一种富马酸二甲酯中L-苹果酸二甲酯含量的检测方法与流程

一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯含量的检测方法
技术领域
1.本发明涉及检测方法领域，特别是涉及一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯含量的检测方法。


背景技术：

2.富马酸二甲酯肠溶胶囊是目前治疗多发性硬化症的药物。多发性硬化症青壮年为多发群体，并且多发性硬化症为一类复杂、慢性、免疫失调性的病变，具有复发性、致残性等特点，临床上主要表现有视神经炎导致的视力下降，极度疲劳，肢体麻木，行走困难，性功能障碍等症状，富马酸二甲酯肠溶胶囊由fumapharm公司开发，目前国内外市场对富马酸二甲酯肠溶胶囊需求大。
3.在本品中，l-苹果酸二甲酯是由l-苹果酸与甲醇反应生成，l-苹果酸由富马酸引入，且富马酸、甲醇均作为富马酸二甲酯生产的起始物料，因此在富马酸二甲酯中可能会残留l-苹果酸二甲酯，根据中国药典与ich指导原则，需要将其控制在规定的限度内，保证用药安全。故而为保证终产品的质量，本公司将对富马酸二甲酯中可能残留的l-苹果酸二甲酯进行研究。
4.在现有技术中，根据l-苹果酸二甲酯沸点低与紫外吸收弱的化学特性，需要开发一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯含量的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯杂质含量的检测方法，能准确确定富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯的含量，具有专属性、灵敏度高、准确度高、方法稳定。
6.本发明提供的一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯杂质含量的检测方法，它包括如下步骤：
7.(1)取l-苹果酸二甲酯杂质的对照品，制备对照品溶液；
8.(2)取待测富马酸二甲酯样品，制备供试品溶液；
9.(3)采用gc方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测，所述gc方法的检测条件为：
10.色谱柱：(6％)氰丙基苯基-(94％)二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管；
11.色谱柱温度：起始温度：75～85℃，保持1～3min，以18～22℃/min的速率升至
12.235～245℃，保持3～7min；
13.检测器：氢火焰离子化检测器，温度为240℃～260℃；
14.进样口温度：190℃～210℃；
15.进样体积：1～5μl；
16.载气：高纯氮气，流速为2.5ml/min～3.5ml/min，分流比：(5～15):1；
17.(4)按外标法以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到富
马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯杂质含量。
18.进一步地，配制对照品溶液及供试品溶液所用的稀释剂为乙腈。其中，l-苹果酸二甲酯对照品溶液的浓度优选为30～50μg/ml；富马酸二甲酯供试品溶液的浓度优选为30～50mg/ml；更优选的，l-苹果酸二甲酯对照品溶液的浓度为40μg/ml，富马酸二甲酯供试品溶液的浓度为40mg/ml。
19.进一步地，气相色谱的条件为：色谱柱温度：起始温度：75～85℃，保持2min，以20℃/min的速率升至240℃，保持5min。
20.进一步地，氢火焰离子化检测器的温度为250℃。
21.进一步地，进样口温度为200℃。
22.进一步地，载气分流比为10:1。
23.进一步地，色谱柱为agilent db-624毛细管柱，规格为30m
×
0.53mm
×
3.0μm。
24.进一步地，所述色谱柱的起始温度为80℃。
25.进一步地，所述载气流速为3.0ml/min。
26.进一步地，所述进样体积为1μl。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明通过对色谱条件的选择及空白、对照品溶液和供试品溶液制备方法的实验，提供了一种能够准确定量富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯的含量气相分析方法。同时对建立的检测方法进行验证，验证结果表明，该方法灵敏度高、准确度高、专属性强、重复性良好、方法稳定，通过对可能残留的l-苹果酸二甲酯的控制，确保富马酸二甲酯作原料药的安全性，从而进一步保证富马酸二甲酯肠溶胶囊的安全性，降低用药风险。
附图说明
29.图1为实施例1检测条件下溶剂的gc图。
30.图2为实施例1检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
31.图3为实施例1检测条件下供试品溶液的gc图。
32.图4为实施例1检测条件下供试品混合溶液的gc图。
33.图5为对比例1检测条件下溶剂的gc图。
34.图6为对比例1检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
35.图7为对比例2检测条件下溶剂的gc图谱。
36.图8为对比例2检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
37.图9为对比例3检测条件下溶剂的gc图谱。
38.图10为对比例3检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
39.图11为对比例4检测条件下溶剂的gc图谱。
40.图12为对比例4检测条件下供试品混合溶液的gc图。
41.图13为对比例5检测条件下溶剂的gc图谱。
42.图14为对比例5检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
43.图15为对比例6检测条件下溶剂的gc图谱
44.图16为对比例6检测条件下杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
45.图17为实施例2检测条件下分流比5:1时溶剂的gc图谱。
46.图18为实施例2检测条件下分流比5:1时杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
47.图19为实施例2检测条件下分流比5:1时供试品混合溶液的gc图。
48.图20为实施例2检测条件下分流比15:1时溶剂的gc图。
49.图21为实施例2检测条件下分流比15:1时杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
50.图22为实施例2检测条件下分流比15:1时供试品混合溶液的gc图。
51.图23为实施例3检测条件下流速2.5ml/min时溶剂的gc图。
52.图24为实施例3检测条件下流速2.5ml/min时杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
53.图25为实施例3检测条件下流速2.5ml/min时供试品混合溶液的gc图。
54.图26为实施例3检测条件下流速3.5ml/min时溶剂的gc图谱。
55.图27为实施例3检测条件下流速3.5ml/min时杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图。
56.图28为实施例3检测条件下流速3.5ml/min时供试品混合溶液的gc图。
57.图29为l-苹果酸二甲酯对照品的线性方程。
具体实施方式
58.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品或自制获得。
59.l-苹果酸二甲酯批号为d1911002，含量为99.08％，来源于pcl公司；
60.富马酸二甲酯批号为20180801批，来源于成都百裕制药股份有限公司。
61.xp6百万分之一天平可购自梅特勒公司；auw220d十万分之一天平可购自梅特勒公司；xse205du十万分之一天平可购自梅特勒公司；agilent 7890b气相色谱仪可购自安捷伦公司；色谱柱为agilent db-624毛细管柱30m
×
0.53mm
×
3.0μm可购自安捷伦公司。
62.实施例1、本发明检测富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯含量的气相色谱方法
63.色谱柱：agilent db-624毛细管柱30m
×
0.53mm
×
3.0μm；
64.气相色谱条件：
65.色谱柱温度：起始温度：80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至240℃，保持5min；
66.检测器：氢火焰离子化检测器，温度为250℃；
67.进样口温度：200℃；
68.载气：高纯氮气，流速为3.0ml/min，分流比为10：1；
69.进样体积为1μl；
70.稀释剂为乙腈。
71.取l-苹果酸二甲酯对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每ml约为40μg的对照品溶液，作为杂质l-苹果酸二甲酯的定位溶液。
72.取待测富马酸二甲酯样品适量，加乙腈溶解并稀释制成每ml约为40mg的溶液，作为供试品溶液。
73.取富马酸二甲酯样品与l-苹果酸二甲酯对照品溶液适量，精密称定，加乙腈超声溶解并稀释制成每1ml约含富马酸二甲酯40mg和l-苹果酸二甲酯40μg的混合溶液，作为供
试品混合溶液。
74.测定法：取溶剂、对照品溶液、供试品溶液与供试品混合溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图1-4。
75.图1为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
76.图2为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间为8.787min。
77.图3为供试品溶液的gc图，富马酸二甲酯的保留时间为7.691min。
78.图4为供试品混合溶液的gc图，混合溶液中杂质l-苹果酸二甲酯的保留时间为8.784min。
79.结果表明，本发明色谱条件下，空白溶剂与供试品溶液不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，l-苹果酸二甲酯色谱峰峰形良好，理论塔板数高，出峰时间适宜，适合本品l-苹果酸二甲酯的检测。
80.对比例1
81.色谱柱：同实施例1；
82.气相色谱条件：
83.色谱柱温度：起始温度：80℃，保持8min，以20℃/min的速率升至240℃，保持5min；
84.检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1。
85.按实施例1所述方法制备对照品溶液。
86.测定法：取溶剂、对照品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图5-6。
87.图5为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
88.图6为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间约14.680min。
89.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，l-苹果酸二甲酯色谱峰峰形良好，但出峰时间较晚(约14.7min)，因此拟优化升温程序，加快l-苹果酸二甲酯出峰。
90.对比例2
91.色谱柱：hp-5毛细管柱30m
×
0.32mm
×
0.25μm；
92.气相色谱条件：色谱柱温度、检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1
93.按实施例1所述方法制备对照品溶液。
94.图7为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
95.图8为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间约1.877min。
96.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，但l-苹果酸二甲酯色谱峰出峰时间较快(1.877min)，且峰型前沿，故该色谱柱不适用l-苹果酸二甲酯。
97.对比例3
98.色谱柱：db-wax毛细管柱30m
×
0.25mm
×
0.25μm；
99.气相色谱条件：色谱柱温度、检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1
100.按实施例1所述方法制备对照品溶液。
101.图9为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
102.图10为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间约5.782min。
103.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，但l-苹果酸二甲酯色谱峰出峰时间适宜，但峰型拖尾，故该色谱柱不适用l-苹果酸二甲酯。
104.对比例4
105.色谱柱：同实施例1；
106.气相色谱条件：
107.色谱柱温度：起始温度：120℃，保持2min，以10℃/min的速率升至160℃，再以20℃的速率升至200℃，保持20min；
108.检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1。
109.按实施例1所述方法制备供试品混合溶液。
110.测定法：取溶剂、供试品混合溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图11-12。
111.图11为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
112.图12为供试品混合溶液的gc图，l-苹果酸二甲酯保留时间约1.726min。
113.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，l-苹果酸二甲酯在该条件下出峰太快，且l-苹果酸二甲酯在该色谱条件下与主峰分离度为2.90未达到3.0，故该色谱条件不适用l-苹果酸二甲酯。
114.对比例5
115.色谱柱：同实施例1；
116.气相色谱条件：
117.色谱柱温度：起始温度：40℃，保持2min，以7℃/min的速率升至150℃，再以6℃/min的速率升至250℃，保持5min；
118.检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1。
119.按实施例1所述方法制备对照品溶液。
120.测定法：取溶剂、对照品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图13-14。
121.图13为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
122.图14为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间为21.327min。
123.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，l-苹果酸二甲酯色谱峰峰形拖尾，且出峰时间较晚约21.3min，因此该色谱条件不适用l-苹果酸二甲酯。
124.对比例6
125.色谱柱：同实施例1；
126.气相色谱条件：
127.色谱柱温度：起始温度：30℃，保持2min，以4℃/min的速率升至70℃，再以20℃/min的速率升至250℃；
128.检测器、进样口温度、载气、流速、分流比、进样体积、稀释剂均同实施例1。
129.按实施例1所述方法制备对照品溶液。
130.测定法：取溶剂、对照品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图15～16。
131.图15为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下不干扰杂质与主峰的检出。
132.图16为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液的gc图，保留时间为19.171min。
133.结果表明，本发明色谱条件下，空白不干扰l-苹果酸二甲酯的出峰，l-苹果酸二甲酯色谱峰峰形拖尾，且出峰时间较晚约19.2min，因此该色谱条件不适用l-苹果酸二甲酯。
134.实施例2：
135.色谱柱、色谱柱温度、检测器、进样口温度、进样体积、稀释剂均同实施例1。
136.载气：高纯氮气，流速为3.0ml/min，分流比为5：1以及15:1；
137.按实施例1所述方法制备杂质l-苹果酸二甲酯的对照品溶液和供试品混合溶液。
138.测定法：取溶剂、对照品溶液与供试品混合溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图17～22。
139.图17为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下(分流比5:1)不干扰杂质与主峰的检出。
140.图18为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液在该色谱条件下(分流比5:1)的gc图，保留时间为8.764min。
141.图19为供试品混合溶液的gc图，混合溶液中杂质l-苹果酸二甲酯在该色谱条件下(分流比5:1)的保留时间为8.762min。
142.图20为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下(分流比15:1)不干扰杂质与主峰的检出。
143.图21为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液在该色谱条件下(分流比15:1)的gc图，保留时间为8.765min。
144.图22为供试品混合溶液的gc图，混合溶液中杂质l-苹果酸二甲酯在该色谱条件下(分流比15:1)的保留时间为8.763min。
145.结果表明，该色谱条件在分流比5:1～15:1范围内，供试品检出的l-苹果酸二甲酯和l-苹果酸二甲酯对照品溶液保留时间一致，供试品中检出的l-苹果酸二甲酯含量一致，该方法在分流比5：1～15:1范围内耐用性良好。
146.实施例3：
147.色谱柱、色谱柱温度、检测器、进样口温度、进样体积、稀释剂均同实施例1.
148.载气：高纯氮气，流速为2.5ml/min和3.5ml/min，分流比为10:1；
149.按实施例1所述方法制备对照品溶液、供试品混合溶液。
150.测定法：取溶剂、对照品溶液与供试品混合溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图23-28。
151.图23为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下(流速2.5ml/min)不干扰杂质与主峰的检出。
152.图24为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液在该色谱条件下(流速2.5ml/min)的gc图，保留时间为9.217min。
153.图25为供试品混合溶液的gc图，混合溶液中杂质l-苹果酸二甲酯在该色谱条件下(流速2.5ml/min)的保留时间为9.216min。
154.图26为溶剂的gc图谱，溶剂在该色谱条件下(流速3.5ml/min)不干扰杂质与主峰的检出。
155.图27为杂质l-苹果酸二甲酯对照品溶液在该色谱条件下(流速3.5ml/min)的gc图，保留时间为8.413min。
156.图28为供试品混合溶液的gc图，混合溶液中杂质l-苹果酸二甲酯在该色谱条件下(流速3.5ml/min)的保留时间为8.411min。
157.结果表明，该色谱条件在流速2.5ml/min～3.5ml/min范围内，供试品检出的l-苹果酸二甲酯和l-苹果酸二甲酯对照品溶液保留时间一致，供试品中检出的l-苹果酸二甲酯含量一致，该方法在流速2.5ml/min～3.5ml/min范围内耐用性良好。
158.系统适用性实验
159.本实施例中各种试验均采用如下条件：
160.色谱柱：agilent db-624毛细管柱30m
×
0.53mm
×
3.0μm；
161.气相色谱条件：
162.色谱柱温度：起始温度：80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至240℃，保持5min；
163.检测器：氢火焰离子化检测器，温度为250℃；
164.进样口温度：200℃；
165.载气：高纯氮气，流速为3.0ml/min，分流比为10:1；
166.进样体积为1μl；
167.稀释剂为乙腈。
168.按照实施例1所述方法制备对照品溶液、供试品溶液。
169.1、专属性
170.测定法：取溶剂、对照品溶液与供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图1-3。
171.结果表明，本发明色谱条件下，空白溶剂与供试品溶液对l-苹果酸二甲酯的检出无干扰，该方法专属性良好。
172.2、标准曲线与范围
173.取l-苹果酸二甲酯对照品各适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密量取不同浓度的对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，计算线性回归方程及相关系数r。结果见表1及图29。
174.表1：标准曲线
[0175][0176]
结果表明，本发明检测方法中l-苹果酸二甲酯的浓度在2.12μg/ml～105.82g/ml
范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：y＝0.4978x-0.5385，r＝0.9997，证明本发明方法线性范围广，准确度高。
[0177]
3、进样精密度试验
[0178]
取实施例1所述的对照品溶液，精密量取1μl，注入气相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，结果见表2。
[0179]
表2进样精密-峰面积及保留时间考察结果
[0180][0181]
结果表明，各l-苹果酸二甲酯的峰面积与保留时间的rsd均小于2.0％，证明本发明的检测方法精密度优异。
[0182]
4、定量限与检测限
[0183]
取l-苹果酸二甲酯对照品线性低浓度溶液，以3倍信噪比作为检测限。结果见表3。
[0184]
表3检测限试验结果
[0185]
浓度(μg/ml)最小检测限(ng)相当于主成分百分比(％)1.061.060.003
[0186]
取l-苹果酸二甲酯对照品线性低浓度溶液，以10倍信噪比作为定量限。结果见表4。
[0187]
表4定量限试验结果
[0188]
浓度(μg/ml)最小定量限(ng)相当于主成分百分比(％)2.122.120.005
[0189]
以上结果表明，本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足含量测定要求。
[0190]
5、重复性试验
[0191]
取富马酸二甲酯适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每ml约40mg的溶液，作为重复性样品溶液，平行6份。
[0192]
精密量取1μl对照品溶液和重复性样品溶液，按本发明的检测方法进行检测，l-苹果酸二甲酯外标法以峰面积计算杂质的含量结果见表5。
[0193]
表5重复性试验结果
[0194][0195]
由以上结果可知，本发明检测方法，平行配制的6份样品，均未检出l-苹果酸二甲酯，重复性良好。
[0196]
6、溶液稳定性
[0197]
取对照品溶液与供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、20h、24h精密量取1μ，注入气相色谱仪，记录色谱图，考察对照品溶液与供试品溶液的稳定性。结果见表6。
[0198]
表6溶液稳定性试验-对照品溶液峰面积考察
[0199][0200]
结论：本品供试品溶液与对照品溶液在室温自然光条件下放置24h，l-苹果酸二甲酯峰面积与保留时间rsd均小于2.0％，表明本品供试品溶液与对照品溶液在室温条件下放置24小时稳定。
[0201]
7、准确度试验
[0202]
取l-苹果酸二甲酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每ml约100μg的溶液，作为对照品储备液。
[0203]
取l-苹果酸二甲酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每ml约40μg的溶液，作为对照品溶液。
[0204]
精密称取富马酸二甲酯约30mg，置于100ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为回收率样品，平行6份，作为回收供试品溶液。
[0205]
上述溶液精密量取1μl，按本发明的检测方法进行检测，记录图谱，计算l-苹果酸二甲酯的测得量、对照品加入量及回收率。结果见表7。
[0206]
计算公式：
[0207][0208]
式中：a为供试品中所含l-苹果酸二甲酯的量，μg；
[0209]
b为l-苹果酸二甲酯对照品加入量，μg；
[0210]
c为l-苹果酸二甲酯测得量，μg。
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表7l-苹果酸二甲酯回收率结果(n＝6)
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结果表明，本发明检测方法，结果显示，该方法测得本品100％浓度6份样品回收率结果均在103.0％～106.0％范围内，且6份样品回收率结果rsd均小于2.0％，准确度良好。
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综上所述，本发明提供了一种富马酸二甲酯中l-苹果酸二甲酯含量测定的气相色谱方法，溶剂、富马酸二甲酯均不干扰l-苹果酸二甲酯的检测；同时，本发明方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控富马酸二甲酯提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了终产品富马酸二甲酯肠溶胶囊药物的安全性。