重新平板接种(replate)，再次筛选，并且如果单克隆抗体仍为阳性的，则可以通过有限稀释进行亚克隆。然后，可以在组织培养基中体外培养稳定的亚克隆以产生抗体用于表征。
[0383]
还可以使用例如本领域中公知的重组dna技术与基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生抗体(morrison,s.(1985)science 229:1202)。
[0384]
例如，在一个实施方案中，可以将目的基因(例如，抗体基因)连接到表达载体(例如，真核表达质粒)中，例如wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338 841中公开的gs基因表达系统或本领域中公知的其他表达系统使用的。可以将具有所克隆抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞中，例如cho细胞、ns/0细胞、hek293t细胞或hek293细胞或者替代地其他真核细胞(例如，来自植物的细胞、真菌或酵母细胞)中。用于引入这些基因的方法可以是本领域中所述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以对表达抗体的细胞进行鉴定和选择。这些细胞代表此后可扩大其表达水平并扩大规模以生产抗体的转染瘤。可以从这些培养上清液和/或细胞中分离并纯化出重组抗体。
[0385]
或者，克隆的抗体基因可以在其他表达系统中表达，包括原核细胞，例如微生物，例如大肠杆菌(e.coli)。此外，抗体可以在转基因非人动物中产生，例如在绵羊和兔的乳中或在鸡的卵中产生，或者在转基因植物中产生；参见例如，verma,r.等(1998)j.immunol.meth.216:165-181；pollock等(1999)j.immunol.meth.231:147-157；以及fischer,r.等(1999)biol.chem.380:825-839。
[0386]
嵌合
[0387]
当用毒素或放射性同位素标记时，鼠单克隆抗体可用作人的治疗性抗体。未标记的鼠抗体在人中具有高免疫原性，在重复应用时导致治疗效应降低。主要的免疫原性由重链恒定区介导。如果对各个抗体进行嵌合或人源化，则鼠抗体在人中的免疫原性可被降低或完全避免。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的抗体，例如具有来源于鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。通过将鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接来实现抗体的嵌合(例如，如kraus等,在methods in molecular biology series,recombinant antibodies for cancer therapy isbn-0-89603-918-8中所述)。在一个优选实施方案中，通过将人κ-轻链恒定区连接至鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。在另一个优选实施方案中，可以通过将人λ-轻链恒定区连接至鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。用于产生嵌合抗体的优选重链恒定区为igg1、igg3和igg4。用于产生嵌合抗体的另一些优选重链恒定区为igg2、iga、igd和igm。
[0388]
人源化
[0389]
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，在各抗体之间，cdr内的氨基酸序列比cdr外的序列更多样。由于cdr序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体之特性的重组抗体，所述表达载体包含来自所述特定天然存在的抗体的cdr序列，其接枝到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上(参见例如，riechmann,l.等(1998)nature 332:323-327；jones,p.等(1986)nature 321:522-525；以及queen,c.等(1989)proc.natl.acad.sci.u.s.a.86:10029-10033)。这样的框架序列可获取自包括种系抗体基因序列的公共dna数据库。这些种系序列将不同于成熟的抗体基因序列，因为它们将不包含完整组装的可变基因，其是在b细胞成熟期间通过v(d)j连接而形成的。种系基因序列还将在均匀分布可变区的个别处不同于高亲和力二级抗体库(secondary repertoire antibody)的序列。
[0390]
可以使用标准结合测定(例如，elisa、western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)来确定抗体结合抗原的能力。
[0391]
为了纯化抗体，选择的杂交瘤可以在2升旋转烧瓶中培养以进行单克隆抗体纯化。或者，可以在基于透析的生物反应器中产生抗体。可以过滤上清液，并且如果必要的话，在用蛋白g-sepharose或蛋白a-sepharose进行亲和色谱之前浓缩。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的igg以确保纯度。可以将缓冲溶液更换为pbs，并且可以使用1.43消光系数通过od280确定浓度。可以将单克隆抗体等分并储存在-80℃。
[0392]
为了确定所选的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用位点定向诱变或多位点定向诱变。
[0393]
为了确定抗体的同种型，可以使用多种市售试剂盒(例如，zymed，roche diagnostics)进行同种型elisa。可以用抗小鼠ig包被微量滴定板的孔。封闭之后，使所述板与单克隆抗体或纯化的同种型对照于环境温度下反应两小时。然后，可以使孔与小鼠igg1、igg2a、igg2b或igg3、iga或小鼠igm特异性过氧化物酶缀合探针反应。在洗涤之后，可以将所述板用abts底物(1mg/ml)显影，并于od 405至650下进行分析。或者，可以使用isostrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(roche，货号1493027)如制造商描述进行。
[0394]
为了证明经免疫接种小鼠血清中抗体的存在或单克隆抗体与表达抗原的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。可以将天然或转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照(在标准生长条件下培养)与杂交瘤上清液中或含有1％fbs的pbs中之不同浓度的单克隆抗体混合，并可以于4℃下孵育30分钟。在洗涤之后，apc标记或alexa647标记的抗igg抗体可以与一抗染色在相同条件下与抗原结合的单克隆抗体结合。通过流式细胞术，用facs仪器利用光散射和侧向散射特性对单活细胞设门来分析样品。为了在单测量中区分抗原特异性单克隆抗体和非特异性结合剂，可以采用共转染方法。可以如上所述对用编码抗原和荧光标志物的质粒瞬时转染的细胞进行染色。可以在与抗体染色细胞不同的荧光通道中检测到经转染的细胞。由于大多数经转染的细胞表达两种转基因，因此抗原特异性单克隆抗体优先与表达荧光标志物的细胞结合，而非特异性抗体以相当的比例与未转染的细胞结合。可以利用使用荧光显微术的替代测定来补充或替代流式细胞术测定。可以完全如上所述对细胞进行染色并通过荧光显微术进行检查。
[0395]
为了证明经免疫接种小鼠血清中抗体的存在或单克隆抗体与表达抗原的活细胞的结合，可以使用免疫荧光显微术分析。例如，将自发或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照于标准培养条件下在腔室载片(chamber slide)中在补充有10％胎牛血清(fetal calf serum，fcs)、2mm l-谷氨酰胺、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养基中培养。然后可以用甲醇或多聚甲醛固定细胞或者不予处理。然后，可以使细胞与针对抗原的单克隆抗体于25℃下反应30分钟。在洗涤之后，可以使细胞与alexa555标记的抗小鼠igg二抗(molecular probes)于相同条件下反应。然后，可以通过荧光显微术检查细胞。
[0396]
可以制备来自表达抗原之细胞的细胞提取物和适当的阴性对照，并进行十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，sds)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，分开的抗原将被转移至硝酸纤维素膜，封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗小鼠igg过氧化物酶检测igg结合并用ecl底物进行显影。
[0397]
还可以按照技术人员公知的方式，通过免疫组织化学来测试抗体与抗原的反应性，例如使用多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或用多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片，其来自于常规手术过程期间从患者获取或获自携带接种有自发或在转染后表达抗原之细胞系的异种移植肿瘤的小鼠的非癌组织或癌组织样品。对于免疫染色，可以根据供应商的说明孵育与抗原反应的抗体，然后孵育辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(dako)。
[0398]
可以测试抗体介导吞噬作用和杀伤表达肿瘤抗原的细胞的能力。体外单克隆抗体活性的测试将在测试体内模型之前提供初步筛选。
[0399]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)：
[0400]
简言之，来自健康供体的多形核细胞(pmn)、nk细胞、单核细胞、单个核细胞或其他效应细胞可以通过ficoll hypaque密度离心然后裂解污染的红细胞来纯化。可以将经洗涤的效应细胞悬浮于补充有10％热灭活的胎牛血清或作为替代地5％热灭活的人血清的rpmi中，并以不同的效应细胞:靶细胞的比与
51
cr标记的表达肿瘤抗原的靶细胞混合。或者，可以用荧光增强配体(batda)标记靶细胞。可以用荧光计测量从死细胞中释放的铕与增强配体的高荧光螯合物。另一种替代技术可以利用用萤光素酶进行靶细胞的转染。然后，添加的萤
光黄仅可以被活细胞氧化。然后，可以以不同浓度添加经纯化的抗肿瘤抗原igg。不相关的人igg可用作阴性对照。根据使用的效应细胞类型，测定可以在37℃下进行4小时至20小时。可以通过测量培养上清液中
51
cr的释放或eutda螯合物的存在来测定样品的细胞溶解。或者，由萤光黄氧化产生的发光可作为活细胞的量度。还可以在多种组合中测试抗肿瘤抗原单克隆抗体，以确定使用多种单克隆抗体是否增强细胞溶解。
[0401]
抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)：
[0402]
简言之，经典的adcp测定形式基于使用外周血单个核细胞(pbmc)衍生的巨噬细胞作为效应细胞。在提取新鲜的人pbmc之后，可以将单核细胞分离并在培养物中分化为巨噬细胞。吞噬作用事件可以使用facs筛选进行分析，并且可以生成剂量依赖性曲线以详细评估adcp效力。由于mhc的限制，无法合并来自不同供体的效应细胞。因此，必须应用来自一系列供体的样品以降低供体特异性变异。
[0403]
补体依赖性细胞毒性(cdc)：
[0404]
可以使用多种已知的技术来测试单克隆抗肿瘤抗原抗体介导cdc的能力。例如，可以以技术人员已知的方式从血液中获得补体血清。为了确定mab的cdc活性，可以使用不同的方法。例如，可以测量
51
cr的释放或可以使用碘化丙啶(pi)排阻测定来评价提高的膜渗透性。简言之，可以洗涤靶细胞，并且可以在室温或37℃下将5
×
105/ml与不同浓度的mab孵育10分钟至30分钟。然后可以添加血清或血浆至终浓度为20％(v/v)，并将细胞在37℃下孵育20分钟至30分钟。可以将来自每个样品的所有细胞都添加至facs管中的pi溶液中。然后可以立即使用facsarray通过流式细胞术分析来分析该混合物。
[0405]
在一种替代测定中，可以根据贴壁细胞确定cdc的诱导。在该测定的一个实施方案中，在测定之前24小时，以3
×
104/孔的密度将细胞接种于组织培养平底微量滴定板中。第二天，移除生长培养基并将细胞与抗体一式三份地孵育。将对照细胞分别与生长培养基或含有0.2％皂苷的生长培养基一起孵育以确定背景裂解和最大裂解。在室温下孵育20分钟之后，移除上清液，并将dmem中20％(v/v)人血浆或血清(预热至37℃)添加至细胞，并在37℃下另外孵育20分钟。将来自每个样品的所有细胞都添加至碘化丙啶溶液(10μg/ml)。然后，用含有2.5μg/ml溴化乙锭的pbs替换上清液，并使用tecan safire在600nm处测量在520nm处激发之后的荧光发射。如下计算特异性裂解百分比：％特异性裂解＝(样品荧光-背景荧光)/(最大裂解荧光-背景荧光)
×
100。
[0406]
通过单克隆抗体诱导凋亡和抑制细胞增殖：
[0407]
为了测试引发凋亡的能力，可以将单克隆抗肿瘤抗原抗体例如与肿瘤抗原阳性肿瘤细胞或转染了肿瘤抗原的肿瘤细胞于37℃下孵育约20小时。可以收获细胞，在膜联蛋白-v结合缓冲液(bd biosciences)中洗涤，并与和fitc或apc缀合的膜联蛋白v(bd biosciences)在黑暗中孵育15分钟。可以将来自每个样品的所有细胞添加至facs管中的pi溶液(10μg/ml于pbs中)，并立即通过流式细胞术进行评价(如上)。或者，可以用市售试剂盒来检测单克隆抗体对细胞增殖的一般抑制。delfia细胞增殖试剂盒(perkin-elmer，货号ad0200)是基于在微板中测量在增殖细胞的dna合成期间5-溴-2
’‑
脱氧尿苷(brdu)并入的非同位素免疫测定。使用铕标记的单克隆抗体来检测并入的brdu。为了进行抗体检测，使用固定溶液固定细胞并使dna变性。洗去未结合的抗体，并添加delfia诱导剂以从标记的抗体中解离铕离子至溶液中，其中它们与delfia诱导剂的组分形成强荧光螯合物。在检测中利
用时间分辨荧光术测量的荧光与每个孔的细胞中dna合成成比例。
[0408]
临床前研究
[0409]
与肿瘤抗原结合的单克隆抗体也可以在体内模型中(例如在接种有表达或者在转染之后(例如hek293)表达肿瘤抗原的细胞系的携带异种移植肿瘤的免疫缺陷小鼠中)测试，以确定其在控制肿瘤抗原表达肿瘤细胞的生长中的效力。
[0410]
在将肿瘤抗原表达肿瘤细胞异种移植到免疫受损小鼠或其他动物中之后的体内研究可以使用本文中所述的抗体进行。可以将抗体施用于无肿瘤小鼠，然后注射肿瘤细胞以测量抗体阻止肿瘤形成或肿瘤相关症状的作用。可以将抗体施用于荷瘤小鼠，以确定相应抗体对降低肿瘤生长、转移或肿瘤相关症状的治疗效力。抗体应用可以与其他物质如免疫检查点抑制剂、细胞抑制药物、生长因子抑制剂、细胞周期阻断剂、血管生成抑制剂或其他抗体的应用组合，以确定组合的效力和潜在毒性。为了分析抗体介导的毒副作用，可以用抗体或对照试剂接种动物，并彻底研究可能与肿瘤抗原-抗体治疗相关的症状。体内应用肿瘤抗原抗体的可能副作用特别地包括对肿瘤抗原表达组织(包括胃)的毒性。在人和其他物种(例如小鼠)中识别肿瘤抗原的抗体对于预测由在人中应用单克隆肿瘤抗原-抗体介导的潜在副作用是特别有用的。
[0411]
对抗体所识别的表位进行的作图可以按照glenn e.morris的“epitope mapping protocols(methods in molecular biology)”isbn-089603-375-9中和olwyn m.r.westwood,frank c.hay的“epitope mapping:a practical approach”practical approach series,248中的详细描述进行。
[0412]
如本文中所用，“肿瘤抗原”或“癌抗原”包括(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)肿瘤上的胚胎抗原，(iv)肿瘤特异性膜抗原，(v)肿瘤相关膜抗原，(vi)生长因子受体，和(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或物质。
[0413]
可根据本发明使用的治疗性抗体包括但不限于被批准用于临床试验或用于临床用途的开发的任何本领域公认的抗癌抗体。在某些实施方案中，多于一种抗癌抗体可以包括在本发明的联合治疗中。
[0414]
例如，以下肿瘤抗原可以被本文中公开的治疗性抗体靶向。
[0415]
肿瘤抗原可以是上皮癌抗原(例如，乳腺、胃肠、肺)、前列腺特异性癌抗原(psa)或前列腺特异性膜抗原(psma)、膀胱癌抗原、肺(例如，小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食管癌抗原、头颈癌抗原或结直肠癌抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原是淋巴瘤抗原(例如，非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)、b细胞淋巴瘤癌抗原、白血病抗原、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性淋巴细胞白血病抗原、慢性粒细胞白血病抗原或急性粒细胞白血病抗原。应当理解，所描述的肿瘤抗原仅仅是示例性的，并且任何肿瘤抗原都可以根据本发明进行靶向。
[0416]
肿瘤抗原是本领域中公知的，并且包括本文中描述的那些。肿瘤抗原可以为例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-ca ix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，psa)、pap、ny-eso-1、lage-1a、p53、酪氨酸酶、
prostein、psma、ras、her2/neu、trp-1、trp-2、tag-72、ksa、ca-125、psa、brci、brc-ii、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-l、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1，pcta-1)、mage、gage、gp-100、muc-1、muc-2、elf2m、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(insulin growth factor，igf)-i、igf-ii、igf-i受体、vegf、密蛋白分子如密蛋白18同种型2和密蛋白6、以及间皮素。
[0417]
肿瘤抗原可以是独特的抗原(通常由突变引起)(例如，p53、ras、β-联蛋白、cdk4、cdc27、α辅肌动蛋白-4)、分化抗原(例如，酪氨酸酶、trp1/gp75、trp2、gp100、melan-a/mart1、神经节苷脂、psma)、过表达的抗原(例如，her2、wt1、epha3、egfr、cd20)、癌-睾丸抗原(例如，mage、bage、gage、ny-eso-1)或通用抗原(例如，端粒酶、存活素)。
[0418]
肿瘤抗原还可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，tsa)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，taa)。tsa是肿瘤细胞独有的，并且不在体内的其他细胞上出现。taa不是肿瘤细胞独有的，并且相反地在无法诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。taa可以是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统是未成熟的并且不能作出应答，或者taa可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
[0419]
抗癌抗体的非限制性实例包括但不限于以下：
[0420]
曲妥珠单抗(herceptin
tm
；靶标：her2/neu)，其用于治疗her-2/neu阳性乳腺癌或转移性乳腺癌；
[0421]
贝伐单抗(avastin
tm
；靶标：vegf-a)，其用于治疗结直肠癌、转移性结直肠癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、非小细胞肺癌或肾细胞癌；
[0422]
利妥昔单抗(rituxan
tm
；靶标：cd20)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病；
[0423]
帕妥珠单抗(omnitarg
tm
；靶标：her2/neu)，其用于治疗乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌或卵巢癌；
[0424]
西妥昔单抗(erbitux
tm
；靶标：egfr)，其可用于治疗结直肠癌、转移性结直肠癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、食管癌、肾细胞癌、前列腺癌、宫颈癌或膀胱癌；
[0425]
托西莫单抗(bexxar
tm
；靶标：cd20)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤和滤泡性、非霍奇金淋巴瘤；
[0426]
奥法木单抗(arzerra
tm
；靶标：cd20)，用于慢性淋巴细胞白血病；
[0427]
帕尼单抗(vectibix
tm
；靶标：egfr)，用于结直肠癌；
[0428]
阿仑单抗(campath
tm
；靶标：cd52)，用于慢性淋巴细胞白血病；奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(gazyva
tm
；靶标：cd20)，用于慢性淋巴白血病；
[0429]
化学治疗
[0430]
除了包含il2或其功能性变体的多肽或者编码包含il2或其功能性变体的多肽的多核苷酸；以及针对癌症的基于抗体的免疫治疗之外，还可以对患者施用另外的治疗。这样的另外的治疗包括经典癌症治疗，例如放射治疗、手术、热疗和/或化学治疗。
[0431]
化学治疗是使用通常作为标准化化学治疗方案的一部分的一种或更多种抗癌药
物(化学治疗剂)的一类癌症治疗。术语化学治疗意味着非特异性使用胞内毒物来抑制有丝分裂。该含义不包括阻断胞外信号(信号转导)的更具选择性药剂。用抑制来自经典内分泌激素(主要是针对乳腺癌的雌激素和针对前列腺癌的雄激素)的促生长信号的特异性分子或遗传靶标进行治疗的开发现在被称为激素治疗。相比之下，其他对生长信号的抑制(例如与受体酪氨酸激酶相关的那些)被称为靶向治疗。
[0432]
重要的是，药物的使用(无论是化学治疗、激素治疗还是靶向治疗)构成针对癌症的全身治疗，这在于它们被引入血流中，因此原则上能够治疗体内任何解剖位置处的癌症。全身治疗通常与构成癌症局部治疗的其他方式((即效力限于应用它们的解剖区域的治疗)例如放射治疗、手术或热疗)联合使用。
[0433]
传统的化学治疗剂通过干扰细胞分裂(有丝分裂)而具有细胞毒性，但癌细胞对这些药剂的敏感性差别很大。在很大程度上，化学治疗可以被认为是一种损伤或应激细胞的方式，其随后如果启动细胞凋亡的话可导致细胞死亡。
[0434]
化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。
[0435]
烷化剂具有使许多分子(包括蛋白质、rna和dna)烷化的能力。烷化剂的亚型是氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂及衍生物，以及非经典烷化剂。氮芥包括二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安。亚硝基脲包括n-亚硝基-n-甲基脲(mnu)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)和司莫司汀(meccnu)、氟莫司汀和链脲菌素。四嗪包括达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。氮丙啶包括噻替哌、丝裂霉素(mytomycin)和地吖醌(azq)。顺铂及衍生物包括顺铂、卡铂和奥沙利铂。它们通过与生物上重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键来损害细胞功能。非经典烷化剂包括丙卡巴肼和六甲基三聚氰胺。在一个特别优选的实施方案中，烷化剂是环磷酰胺。
[0436]
抗代谢物是一组阻碍dna和rna合成的分子。它们中的许多具有与dna和rna的结构单元相似的结构。抗代谢物类似于核碱基或核苷，但具有改变的化学基团。这些药物通过阻断dna合成所需的酶或并入到dna或rna中而发挥其作用。抗代谢物的亚型是抗叶酸、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫嘌呤。抗叶酸包括甲氨蝶呤和培美曲塞。氟嘧啶包括氟尿嘧啶和卡培他滨。脱氧核苷类似物包括阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他丁。硫嘌呤包括硫鸟嘌呤和巯基嘌呤。
[0437]
抗微管剂通过阻止微管功能来阻断细胞分裂。长春花生物碱阻止微管的形成，而紫杉烷类阻止微管分解。长春花生物碱包括长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁。紫杉烷类包括多西他赛(泰索帝(taxotere))和紫杉醇(taxol)。
[0438]
拓扑异构酶抑制剂是影响拓扑异构酶i和拓扑异构酶ii两种酶的活性的药物，并且包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、美巴龙和阿柔比星。
[0439]
细胞毒性抗生素是一组具有不同作用机制的不同药物。它们在其化学治疗适应症中共享的共同主题是它们会中断细胞分裂。最重要的亚组是蒽环类(例如，多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星和阿柔比星)和博来霉素；其他突出的实例包括丝裂霉素c、米托蒽醌和放线菌素。
[0440]
免疫检查点抑制剂
[0441]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与本文中所述的其他治疗剂组合使用。
[0442]
如本文中所用，“免疫检查点”是指调节免疫细胞活性例如nk细胞活性的幅度和品质的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是pd-1与pd-l1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用以取代cd28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是lag3与mhc ii类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是tim3与半乳糖凝集素9之间的相互作用。
[0443]
如本文中所用，“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或更多种检查点蛋白的分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白之间的相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物，例如，阻止pd-1与pd-l1之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止lag3与其配体之间或tim-3与其配体之间的相互作用的抗体或其片段。检查点抑制剂也可以是分子(或其变体)自身的可溶性形式的形式，例如可溶性pd-l1或pd-l1融合物。
[0444]“程序性死亡-1(programmed death-1，pd-1)”受体是指属于cd28家族的免疫抑制性受体。pd-1主要在体内先前活化的t细胞上表达，并且与两种配体(pd-l1和pd-l2)结合。如本文中所用，术语“pd-1”包含人pd-1(hpd-1)、hpd-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-1具有至少一个共同表位的类似物。
[0445]“程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，pd-l1)”是pd-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一个是pd-l2)，其与pd-1结合时下调t细胞活化和细胞因子分泌。如本文中所用，术语“pd-l1”包含人pd-l1(hpd-l1)、hpd-l1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。
[0446]“细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic t lymphocyte associated antigen-4，ctla-4)”是免疫细胞表面分子并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白质通过与cd80和cd86结合而下调免疫系统。如本文中所用，术语“ctla-4”包含人ctla-4(hctla-4)、hctla-4的变体、同种型和物种同源物，以及与hctla-4具有至少一个共同表位的类似物。
[0447]“淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，lag3)”是通过与mhc ii类分子结合而与免疫细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强treg细胞的功能并抑制cd8

效应t细胞功能。如本文中所用，术语“lag3”包含人lag3(hlag3)、hlag3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0448]“t细胞膜蛋白-3(t cell membrane protein-3，tim3)”是通过抑制th1细胞应答而参与免疫细胞活性的抑制的抑制性受体。其配体是在多种类型的癌症中均被上调的半乳糖凝集素9。如本文中所用，术语“tim3”包含人tim3(htim3)、htim3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0449]“b7家族”是指具有未定义受体的抑制性配体。b7家族涵盖b7-h3和b7-h4，二者在
肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上均上调。
[0450]
在某些实施方案中，适用于本文所公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂，例如靶向例如pd-1、pd-l1、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4或tim3的抗体。这些配体和受体在pardoll,d.,nature.12:252-264,2012中综述。
[0451]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的小分子。
[0452]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是pd-1/pd-l1信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用破坏pd-1受体与其配体pd-l1之间的相互作用的抗体或其抗原结合部分。与pd-1结合并破坏pd-1与其配体pd-l1之间的相互作用的抗体是本领域中已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-l1特异性结合并抑制其与pd-1的相互作用，从而提高免疫活性。
[0453]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是ctla4信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向ctla4并破坏其与cd80和cd86的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0454]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是lag3(淋巴细胞活化基因3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向lag3并破坏其与mhc ii类分子的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0455]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是b7家族信号传导途径的组分。在某些实施方案中，b7家族成员是b7-h3和b7-h4。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向b7-h3或h4的抗体或其抗原结合部分。b7家族没有任何定义的受体，但是这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上均被上调。临床前小鼠模型已示出这些配体的阻断可增强抗肿瘤免疫。
[0456]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是tim3(t细胞膜蛋白3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向tim3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0457]
本领域普通技术人员将理解，其他免疫检查点靶标也可被拮抗剂或抗体靶向，条件是这种靶向导致刺激免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答，如反映在例如，免疫细胞增殖的提高、免疫细胞活化的增强和/或细胞因子(例如，ifn-γ、il2)产生的提高中。
[0458]
rna靶向
[0459]
根据本发明，特别优选的是，本文中所述的肽、蛋白质或多肽，特别是il2多肽和/或抗体，以编码本文中所述的肽、蛋白质或多肽的rna的形式施用。在一个实施方案中，不同的本文中所述的肽、蛋白质或多肽由不同的rna分子编码。
[0460]
在一个实施方案中，rna在递送载剂中配制。在一个实施方案中，递送载剂包含颗粒。在一个实施方案中，递送载剂包含至少一种脂质。在一个实施方案中，所述至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质与rna形成复合体和/或包封rna。在一个实施方案中，脂质包含在包封rna的囊泡中。在一个实施方案中，rna在脂质体中配制。
[0461]
根据本公开内容，在施用本文中所述的rna之后，至少一部分rna被递送至靶细胞。
在一个实施方案中，至少一部分rna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，rna被靶细胞翻译以产生所编码的肽或蛋白质。
[0462]
本公开内容的一些方面涉及靶向递送本文中所公开的rna(例如编码il2多肽的rna、编码抗体的rna)。
[0463]
rna可以通过所谓的脂质复合体制剂递送，其中rna与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质(helper lipid)的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注入到水或合适的水相中而获得。rna脂质复合体颗粒可以通过将脂质体与rna混合来制备。
[0464]
在本公开内容的上下文中，术语“rna脂质复合体颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和rna的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的rna之间的静电相互作用导致rna脂质复合体颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质(例如dotma)和另外的脂质(例如dope)合成。在一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒是纳米粒。
[0465]
如本文中所用，“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用结合带负电荷的rna。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于：1,2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、二甲基双二十八烷基铵(ddab)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(dmrie)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)、1,2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、1,2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(dorie)、和2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)。优选的是dotma、dotap、dodac和dospa。在一些具体实施方案中，阳离子脂质是dotma和/或dotap。
[0466]
可以并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和rna脂质复合体颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。如本文中所用，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是dope、胆固醇和/或dopc。
[0467]
在某些实施方案中，rna脂质复合体颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是dotma，并且另外的脂质是dope。
[0468]
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1、或约1:1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2:1。
[0469]
在一个实施方案中，本文中所述的rna脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约
450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约400nm。
[0470]
本公开内容的rna脂质复合体颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与rna中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的电荷比通过以下等式来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(rna浓度(mol))*(rna中负电荷总数)]。
[0471]
细胞因子，例如pk延长的细胞因子，特别是pk延长的白介素，例如本文中所述的那些，可以通过以下来提供给对象：向对象施用在制剂中的编码细胞因子的rna，用于将rna优先递送至肝或肝组织。优选将rna递送至这样的靶器官或靶组织，特别是如果期望表达大量细胞因子和/或如果期望或需要细胞因子全身性存在，特别是大量存在。
[0472]
rna递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米粒，特别是生物缀合物中的脂质纳米粒，例如脂质体、纳米胶束和亲脂性配体。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
[0473]
为了在体内将rna递送至肝，可以使用药物递送系统通过防止其降解将rna运送到肝中。例如，由聚(乙二醇)(peg)包被的表面和包含mrna的核心组成的复合纳米胶束是有用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供了优异的体内rna稳定性。此外，由密集的peg栅栏构成的复合纳米胶束表面所提供的隐身特性有效地规避了宿主免疫防御。
[0474]
药物组合物
[0475]
本文中所述的药剂可以以药物组合物或药物施用，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
[0476]
在本发明所有方面的一个实施方案中，在一起或彼此分开的本文中所述的组分，例如编码细胞因子(il2)或抗体的核酸，可以以药物组合物施用，该药物组合物可以包含可药用载体且可以任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。在一个实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如用于治疗或预防涉及抗原的疾病，例如癌症疾病，例如本文中所述的那些。
[0477]
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。
[0478]
本公开内容的药物组合物可以包含一种或更多种佐剂或者可以与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的实例包括但不限于：lps、gp96、cpg寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。细胞因子可以是il1、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il12、il18、ifnα、ifnγ、gm-csf、lt-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如isa51。用
于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如pam3cys。
[0479]
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和在“可药用制剂”中施加。
[0480]
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
[0481]
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可以取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效更高的剂量)。
[0482]
本公开内容的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0483]
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
[0484]
如本文中所用，术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
[0485]
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
[0486]
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。如本文中所用，载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
[0487]
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.(a.r gennaro edit.1985)中。
[0488]
可以根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
[0489]
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可以包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。如本文中所用，“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用是通过静脉内
施用。
[0490]
如本文中所用，术语“共施用”意指其中将不同的化合物或组合物(例如，编码il2多肽和抗体的rna)施用于同一患者的过程。不同的化合物或组合物可以同时、基本上同时或依次施用。在一个实施方案中，首先施用il2多肽或编码il2多肽的核酸，然后施用抗体。
[0491]
治疗
[0492]
本文中所述的药剂、组合物和方法可用于治疗患有疾病(例如，以存在表达抗原的病变细胞为特征的疾病)的对象。特别优选的疾病为癌症疾病，特别是其中癌细胞表达肿瘤抗原的癌症疾病。
[0493]
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可以由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可以由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可能改变个体对生活的看法和个体的性格。
[0494]
在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以防止症状或并发症的发生。
[0495]
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发展、在个体中抑制或减缓疾病的发展，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。
[0496]
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
[0497]
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
[0498]
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
[0499]
如本文中所用，“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
[0500]“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或类似术语意在包括针对以表达抗原为特征，特别是以用mhc i类或ii类呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与称为t细胞或t淋巴细胞的细胞有关，这些细胞充当“辅助者”或“杀手”。辅助t细胞(也称为
cd4

t细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞、细胞裂解t细胞、cd8

t细胞或ctl)杀伤病变细胞，例如癌细胞，从而阻止更多病变细胞的产生。
[0501]
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。
[0502]
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
[0503]
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，从而导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里其可以被t细胞识别，并且其可以直接与b细胞表面上的抗体相互作用，从而导致t细胞和b细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
[0504]
术语“树突细胞”(dc)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低t细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦其与可呈递的抗原接触，其就被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，使用mhc分子将这些片段呈递在其细胞表面处。同时，其上调了在t细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如cd80、cd86和cd40，极大地增强了其活化t细胞的能力。其还上调了ccr7，所述ccr7是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此其充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递其抗原来活化辅助t细胞和杀伤t细胞以及b细胞。因此，树突细胞可以主动诱导t细胞或b细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
[0505]
术语“抗原呈递细胞”(apc)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职性抗原呈递细胞和非专职性抗原呈递细胞。
[0506]
术语“专职性抗原呈递细胞”涉及组成型表达与初始t细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体ii类(mhc ii类)分子的抗原呈递细胞。如果t细胞与抗原呈递细胞膜上的mhc ii类分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导t细胞活化的共刺激分子。专职性抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
[0507]
术语“非专职性抗原呈递细胞”涉及不组成型表达mhc ii类分子，但是在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后组成型表达mhc ii类分子的抗原呈递细胞。示例性的非专职性抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
[0508]“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与mhc分子的缔合(例如，通过结合)用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的t细胞。
[0509]
术语“涉及抗原的疾病”是指与抗原相关的任何疾病，例如以抗原的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，
例如肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，涉及抗原的疾病是涉及优选在细胞表面上表达抗原的细胞的疾病。
[0510]
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(hodgkin’s disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，cns)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
[0511]
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
[0512]
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
[0513]
实施例
[0514]
实施例1：mhc i类缺陷型或ifn信号传导缺陷型鼠肿瘤模型的选择和产生
[0515]
我们的第一个目的是分析mhc i类丧失如何影响肿瘤细胞与免疫系统的相互作用。我们假设cd8

t细胞可在这方面起主要作用，因为其对肿瘤细胞的识别严格依赖于mhc i类，并比较了cd8

t细胞在不同鼠肿瘤模型中的浸润。将balb/c小鼠(balb/c jrj，janvier labs)(n＝8)用5
×
105ct26细胞皮下(s.c.)接种，并将c57bl/6小鼠(c57bl/6jolahsd，jackson laboratory)(每个细胞系n＝8)用5
×
105mc38细胞、3
×
105b16f10细胞或1
×
105tc1细胞s.c.接种。肿瘤接种之后20天，通过颈椎脱位处死小鼠并切除肿瘤。使用小鼠肿瘤解离试剂盒(miltenyi biotec，货号130-096-730)根据制造商的说明将肿瘤切成片并进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)染色。使用针对cd45(bd，货号564279)和cd8(bd，货号563046或货号553031)的抗体。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版(treestar)分析所获得的数据。
[0516]
我们观察到在不同肿瘤模型中cd8

t细胞在所有活细胞中的比例不同，并将浸润分类为高(cd8
高
)(对于ct26和mc38)、中等(cd8中)(对于b16f10)和低(cd8
低
)(对于tcl)(图1a)。cd8

t细胞的比例与所有活细胞中总cd45

免疫细胞的比例相关，因为总体上ct26和mc38表现出高免疫细胞浸润，b16f10表现出中等免疫细胞浸润，以及tc1表现出低免疫细胞浸润(图1b)。
[0517]
为了基因敲除肿瘤细胞系中的mhc i类，我们使用可公开获得的工具产生靶向b2m的单指导rna(sgrna)(ct26、b16f10、tc1：catggctcgctcggtgaccc；mc38：
lymph nodes，tdln)的细胞组成中未观察到差异(图9)。在mc38-b2m-/-模型中，我们观察到tdln中cd8

t细胞和treg的量略微提高，以及cdc1和cd11b

dc的数量降低。b16f10-b2m-/-肿瘤在cd8

t细胞、nk细胞和cdc1的浸润方面未显示出差异，但可观察到cd4 th细胞的数量提高，以及巨噬细胞、单核细胞和cd11b

dc的数量降低(图12)。携带b16f10-b2m-/-肿瘤的小鼠的tdln中cdc1数量提高(图13)。tc1-b2m-/-肿瘤在肿瘤和tdln二者的免疫细胞组成方面未显示出可检测的差异(图14和图15)。在不同肿瘤模型中观察到的免疫细胞浸润变化与cd8

t细胞浸润的分类密切相关，其中在cd8
高
肿瘤模型中观察到的差异最大。这表明肿瘤细胞的自发cd8

t细胞识别在很大程度上决定了免疫细胞向tme的吸引。由于在tdln中观察到的变化不与tme相关并且程度小得多，因此mhc i类丧失的影响似乎主要局限于tme。重要的是，在ct26-b2m-/-和mc38-b2m-/-肿瘤中减少的免疫细胞亚群被认为是抗肿瘤免疫所必需的，而被认为是免疫抑制性的亚群不受影响，除了mc38模型中的巨噬细胞之外。这意味着当mhc i类丧失之后，活性的、发炎的tme可以转变为免疫抑制性tme。
[0524]
我们的下一个目的是分析免疫细胞向b2m-/-的tme中的活跃持续性迁移与其相应对照肿瘤相比是否存在差异。我们选择ct26模型进行此表征，因为其表现出最高的cd8

t细胞浸润。如实施例1中所述用正常或衍生的b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(每组和每个时间点n＝5只小鼠)。在不同时间点(接种之后8天、12天、20天和26天)将肿瘤切除并如实施例1中所述进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)染色。使用针对cd45(bd，货号564279)、cd3(biolegend，货号100233)和cd49b(bd，货号553875)的抗体。将细胞转移到绝对计数管中，并在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件版本10(treestar)分析所获得的数据。
[0525]
在肿瘤接种之后第8天，肿瘤浸润cd3

t细胞和nk细胞的数量未显示出差异。然而，随着时间的推移，ct26肿瘤显示出两种细胞类型的浸润提高(图16)。在ct26-b2m-/-肿瘤中，未能观察到这样的提高，表明cd3

t细胞和nk细胞被主动吸引到ct26 tme中，而不是ct26-b2m-/-tme中。这些数据进一步证实，一旦肿瘤细胞丧失mhc i类表达，tme中导致免疫细胞浸润的活跃持续性炎症就会受损。
[0526]
由于所描述的观察结果强调了cd8

t细胞在塑造mhc i类表达肿瘤的tme中的作用，我们分析了cd8

t细胞表达的抗原相遇的标志物。在该实验中，我们包括用于比较的tc1模型作为具有最低cd8

t细胞浸润的模型。如实施例1中所述用正常或衍生的b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(每组n＝8只小鼠)。肿瘤接种之后20天，如实施例1中所述将肿瘤切除并进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)或用可固定黄色死细胞染色剂(life technologies，货号l34967)染色。使用针对cd8(bd，货号563046)、cd11b(bd，货号553310)、cd45(bd，货号564279)、f4/80(bd，货号123146)、mhc ii类(bd，货号742894)、pd-1(ebioscience，货号46-9981-82)和pd-l1(biolegend，货号124333)以及gp70四聚体(mbl，货号mbl-tb-m521-7)的抗体。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0527]
我们将b2m-/-肿瘤的cd8

t细胞表型与相应对照肿瘤进行了比较。gp70是由ct26细
胞表达的病毒cd8

t细胞抗原。cd8

t细胞表现出显著降低的gp70抗原特异性细胞的比例(图17a)。此外，ct26-b2m-/-肿瘤中pd-1

cd8

t细胞的百分比显著降低(图17b)。在tc1-b2m-/-肿瘤中，我们也观察到pd-1

cd8

t细胞的百分比降低(图17c)。在gp70作为抗原特异性的量度并且pd-1作为cd8

t细胞活化和抗原相遇的标志物的情况下，cd8

t细胞表型的差异表明ct26-b2m-/-tme中对抗原的识别减弱。与ct26模型相比，tc1模型的差异幅度较小，表明tc1肿瘤细胞的自发cd8

t细胞识别较少。我们寻找cd8

t细胞在mhc i类正常肿瘤中的抗原识别对位于tme中的其他免疫细胞具有直接影响的证据。对ct26-b2m-/-和ct26肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞(tam)和肿瘤细胞所表达的ifnγ(抗原相遇之后释放的cd8

t细胞的特征细胞因子)诱导型标志物的分析揭示，tam的pd-l1和mhc ii类的表达以及肿瘤细胞的pd-l1的表达大大降低(图18)。tc1模型中相同标志物的分析揭示，tam的mhc ii类表达没有差异(图19a)。tam和肿瘤细胞的pd-l1表达显著降低，但幅度仍低于ct26模型，这与cd8

t细胞的pd-1

表达的差异幅度一致(图19c和19d)。这些数据表明，自发cd8

t细胞识别导致cd8
高
ct26 tme中强的ifnγ特征，其在ct26-b2m-/-tme中受损。另一方面，在cd8
低
tc1模型中，针对肿瘤细胞的自发免疫应答并因此ifnγ特征显然没有达到诱导tme发炎的必要阈值。出于这个原因，tme不受mhc i类丧失的影响，如同在cd8
高
模型中的情况那样。
[0528]
我们的最后一个目的是确认不存在由抗原识别cd8

t细胞释放的ifnγ是导致较少的抗肿瘤免疫细胞(cd8

t细胞、nk细胞和cdc1)在ct26和mc38肿瘤丧失mhc i类表达之后被吸引到ct26和mc38肿瘤的tme中的原因。如实施例1中所述用正常或衍生的b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(ct26：每组n＝3只小鼠，mc38：每组n＝5只小鼠)。肿瘤接种之后19天，将肿瘤切除并在液氮中速冻。使用rneasy微型试剂盒(qiagen，货号74106)根据制造商的说明从肿瘤中提取全部rna，并使用nanodrop 200c(thermo fisher)和fragment analyzer毛细管凝胶电泳仪(agilent advanced analytical)确定rna浓度和完整性。使用带有gdna eraser的primescript rt试剂盒(takara，货号rr047a)将每个样品1μg rna用作模板进行逆转录。在cfx384 touch实时pcr检测系统(biorad)上使用ssoadvanced universal sybr green supermix(biorad，货号1725271)根据制造商的说明利用40个循环的两步pcr将所得cdna用于定量实时pcr(qrt-pcr)分析，退火温度为60℃，反应体积为15μl(每个反应包括1.25μl cdna)，以及每种引物的最终引物浓度为333nm。使用cfx manager 3.1软件(biorad)确定ct值，并通过相对于hprt参考基因进行归一化计算δδct值以确定相对基因表达值。出于可靠性原因，使用截止值排除ct值＞35。引物序列：hprt正向引物(ccctggttaagcagtacagc)、hprt反向引物(ctcattatagtcaagggcatatcc)；ifng正向引物(ct26)(ttcttcagcaacagcaaggcg)；ifng反向引物(ct26)(tggaccactcggatgagct)；ifng正向引物(mc38)(gaggaactggcaaaaggatgg)、ifng反向引物(mc38)(gccttgctgttgctgaagaag)；cxcl9正向引物(gcaacaaaactgaaatcattgctac)、cxcl9反向引物(gtttttcatgttcttttgatgttttttcc)；cxcl10正向引物(gagtgggactcaagggatc)、cxcl10反向引物(ttctttttcatcgtggcaatgatctc)；cxcl11正向引物(gcgacaaagttgaagtgattgttac)、cxcl11反向引物(agtcagacgttcccaggatg)；ccl5正向引物(ggagtatttctacaccagcagc)、ccl5反向引物(cagaatcaagaaaccctctatcc)；xc11正向引物(atgggttgtggaaggtgtgg)、xcl1反向引物(ccatttggcttctggatcagc)。
[0529]
我们将b2m-/-肿瘤的ifng以及ifn诱导型趋化因子cxcl9、cxcl10和cxcl11(cxcr3
配体)的基因表达水平与相应对照肿瘤进行了比较。ifng的表达在两种肿瘤模型中均降低(图20a和图21a)。cxcr3配体(其对于将t细胞和nk细胞募集到tme中至关重要)的表达水平在两种肿瘤模型中同样降低(图20b、20c、20d和图21b、21c、21d)(nagarsheth等nat rev immunol 17,559-72(2017))。这些观察结果证实了最初为cd8
高
的mhc i类缺陷型肿瘤中的ifnγ特征降低。cd8

t细胞衍生的ifnγ对cxcr3配体的诱导解释了另外的cd3

t细胞和nk细胞向cd8
高
肿瘤的tme的持续吸引，这是mhc i类缺陷对应物所失去的。此外，cdc1吸引趋化因子ccl5和xcl1的表达水平降低(图20e、20f和图21e、21f)。已知nk细胞是这些趋化因子的主要产生者，并且其受损的浸润可能是趋化因子表达降低并因此cdc1浸润较低的原因(等cell 172,1022-37(2018))。
[0530]
我们的结果表明，肿瘤抗原的自发cd8

t细胞识别可以在一定程度上控制mhc i类表达肿瘤的生长并维持发炎tme，引发趋化因子诱导的连锁反应，从而吸引更多的抗肿瘤免疫细胞。总之，表明如果mhc i类丧失，则最初发炎肿瘤变得高度免疫抑制，这对tme产生不可预见的影响。
[0531]
实施例3：mhc i类丧失是针对免疫治疗和经典癌症治疗的抗性的综合机制
[0532]
在对未经处理的mhc i类缺陷型肿瘤模型进行表征之后，我们着手分析其对癌症治疗的抗性。我们通过测试ct26-b2m-/-和mc38-b2m-/-肿瘤对阻断pd-1和ctla4的icb抗体以及针对4-1bb的激动性抗体的抗性开始。如实施例1中所述用正常或b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(对于肿瘤生长，每组n＝10，对于流式细胞术，每组n＝5至7)，并在肿瘤的平均体积达到32mm3至36mm3之后第0天、第3天、第7天和第10天(mc38：第14天和第17天另外处理两次)腹膜内(i.p.)注射200μg抗pd-1(bioxcell，货号be0146)、抗ctla(bioxcell，货号be0164)或抗4-1bb(bioxcell，货号be0239)抗体。对照组注射不相关抗体(bioxcell，货号0089)。抗肿瘤效力被确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制。在第一次处理之后7天(抗4-1bb)或10天(抗pd1和抗ctla4)将ct26和ct26-b2m-/-肿瘤切除，并如实施例1中所述进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)染色。使用针对cd8(bd，货号563046)和cd45(bd，货号564279)的抗体。将细胞转移至绝对计数管中，并在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0533]
与对照组相比，测试处理引起ct26和mc38肿瘤的显著生长抑制(图22a和图24a)。经处理的ct26-b2m-/-和mc38-b2m-/-肿瘤以与对照组相似的动力学生长但未检测到显著的生长抑制(图22b和图24b)。不同处理之后cd8

t细胞浸润的分析显示，相对于对照组，经处理的ct26肿瘤中cd8

t细胞的数量增加(图23a和23b)，在抗ctla4或抗4-1bb处理之后达到统计学显著性。与此相比，在任何测试处理之后，ct26-b2m-/-中的cd8

t细胞数量都未增加。这些结果证实，mhc i类的丧失赋予了对基于抗体的免疫治疗的完全抗性，并且肿瘤内免疫应答限于表达功能性mhc i类的应答性肿瘤模型。
[0534]
我们随后测试了ct26-b2m-/-和tc1-b2m-/-肿瘤是否对治疗性rna疫苗接种产生抗性。如实施例1中所述用正常或b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(对于肿瘤生长，每组n＝10，对于流式细胞术，每组n＝5)。如kranz等(kranz,l.m.等nature 534,396
–
401(2016))所述，在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天和第19天用40μg编码gp70的rna-lpx(spsayahqf)对携带
ct26和ct26-b2m-/-的小鼠进行静脉内(i.v.)疫苗接种，并在肿瘤的平均体积达到约20mm3之后第0天和第7天用40μg编码e7的rna-lpx(rahynivtf)对携带ct1或ct1-b2m-/-的小鼠进行静脉内(i.v.)疫苗接种。e7是由tc1细胞表达的病毒cd8

t细胞抗原。另一些组用不相关rna-lpx(不编码任何抗原)进行疫苗接种，并且对照组不予处理。抗肿瘤效力被确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制。在第一次处理之后17天将ct26和ct26-b2m-/-肿瘤切除，在第一次处理之后9天将tc1和tc1-b2m-/-肿瘤切除，并如实施例1中所述进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)染色。使用针对cd8(bd，货号563046；或invitrogen，货号1825015)和cd45(bd，货号564279)，以及gp70四聚体(mb1，货号mbl-tb-m521-7)或e7 dextramer(immudex，货号ja2195-pe)的抗体。将细胞转移至绝对计数管中，并在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0535]
与对照组相比，用编码抗原的rna-lpx疫苗接种导致ct26和tc1肿瘤的显著生长抑制，而不相关rna-lpx未显著影响肿瘤生长(图25a和图27a)。用编码抗原的rna-lpx或不相关rna-lpx疫苗接种未抑制衍生的b2m-/-肿瘤的肿瘤生长(图25b和图27b)。cd8

t细胞浸润和抗原特异性的分析揭示了不相关rna-lpx在任何肿瘤模型中都没有显著影响(图26和图28)。用编码抗原的rna-lpx疫苗接种导致cd8

t细胞向b2m-/-和对照肿瘤的浸润显著增强。与提高的浸润相关，编码抗原的rna-lpx增强了b2m-/-和对照肿瘤二者中抗原特异性cd8

t细胞的频率。这表明疫苗接种引发和扩增cd8

t细胞，其浸润不同的肿瘤模型，即使它们是mhc i类阴性。尽管如此，抗原特异性cd8

t细胞的浸润并不影响mhc i类缺陷型肿瘤的生长，证实了它们对治疗性疫苗接种的抗性。
[0536]
最近的报告表明，免疫系统在对化学治疗或放射治疗(经典癌症治疗)的应答期间起重要作用(galluzzi等cancer cell 28,690-714(2015)，weichselbaum等nat rev clin oncol 14,365-379(2017))。我们假设通过mhc i类丧失使发炎的肿瘤沉默也可以影响经典癌症治疗的效力。为了检验这一假设，如实施例1中所述用ct26或ct26-b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(对于肿瘤生长，每组n＝9至10，对于流式细胞术，每组n＝5)。对于化学治疗，在肿瘤的平均体积达到约6mm3之后第0天、第7天和第14天，将小鼠用5mg/kg奥沙利铂(ox)(medac，medoxa)腹膜内注射(i.p.)并用60mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-fu)(medac，5-fu medac)静脉内注射(i.v.)。对照组接受载剂。对于放射治疗，在肿瘤的平均体积达到约30mm3之后，使用x-rad 320((precision x-ray instruments)用12gy对肿瘤进行局部照射。对照组不予处理。抗肿瘤效力被确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制和100天观察期期间的存活率。在第一次处理之后13天(化学治疗)或8天(放射治疗)将肿瘤切除，并如实施例1中所述进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)染色。使用针对cd8(bd，货号553031)和cd45(bd，货号564279)，以及gp70四聚体(mb1，货号mbl-tb-m521-7)的抗体。将细胞转移至绝对计数管中，并在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0537]
用化学治疗或放射治疗处理导致ct26以及ct26-b2m-/-肿瘤的生长显著抑制，这导
致所有处理组的存活率相比对照组显著提高(图29和图31)。在化学治疗或放射治疗之后，3/10(30％)携带ct26肿瘤的小鼠显示出完全应答，这引起肿瘤排斥和直至肿瘤接种之后100天的长期存活，而所有对照动物由于进展中肿瘤而必须处死。相比之下，携带ct26-b2m-/-肿瘤的小鼠在任何处理之后都未显示出完全应答，所有小鼠都必须在第100天之前处死。对ct26肿瘤中cd8

t细胞浸润和抗原特异性的分析揭示，cd8

t细胞在化学治疗或放射治疗之后与对照组相比数量趋于增加，并且在化学治疗之后gp70抗原特异性趋于更高(图30a和30c以及图32a和32c)。在ct26-b2m-/-肿瘤中观察到浸润性cd8

t细胞数量的相同趋势，并且在两种治疗之后，检测到浸润性cd8

t细胞的抗原特异性显著提高(图30b和30d以及图32b和32d)。这些数据表明，经典癌症治疗可以引发cd8

t细胞应答，其能够介导完全应答，导致mhc i类表达肿瘤的排斥。出于这个原因，mhc i类缺陷型肿瘤能够避免免疫介导的对经典癌症治疗的完全应答。
[0538]
实施例4：抗体和il2联合免疫治疗诱导tme中的炎症并导致针对mhc i类缺陷型肿瘤的治疗性免疫应答
[0539]
我们接下来试图确定能够对mhc i类缺陷型肿瘤产生治疗性免疫应答的治疗方案。适应性免疫系统优先通过mhc i类上呈递的抗原识别肿瘤细胞。由于mhc i缺陷型肿瘤不再可能实现这一点，因此有必要通过替代方式重新建立对肿瘤的抗原特异性识别。为了实现这一点，我们将方案基于与肿瘤相关抗原(taa)结合的抗体，以便将肿瘤细胞标记为外来物。先天免疫细胞(例如nk细胞或巨噬细胞)可以通过fcγ受体(fcγr)识别经抗体调理的肿瘤细胞，并通过抗体依赖性细胞毒性(adcc)或吞噬作用(adcp)以抗原特异性方式消除细胞。我们进一步假设，充当佐剂的第二化合物对于激活和许可具有fcγr的免疫细胞来消除肿瘤细胞是必要的。出于这个目的，我们选择了细胞因子il2，因为它是先天性和适应性免疫的有效激活剂。il2激活nk细胞并增强ifnγ产生(weigent等infect immun 41,992-7(1983))。作为继发作用，tme中nk细胞释放的ifnγ可以诱导数种趋化因子的表达，导致免疫细胞流入，并且还能够激活巨噬细胞作为有效的adcp效应细胞(shi等j immunol 194,4379-86(2015))。如实施例1中所述用b16f10和衍生的b2m-/-肿瘤细胞接种小鼠(每组n＝9至10)。在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天、第15天、第19天、第22天和第26天向小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg抗trp1抗体(ta99)或同种型对照，并在肿瘤接种之后第5天、第12天、第19天和第26天向小鼠静脉内(i.v.)注射1μg用(mirus，货号mir2255)配制的编码malb-mil2的rna或作为对照的编码malb(不编码任何细胞因子)的rna。malb-mil2是这样的融合蛋白，其中白蛋白与il2的n端连接，以延长il2的血清半衰期并通过增强的透过性和保留(epr)效应富集肿瘤中的蛋白质。该蛋白质在n1-甲基-假尿苷修饰的mrna上编码，这导致蛋白质在肝中高表达数天。对照组用同种型和malb rna进行处理。抗肿瘤效力被确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制和100天观察期期间的存活率。如实施例1中所述用b16f10-b2m-/-接种另外的小鼠(每组n＝7至8)，并在肿瘤接种之后9天开始如上所述的处理。在第一次处理之后11天切除肿瘤并如实施例1中所述消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用ef780(ebioscience，货号65-0865-14)、可固定黄色死细胞染色剂(life technologies，货号l34967)或可固定红色死细胞染色剂(life technologies，货号l34971)染色。使用针对cd3(biolegend，货号100227)、cd4(bd，货号564298)、cd8(bd，货号553031)、cd11b(bd，货号
553310)、cd11c(miltenyi，货号130-102-493)、cd25(bd，货号564023)、cd45(bd，货号564279)、cd103(ebioscience，货号12-1031-83)、f4/80(biolegend，货号123132和123146)、foxp3(ebioscience，货号12-5773-82)、fcγri(bd，货号740622)、fcγrii/iii(bd，货号558636)、fcγriv(bd，货号742564)、tcrγδ(bd，货号563993)、ly6c(bd，货号553104)、ly6g(bd，货号551461)、nk1.1(bd，货号108738)、siglecf(bd，货号565183)和xcr1(biolegend，货号148220)的抗体。将细胞转移至绝对计数管中并在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0540]
ta99或malb-mil2 rna单一治疗对b16f10肿瘤的肿瘤生长没有显著影响(图33a)。malb-mil2单一治疗显著抑制了b16f10-b2m-/-肿瘤的生长(图33b)。ta99和malb-mil2联合治疗显著抑制了b16f10和b16f10-b2m-/-肿瘤的生长。在两种肿瘤模型中，与对照组相比，肿瘤生长抑制在用ta99和malb-mil2治疗处理的小鼠的统计学存活率提高上得到反映(图34)。在对照组或malb-mil2单一治疗处理组中所有携带b16f10和b16f10-b2m-/-肿瘤的小鼠由于进展中的肿瘤而必须处死。ta99单一治疗导致b16f10模型中1/10小鼠(10％)和b16f10-b2m-/-模型中2/10小鼠(20％)完全肿瘤排斥和存活直至第100天。ta99和malb-mil2联合治疗在两种模型中均优于单一治疗，并且在b16f10模型中诱导3/10小鼠(30％)完全肿瘤排斥以及在b16f10-b2m-/-模型中诱导6/10小鼠(60％)完全肿瘤排斥。
[0541]
我们分析了单一治疗以及ta99和malb-mil2联合治疗之后b16f10-b2m-/-肿瘤中几个免疫细胞亚群的浸润，并将其与对照组进行比较。malb-mil2单一治疗显著增强了cd4

th细胞、treg细胞、cd8

t细胞、γδt细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和cd11b

dc的浸润(图35、图36、图37和图38)。cdc1、单核细胞和中性粒细胞略有增强，但并不统计学显著。ta99单一治疗对免疫浸润没有任何可检测的影响，而ta99和malb-mil2联合治疗之后的肿瘤浸润在所有情况下与malb-mil2单一治疗相似。此外，我们分析了单一治疗以及ta99和malb-mil2联合治疗之后巨噬细胞和单核细胞的fcγr表达，并将其与对照组进行比较。malb-mil2单一治疗而非ta99单一治疗增强了肿瘤内巨噬细胞和单核细胞对fcγri、fcγrii/iii和fcγrvi的表达(图39和图40)。与用malb-mil2单一治疗处理的组相比，经ta99和malb-mil2联合治疗处理的组中fcγr的表达较低，这可能是由于ta99诱导的fcγr内化。
[0542]
为了确定对mhc i类缺陷型肿瘤细胞的抗肿瘤作用重要的细胞类型，将小鼠(每组n＝8至15)用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种并如图33中所述在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天、第15天、第19天、第22天用抗trp1(ta99)抗体进行处理并在第5天、第12天和第19天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组接受同种型对照抗体和编码malb(不编码任何细胞因子)的rna。在肿瘤接种之后第4天以400μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对nk1.1(bioxcell，货号be0036)、csf1r(bioxcell，货号be0213)或ly6g(bioxcell，货号be0075-1)的耗竭抗体或不相关对照抗体(非耗竭)(bioxcell，货号be0089)，然后在肿瘤接种之后第7天、第11天、第14天、第18天和第20天注射200μg(不相关抗体、nk1.1或ly6g)或300μg(csf1r)的剂量。将注射耗竭抗体的组的存活率与接受不相关抗体的组的存活率进行比较，以确定免疫细胞耗竭之后治疗效果的差异。nk细胞和中性粒细胞的成功耗竭通过血液样品的流式细胞术分析得到证实，所述血液样品用针对cd3(biolegend，货号100227)、cd11b(bd，货号550993)、cd45(bd，货号564279)、ly6c(bd，货号553104)、ly6g(bd，货号
551461)和nk1.1(biolegend，货号108720)的抗体进行染色(如kranz等(kranz,l.m等nature 534,396
–
401(2016)所述进行染色)。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0543]
我们没有观察到nk细胞(nk1.1)、巨噬细胞(csf1r)或中性粒细胞(ly6g)的耗竭对用ta99和malb-mil2联合治疗处理的小鼠的存活率产生显著影响(图41)。然而，我们观察到巨噬细胞耗竭之后抗肿瘤作用趋于更弱，因为几只小鼠必须提前处死，相比于8/15(53.3％)，仅4/13(30.8％)存活直至第100天。必须注意，nk细胞和中性粒细胞的耗竭通过染色血样的流式细胞术分析得到证实(图42)。在该实验中未证实巨噬细胞的成功耗竭，并且存活率相当小的差异可能是由于不完全的巨噬细胞耗竭。出于这个原因，将重复实验并在稍后可以确认巨噬细胞完全耗竭之后处理。
[0544]
总之，我们确定抗taa抗体和il2联合治疗对于mhc i类缺陷型小鼠肿瘤模型是有效的处理。虽然抗体介导了对肿瘤细胞的抗原特异性免疫识别，但il2在tme中诱导炎症，这导致广泛多种免疫细胞流入。此外，能够通过adcp清除经调理的靶细胞的巨噬细胞和单核细胞响应于il2而强烈上调fcγr，表明il2允许先天免疫细胞用于抗体效应机制。联合治疗引起mhc i类缺陷型肿瘤的完全排斥。这是特别引人注目的发现，因为认为在鼠肿瘤模型中cd8

t细胞免疫在肿瘤靶向抗体并且尤其是抗体与il2的组合的抗肿瘤作用中发挥重要作用(park等cancer cell 18,160-70(2010)，yang等mol ther 21,91-100(2013)，zhu等cancer cell 27,489-501(2015)，kwan等j exp med 214,1679-90(2017))。尽管如此，我们的数据清楚地表明，抗体和il2联合治疗通过重新建立先天免疫细胞的抗原特异性肿瘤细胞识别以及诱导tme中炎症而对mhc i类缺陷型肿瘤出乎意料地适用。
[0545]
实施例5：经典癌症治疗通过抗体和il2联合免疫治疗增强对mhc i类缺陷型肿瘤的控制
[0546]
我们的最后一个目的是研究是否可以通过经典癌症治疗进一步增强对mhc i类缺陷型肿瘤的控制。将小鼠(每组n＝12至13)用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种并在肿瘤接种之后第6天用200mg/kg环磷酰胺(ctx)(baxter，endoxan)或作为对照的载剂腹膜内(i.p.)注射，然后如实施例4中所述在第7天、第10天、第14天、第17天和第21天用抗trp1(ta99)抗体进行处理或不处理，并在第7天、第14天和第21天用编码malb-mil2的rna进行处理或不处理。对照组用同种型对照抗体或编码malb(不编码任何细胞因子)的rna进行处理。抗肿瘤效力被确定为与用ctx单一治疗、ta99和malb-mil2联合治疗或对照处理的组相比用ctx和ta99与malb-mil2联合治疗处理的组中的肿瘤生长抑制。
[0547]
肿瘤生长的比较表明，通过用ctx处理、然后用ta99和malb-mil2联合治疗处理，肿瘤进展几乎完全被抑制(图43)。相对于ctx单一治疗或ta99和malb-mil2联合治疗，生长抑制显著改善。总之，经典癌症治疗与抗体和il2联合治疗很好地组合在一起，并产生对mhc i类缺陷型肿瘤的协同抗肿瘤控制。
[0548]
实施例6：抗体和il2联合免疫治疗针对ifn信号传导缺陷型肿瘤产生治疗性免疫应答
[0549]
除mhc i类丧失之外，ifn信号传导的缺陷是肿瘤逃避t细胞消除的另一种方式，并且经常在患者中观察到(gao等cell 167,397-404(2016))。我们的目标是确定适用于t细胞
抗性肿瘤而与特定的抗性机制无关的处理。出于这个原因，我们还研究了处理是否将对通过jak1突变而具有缺陷ifn信号传导途径的肿瘤有效。将小鼠(每组n＝10)用3
×
105b16f10-jak1-/-细胞皮下(s.c.)接种并如图33中所述在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天、第15天、第19天用抗trp1(ta99)抗体进行处理，并在第5天、第12天和第19天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组接受同种型对照抗体和编码malb(不编码任何细胞因子)的rna。
[0550]
ta99单一治疗而非malb-mil2 rna单一治疗显著延缓了b16f10-jak1-/-肿瘤的肿瘤生长，而ta99和malb-mil2联合治疗产生完全的肿瘤生长抑制(图44a)。肿瘤生长抑制反映在与对照组相比在用ta99单一治疗或ta99和malb-mil2联合治疗处理的小鼠的统计学存活率提高上(图44b)。对照组中2/10(20％)b16f10-jak1-/-肿瘤自发消退，malb-mil2单一治疗引起5/10(50％)肿瘤消退。ta99单一治疗导致8/10小鼠(80％)完全肿瘤排斥和存活直至第100天，ta99和malb-mil2联合治疗诱导10/10小鼠(100％)完全肿瘤排斥。总之，抗体和il2联合治疗引起针对ifn信号传导缺陷型肿瘤的治疗性免疫应答。总之，该处理方案是用于治疗通过mhc i类丧失或ifn信号传导受损而获得针对cd8

t细胞消除的抗性的肿瘤的通用方法。
[0551]
实施例7：抗体和il2联合免疫治疗需要巨噬细胞、cd8

t细胞和ifnγ
[0552]
鉴于如实施例4中所述巨噬细胞耗竭导致抗体和malb-mil2联合治疗的抗肿瘤作用趋于变弱，使用较高的抗体剂量建立了用于巨噬细胞耗竭的改进方案以验证这些结果。如实施例1中所述用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(n＝6)。在肿瘤接种之后第10天将针对csf1r的抗体(bioxcell，货号be0213)以600μg的剂量腹膜内(i.p.)注射到5只小鼠中，并在第12天注射350μg剂量，1只小鼠不予处理作为对照。在肿瘤接种之后13天切除肿瘤并如实施例1中所述进行消化。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用可固定黄色死细胞染色剂(life technologies，货号l34967)染色。使用针对cd11b(bd，货号553310)、cd45(bd，货号564279)、f4/80(biolegend，货号123132)和gr-1(biolegend，货号123132和123146)的抗体。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0553]
在未经处理的对照肿瘤中可观察到明显的cd11b

f4/80

巨噬细胞群，而抗csf1r的注射使得4/5小鼠中巨噬细胞群减少(图45)。因此，注射高剂量的抗csf1r能够在3天内耗竭巨噬细胞。
[0554]
为了利用改进的巨噬细胞耗竭方案获得有关巨噬细胞对抗体和malb-mil2联合治疗的重要性的有效数据并研究淋巴细胞的作用，将c57bl/6小鼠(每组n＝10至15)用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种并如图33中所述在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天、第15天和第19天用抗trp1(ta99)抗体进行处理，并在第5天、第12天和第19天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组不予处理。在肿瘤接种之后第3天以400μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对cd4(bioxcell，货号be0119)和cd90.2(bioxcell，货号be0066)的耗竭抗体或不相关对照抗体(非耗竭)(bioxcell，货号be0089)，然后在肿瘤接种之后第7天、第10天、第14天和第20天注射200μg剂量(第20天仅对照和抗cd4)。在肿瘤接种之后第2天以600μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对csf1r的抗体(bioxcell，货号be0213)，然后在肿
瘤接种之后第5天、第7天、第10天、第12天和第14天注射350μg剂量。将注射耗竭抗体的组的存活率与接受不相关抗体的组的存活率进行比较，以确定免疫细胞耗竭后治疗效果的差异。cd4

t细胞和总cd90.2

淋巴细胞的成功耗竭通过血液样品的流式细胞术分析得到证实，所述血液样品用针对cd4(bd，货号564298)、cd45(bd，货号564279)和cd90.2(bd，货号553003)的抗体进行染色(如kranz等(kranz,l.m等nature 534,396
–
401(2016)所述进行染色)。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0555]
在抗体和malb-mil2处理开始的时间点，在小鼠血液中证实了在注射抗cd4后cd4

t细胞成功耗竭，以及在注射抗cd90.2后总淋巴细胞成功耗竭(图46)。cd4

t细胞的耗竭不影响抗体和malb-mil2联合治疗的抗肿瘤活性，而总淋巴细胞耗竭后存活率的显著降低表明抗肿瘤作用必须需要淋巴细胞群(图47)。巨噬细胞的耗竭几乎完全抑制了抗肿瘤活性，并证实巨噬细胞对治疗活性至关重要。
[0556]
鉴于nk细胞或cd4

t细胞的耗竭不影响抗体和malb-mil2联合治疗的抗肿瘤活性，研究了cd8

t细胞是否是所需的淋巴细胞群。鉴于cd8

t细胞分泌的ifnγ将巨噬细胞极化为促炎、抗肿瘤表型(gubin等cell175(4),1014-30(2018))以及巨噬细胞的ifnγ活化通过adcp增强经抗体调理的肿瘤细胞的消除(shi等j immunol 194,4379-86(2015))，进一步询问ifnγ对于抗体和malb-mil2联合治疗针对mhc i类缺陷型肿瘤的抗肿瘤活性是否是需要的。将c57bl/6小鼠(每组n＝8至15)用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种并如图33中所述在肿瘤接种之后第5天、第8天、第12天、第15天和第19天用抗trp1(ta99)抗体进行处理，并在第5天、第12天和第19天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组不予处理。在肿瘤接种之后第3天以400μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对cd8的耗竭抗体(bioxcell，货号be0117)或针对ifnγ的中和抗体(bioxcell，货号be0055)或不相关对照抗体(非耗竭)(bioxcell，货号be0088)，然后在肿瘤接种之后第7天和第10天注射200μg抗cd8的剂量或者在第5天、第7天和第10天注射250μg对照抗体或抗ifnγ。将注射耗竭抗体的组的存活率与接受不相关抗体的组的存活率进行比较，以确定免疫细胞耗竭后治疗效果的差异。cd8

t细胞的成功耗竭通过血液样品的流式细胞术分析得到证实，所述血液样品用针对cd8(bd，货号553032)和cd45(bd，货号564279)的抗体进行染色(如kranz等(kranz,l.m等nature 534,396
–
401(2016)所述进行染色)。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0557]
在抗体和malb-mil2处理开始的时间点，在小鼠血液中证实了在注射抗cd8后cd8

t细胞成功耗竭(图48)。cd8

t细胞的耗竭或ifnγ的中和类似地抑制了抗体和malb-mil2治疗的抗肿瘤活性，表明cd8

t细胞是所需的淋巴细胞群，并表明这些细胞通过分泌ifnγ起作用(图49)。
[0558]
下一个目的是分析在用抗体和malb-mil2联合治疗处理后是否发生巨噬细胞的促炎极化，并确认巨噬细胞、cd8

t细胞和ifnγ之间的直接关系。将c57bl/6小鼠(每组n＝7至8)用3
×
105b16f10-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种并如图33中所述在肿瘤接种之后第9天、第12天和第16天用抗trp1(ta99)抗体进行处理，并在第9天和第16天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组接受同种型对照抗体和编码malb(不编码任何细胞因子)的rna。在第一次处理之后11天切除肿瘤。在第二实验中，将c57bl/6小鼠(每组n＝15)以相同的方式接种和
处理，并另外在肿瘤接种之后第7天以400μg的负荷剂量腹膜内(i.p.)注射针对cd8的耗竭抗体(bioxcell，货号be0117)或针对ifnγ的中和抗体(bioxcell，货号be0055)或不相关对照抗体(非耗竭)(bioxcell，货号be0088)，然后在肿瘤接种之后第11天和第14天注射200μg抗cd8或者在第9天、第11天和第14天注射250μg对照抗体或抗ifnγ。第一次处理之后9天切除肿瘤。如实施例1中所述消化所有肿瘤。如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述将样品处理成单细胞悬液并染色。将死细胞用可固定黄色死细胞染色剂(life technologies，货号l34967)染色。使用针对cd11b(bd，货号562127)、cd45(bd，货号564279)、cd206(biolegend，货号141720)、gr-1(biolegend，货号108423)、f4/80(biolegend，货号123132)和mhc ii(bd，货号551799)的抗体。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。
[0559]
为了确定肿瘤浸润巨噬细胞的促炎状态，通过流式细胞术定量促炎m1样巨噬细胞(mhc ii
高
，cd206
低
)和抗炎m2样巨噬细胞(mhc ii
低
，cd206
高
)的比例，并计算m1/m2比。单一的抗体治疗未显著改变m1/m2比，而malb-mil2单一治疗或与ta99组合显著提高了m1/m2比，表明巨噬细胞室的促炎重塑(图50a)。巨噬细胞的促炎极化在cd8

t细胞耗竭或ifnγ中和后同样被消除，表明cd8

t细胞和ifnγ响应于malb-mil2而塑造巨噬细胞表型，并突出了cd8

t细胞的显著性最可能依赖于ifnγ的产生，而不是直接肿瘤细胞消除(图50b)。
[0560]
总之，这些结果突出了cd8

t细胞在控制肿瘤通过缺乏mhc i类避免直接t细胞识别中的先前未认识到的作用。鉴于巨噬细胞是唯一被确定为对于抗体和malb-mil2治疗的治疗活性必不可少的表达fcγr的细胞类型的事实，它们最有可能负责消除经抗体调理的肿瘤细胞。cd8

t细胞通过ifnγ激活巨噬细胞，以使它们能够有效消除肿瘤细胞。
[0561]
实施例8：抗体和malb-mil2治疗在icb进程期间阻止获得性抗性
[0562]
由于逃避t细胞识别的最初少量mhc i类缺陷型肿瘤细胞克隆的过度生长导致产生获得性抗性，因此大部分经icb治疗的肿瘤患者在最初的疾病控制之后经历复发(schoenfeld等cancer cell 37(4),443-55(2020))(zaretsky等.n engl j med 375,819-29(2016))。为了模拟获得性抗性，将c57bl/6小鼠(每组n＝15)用3
×
105含有75％b16f10和25％b16f10-b2m-/-细胞的混合物的细胞皮下(s.c.)接种。如图33中所述在肿瘤接种之后第3天、第7天、第10天、第14天和第17天用抗trp1(ta99)抗体对小鼠进行处理，并在第3天、第10天和第17天用编码malb-mil2的rna进行处理。同种型抗体和编码malb(不编码任何细胞因子)的rna用作对照。另外在第3天、第7天、第10天、第14天和第17天向小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg抗pd-1(bioxcell，货号be0146)，与在第3天以200μg的负荷剂量，然后在第7天、第10天、第14天和第17天以100μg的剂量注射抗ctla4(bioxcell，货号be0131)组合。同种型抗体(bioxcell，货号be0089和be0087)充当对照。将接受抗pd-1和抗ctla4的组的存活率与接受抗pd-1、抗ctla4、ta99和malb-mil2的组进行比较，以确定添加肿瘤结合抗体和malb-mil2是否增强icb的抗肿瘤活性。当小鼠达到终点标准时将肿瘤切除并如实施例1中所述进行消化。如实施例1中所述将样品处理成单细胞悬液并在用ifnγ刺激单细胞悬液之后如grunwitz等(grunwitz,c.等oncoimmunology 8,在线出版(2019))所述进行染色。将死细胞用可固定黄色死细胞染色剂(life technologies，货号l34967)染色。使用针对cd45(bd，货号564279)、h2-kb(bd，货号553570)和h2-db(bd，货号553574)的抗体。在bd lsrfortessa
tm
流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件10版本(treestar)分析所获得的数据。比较不同组中mhc i类阳性肿瘤细胞的分数，以确定icb是否导致抗性mhc i类缺陷型细胞的阳性选择，以及抗体和malb-mil2联合治疗是否能够阻止阳性选择。
[0563]
抗pd-1和抗ctla4 icb引起肿瘤生长延迟，随后80％(12/15)小鼠出现肿瘤过度生长，而20％(3/15)小鼠排斥肿瘤，这可能是由于mhc i类缺陷细胞的旁观者消除(spiotto等nat med 10(3),294-8(2004))(图51)。不具有icb的ta99和malb-mil2治疗导致33.3％(5/15)的肿瘤排斥，而ta99和malb-mil2与icb的组合导致更好的肿瘤排斥，鉴于60％(9/15)小鼠在观察期结束时无肿瘤。这反映在与仅使用icb处理的组相比显著提高的生存率上。
[0564]
对肿瘤中mhc i类阳性肿瘤细胞比例的分析表明，仅用对照处理的组中肿瘤细胞比例保持稳定，而icb导致mhc i类缺陷型肿瘤细胞高度显著富集。这表明t细胞敏感性肿瘤细胞选择性耗竭，随后icb抗性肿瘤细胞过度生长，导致获得性抗性和肿瘤复发。ta99和malb-mil2的添加完全阻止了mhc i类缺陷型细胞的选择性富集。
[0565]
总之，向icb添加抗体和malb-mil2联合治疗能够通过在诱导mhc i类依赖性t细胞应答的免疫治疗进程期间破坏t细胞抗性肿瘤细胞的选择优势来阻止获得性抗性的出现。
[0566]
实施例9：抗体和malb-mil2联合免疫治疗针对mc38-her2-b2m-/-肿瘤有效并恢复mhc i类缺陷型肿瘤对经典癌症治疗的完全应答
[0567]
为了研究抗体和malb-mil2治疗针对第二mhc i类缺陷型肿瘤模型的效力，如beissert等(beissert等mol ther 28(1),119-28(2019))所述，使用含有在ef1a启动子控制下的编码大鼠her2/neu的基因的慢病毒载体(由geneart,thermo fisher scientific合成)转导mc38-b2m-/-。将经转导的细胞在含有4μg/ml杀稻瘟素的培养基中于37℃和5％co2下培养1周，随后如实施例1中所述获得单克隆并通过流式细胞术针对her2表达筛选。将her2阳性克隆在没有杀稻瘟素的6孔板中于37℃和5％co2下培养4周，并筛选her2表达。将显示转基因稳定整合的一个克隆表示为mc38-her2-b2m-/-并用于进一步研究(图53)。
[0568]
为了测试mc38-her2-b2m-/-是否对抗体和malb-mil2联合治疗有应答，用5
×
105mc38-her2-b2m-/-细胞皮下(s.c.)接种c57bl/6小鼠(每组n＝10)。在肿瘤接种之后第3天、第6天、第10天、第13天、第17天和第24天向小鼠腹膜内(i.p.)注射200μg抗her2抗体(7.16.4)(bioxcell，货号be0277)或同种型对照(bioxcell，货号be0085)，并在第3天、第10天、第17天和第24天如图33中所述腹膜内(i.p.)注射编码malb-mil2的rna。抗肿瘤效力被确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制和100天观察期期间的存活率。
[0569]
用7.16.4或malb-mil2作为单一治疗和联合治疗处理显著抑制了肿瘤的生长(图54a)。用7.16.4处理未诱导肿瘤排斥，而在单一治疗中10％(1/10)经malb-mil2处理的小鼠排斥肿瘤。50％(5/10)经抗体和malb-mil2联合治疗处理的小鼠排斥肿瘤并保持无肿瘤直至实验结束，与接受malb-mil2单一治疗的组相比，这产生显著提高的生存率(图54b)。
[0570]
鉴于使用抗体和malb-mil2联合治疗可有效靶向mc38-her2-b2m-/-肿瘤，我们询问了该处理是否能够在该肿瘤模型中恢复对化学治疗的完全应答。首先，为了确定mc38-b2m-/-对化学治疗的抗性，如实施例1中所述将小鼠用mc38(每组n＝15)或mc38-b2m-/-(每组n＝10)接种，并在肿瘤接种之后第4天、第11天和第18天如图29中所述注射ox。对照组接受载剂。抗肿瘤效力被确定为在100天观察期期间测试组相比对照组的存活率。
[0571]
化学治疗显著提高了携带mc38或mc38-b2m-/-肿瘤的小鼠的存活率(图55)。所有mc38-b2m-/-肿瘤最终都有进展，而化学治疗使mc38肿瘤的排斥率从对照组中的13.3％(2/15)翻倍至26.7％(4/15)，表明mc38肿瘤对化学治疗的完全应答需要功能性mhc i类表达。
[0572]
为了分析添加抗体和malb-mil2联合治疗是否能够重新实现对化学治疗的完全应答，将小鼠(每组n＝15)用mc38-her2-b2m-/-细胞接种，并如图29中所述在肿瘤接种之后第4天、第11天和第18天注射ox，并如图54中所述在第5天、第8天、第12天、第15天和第19天用抗her2(7.16.4)抗体进行处理，并在第7天、第14天和第21天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组用载剂、同种型对照抗体或编码malb(不编码任何细胞因子)的rna进行处理。抗肿瘤效力被确定为经ox以及7.16.4和malb-mil2联合治疗处理的组相比经ox单一治疗或7.16.4和malb-mil2联合治疗处理的组的存活率。
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在治疗进程期间，100％(15/15)经ox单一治疗或经7.16.4和malb-mil2联合治疗处理的肿瘤有进展(图56)。向ox添加7.16.4和malb-mil2能够实现53.3％(8/15)肿瘤排斥，并且与其他处理组相比，产生显著提高的存活率。
[0574]
总之，使用不同的抗体靶标在第二肿瘤模型中验证了mhc i类缺陷型肿瘤的有效靶向。在第二模型中进一步证实，mhc i类缺陷导致肿瘤对由经典癌症治疗诱导的完全应答产生抗性。向经典癌症治疗中添加抗体和malb-mil2能够重新实现完全应答并产生协同肿瘤控制，突出了这种方法的适用性。
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实施例10：经典癌症治疗通过抗体和il2联合免疫治疗增强了对ifn信号传导缺陷型肿瘤的控制
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此外还研究了经典癌症治疗以及抗体和malb-mil2联合治疗对ifn信号传导缺陷型肿瘤的协同活性。将小鼠(每组n＝14至15)用5
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105b16f10-jak1-/-细胞皮下(s.c.)接种，并在肿瘤接种之后第7天如实施例5中所述用150mg/kg ctx进行处理，如实施例4中所述在肿瘤接种之后第8天、第11天、第15天、18天和第22天用抗trp1(ta99)抗体进行处理，并在第8天、第15天和第22天用编码malb-mil2的rna进行处理。对照组用载剂、同种型对照抗体或编码malb(不编码任何细胞因子)的rna进行处理。抗肿瘤效力被确定为经ctx以及ta99和malb-mil2联合治疗处理的组相比经ctx单一治疗或ta99和malb-mil2联合治疗处理的组的存活率。
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ctx诱导肿瘤生长延迟并导致6.7％(1/15)肿瘤排斥，而ta99和malb-mil2联合治疗诱导69.2％(9/15)肿瘤排斥(图57)。ctx使肿瘤致敏而在经ta99和malb-mil2治疗后排斥更加优异，这将肿瘤排斥率提高到86.7％(13/15)。总之，经典癌症治疗改善了对经抗体和malb-mil2联合治疗处理的ifn信号传导缺陷型肿瘤的控制。